基于葉綠體全基因組的云南櫻花品種‘紅霞’的種系分析

顏成敏 鄭偉 徐曉丹

摘 要： 云南櫻花品種‘紅霞（Cerasus ‘Hongxia）廣泛種植于滇中地區(qū)，3月開花，半重瓣至重瓣，粉紅色，觀賞價值較高?！t霞曾被認為是紅花高盆櫻（C. cerasoides var. rubea）的園藝品種，而其分子標記結果卻聚在鐘花櫻（C. campanulata）種系，可見‘紅霞的種系歸屬存疑，對今后的育種及栽培極為不利。為探索‘紅霞的種系問題，該研究以‘紅霞的葉片DNA為材料，應用Illumina軟件對葉綠體基因組特征進行測序，通過SPAdes 3.13.0、Gapcloser 1.12 和CPGAVAS2 2.0軟件進行組裝、注釋，之后使用MISA和Geneious 10.0軟件對葉綠體基因組特征進行分析，并使用RAxML 8.0軟件構建Cerasus 分支系統(tǒng)發(fā)育樹，分析‘紅霞在櫻屬植物的系統(tǒng)關系。結果表明： （1）‘紅霞的葉綠體全基因組長度為157 832 bp， 鳥嘌呤（Guanine）、胞嘧啶（Cytosine）含量為36.73%，包含一對反向重復（inverted repeat sequence， IR， 26 381 bp）區(qū)，由小單拷貝（short single copy， SSC， 19 120 bp）區(qū)和大單拷貝（long single copy， LSC， 85 950 bp）區(qū)分開，共編碼128個基因，同時包括84個蛋白質(zhì)編碼基因、36個tRNA基因和8個rRNA核糖體基因。（2）通過櫻屬16個葉綠體全基因組的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)‘紅霞與大葉早櫻（C. subhirtella）和日本櫻花（C. yedoensis）一支聚為姊妹群，而與高盆櫻（C. cerasoides）的親緣關系較遠。因此該研究推測，‘紅霞可能不是高盆櫻的品種，而有可能是鐘花櫻和大葉早櫻或日本櫻花的雜交品種。該研究結果為云南櫻花品種‘紅霞的起源和遺傳育種、高盆櫻的品種鑒定與分類等研究提供了一定的參考資料。

關鍵詞： 高盆櫻， 冬櫻花， 重瓣， 品種起源， 系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號： Q943.2? 文獻標識碼： A? 文章編號： 1000-3142（2023）05-0972-08

Abstract： Cerasus ‘Hongxia， a Yunnan flowering cheery cultivar blooming in March with semi-double to double pink petals， have been widely cultivated in central Yunnan for its high ornamental value. It was regarded as the cultivar of Cerasus cerasoides var. rubea. However， it was clustered in C. campanulata based on molecular markers. Therefore， the phylogeny of these cultivars are doubtful， which is not conducive to their breeding and cultivation. In order to explore the origin of Cerasus ‘Hongxia， with leaf DNA of Cerasus ‘Hongxia as material， chloropast genome characteristics were sequenced by Illumina， assembled， annotated， and analyzed by bioinformatic methods， and analyzed by MISA and Genious R10. The phylogenetic tree of Cerasus was reconstructed by using RAxML 8.0， and the phylogenetic relationship of Cerasus ‘Hongxia was analyzed. The results were as follows： （1） The chloroplast genome of Cerasus ‘Hongxia was 157 832 bp in length， containing a pair of reverse repeat sequence （inverted repeat sequence，IR， 26 381 bp） regions， which were separated by a short single copy （SSC， 19 120 bp） region and a long single copy （LSC， 85 950 bp） region. A total of 128 genes were encoded， including 84 protein-coding genes， 36 tRNA genes and 8 rRNA ribosomal genes. The overall Guanine and Cytosine content of genome was 36.73%. （2） Based on the maximum likelihood phylogenetic tree analysis of 16 chloroplast genome of Cerasus， it was found that Cerasus ‘Hongxia was formed as sister to C. subhirtella and C. yedoensis， and was far away from C. cerasoides. Therefore， we speculated that Cerasus ‘Hongxia may be a hybrid cultivar of C. campanulata and C. subhirtella or C. yedoensis， rather than the cultivar of C. cerasoides. The above results are be useful for studies of the origination and genetic breeding of Cerasus ‘Hongxia， as well as the cultivar identification and classification of C. cerasoides.

Key words： Cerasus cerasoides， winter flowering cheery， double petal， cultivar origination， phylogenetic analysis

云南櫻花品種‘紅霞（Cerasus ‘Hongxia）（張瓊，2013；王賢榮，2014）在昆明廣泛種植，俗稱“西府海棠”（俞德浚，1986），花期3月，半重瓣至重瓣，粉紅色，其花序傘形，2～5朵簇生，盛開之際，滿樹繁英，一片燦爛，觀賞價值較高?！t霞的首次記錄為張瓊（2013）的碩士論文，歸屬為紅花高盆櫻（Cerasus cerasoides var. rubea）種系的新品種：‘紅霞紅花高盆櫻（C. cerasoides var. rubea ‘Hongxia），論文中還記錄了3月開花的新品種‘碧心紅花高盆櫻（C. cerasoides var. rubea ‘Bixin）（圖1）。但是，在《中國櫻花圖志》（王賢榮，2014）中，‘紅霞‘碧心卻被記錄為高盆櫻（C. cerasoides）的新品種：‘紅霞高盆櫻（C. cerasoides ‘Hongxia）、‘碧心高盆櫻（C. cerasoides ‘Bixin）。此外，該書還記錄了3月開花的高盆櫻（C. cerasoides）新品種：‘春潮高盆櫻（C. cerasoides ‘Chunchao）。

高盆櫻即高盆櫻桃（俞德浚，1986），又名“菁櫻桃”“云南歐李”“喜馬拉雅野櫻桃”（Xu et al.， 2018），分布于泛喜馬拉雅地區(qū)，在我國以云南為天然分布中心，屬云南省重點保護野生植物。高盆櫻一般在12月份左右開花，花期可為1個月，是唯一在冬季盛開的櫻花（張瓊，2013；Xu et al.， 2018），常被稱為“冬櫻花”（趙大克和鄭麗，2009）。

而有關‘紅霞等3月開花的云南櫻花重瓣栽培種質(zhì)，其最早記錄是在《中國植物志》（俞德浚，1986）中（圖1），被認為是高盆櫻桃變種——紅花高盆櫻桃的園藝品種，但是，品種名不詳。但在2003年的Flora of China（Lu et al.， 2003）中，紅花高盆櫻被歸并到高盆櫻中，花期為12月、3月?；谛螒B(tài)、花期的較大差異，張瓊（2013）認為是否將紅花高盆櫻并入高盆櫻，還是作為一個種或變種，均有待進一步研究。那么，歸屬于變種的‘紅霞等3月開花的重瓣品種，能否直接歸屬于原種高盆櫻，還是歸屬其他種系？

近年來，核基因組內(nèi)轉錄間隔區(qū)ITS和葉綠體間隔序列（petA-psbJ、trnH-psbA、rpl32-trnL和trnL-trnF）的測序分析結果記錄了，紅花高盆櫻與鐘花櫻（C. campanulata）聚為姊妹群，而與高盆櫻的親緣關系較遠（付濤等，2018）。SSR分子標記研究表明（Ma & Margaret，2005；張瓊，2013；聶超仁等，2018），‘紅霞等3月開花的云南櫻花重瓣品種聚在鐘花櫻種系，而不是高盆櫻種系。這說明‘紅霞等品種的種系可能是鐘花櫻，而不是高盆櫻。綜上表明，‘紅霞等3月開花的重瓣云南櫻花品種的種系存疑，對后期的品種分類和遺傳育種等研究工作的開展極為不利。

與葉綠體間隔序列petA-psbJ等相比，葉綠體全基因組能夠更為全面地揭示物種間的系統(tǒng)關系（王雪芹等，2021）。為此，本研究將以云南櫻花品種‘紅霞為研究對象，對其開展葉綠體全基因組測序及分析，同時結合在細胞核層面的研究報道，進一步分析‘紅霞的種系歸屬，以期為‘紅霞等3月開花的重瓣櫻花品種的起源及演化提供科學依據(jù)，為云南櫻花的研究和利用提供一定的參考資料。

1 材料與方法

實驗材料為云南櫻花品種‘紅霞（圖2）的成熟健康葉片，采集地點位于云南省昆明市昆明理工大學呈貢校區(qū)（102.856 5° E、24.852 5° N）。

葉綠體DNA測序流程按照Illumina公司提供的標準方案進行，使用CTAB法（Doyle & Doyle， 1987）提取基因組DNA，經(jīng)檢測合格后，用超聲波將DNA片段化，然后對片段化的DNA進行純化、末端修復、3′端加A、連接測序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，采用全基因組鳥槍法策略，對DNA樣品構建1個350 bp的文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina NovaSeq進行雙末端測序，長度為150 bp。

高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別（base calling）分析轉化為5.1G的原始數(shù)據(jù)（raw reads），結果以FASTQ文件格式存儲。原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾得到5G的有效數(shù)據(jù)（clean reads）。使用的過濾軟件為SOAPnuke V 1.3.0（https：//github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke），過濾標準如下：（1）去除N堿基含量超過5%的數(shù)據(jù)（reads）；（2）去除低質(zhì)量（質(zhì)量值小于等于5）堿基數(shù)目達到50%的數(shù)據(jù)（reads）；（3）去除有接頭（adapter）污染的數(shù)據(jù)（reads）。

使用SPAdes V 3.13.0（https：//github.com/ablab/spades/）軟件進行基因組拼接，將拼接結果與近緣種高盆櫻的葉綠體全基因組（MF621234）與給定的核酸序列與核酸數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，基于比對情況并確定候選序列組裝結果。連接好的序列，若包含gap（含N序列），則使用Gapcloser（Version： 1.12）進一步補洞，得到最終的拼接結果。利用專門針對葉綠體的注釋軟件CPGAVAS2 V 2.0（http：//47.96.249.172：16019/analyzer/annotate/）進行基因注釋后并繪圖。測序后，使用Bankit將注釋好的序列提交至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得Genbank登錄號：OP022428。

采用MISA V 1.0（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html/），使用默認參數(shù)對葉綠體進行SSR檢測；并且對應的各個重復單元（unit size）最少重復次數(shù)分別為1-8、2-4、3-4、4-3、5-3、6-3，如1-8表示以單核苷酸為重復單位時，其重復數(shù)至少為8才可被檢測到。

采用Geneious R10（Biomatters， Ltd.， New Zealand）軟件從NCBI線上數(shù)據(jù)庫下載櫻屬植物的葉綠體全基因組15個，分析“云南櫻花”品種‘紅霞的系統(tǒng)位置和親緣關系。以Malus prunifolia（KU851961）（Lu et al.， 2003）為外類群。所有cp基因組序列均在Genious R10中采用MAFFT進行排列（align）。最后在RAxML V 8.0（Stamatakis， 2014）中根據(jù)最大似然標準構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用1 000次重復自檢（bootstrap）計算各分支支持率。

2 結果與分析

2.1 ‘紅霞的葉綠體基因組

通過組裝，獲得了完整的‘紅霞葉綠體全基因組，其葉綠體全長為157 832 bp，包含一對反向重復（inverted repeat sequence， IR，26 381 bp）區(qū)，由小單拷貝（short single copy，SSC，19 120 bp）區(qū)和大單拷貝（long single copy， LSC，85 950 bp）區(qū)間隔開來（表1），基因組的鳥嘌呤（Guanine）、胞嘧啶（Cytosine）含量為36.73%?！t霞葉綠體基因組共編碼128個基因（圖3），具體包括ATP合成酶（atpA、atpH、atpE、atpB、atpI、atpF）、RNA聚合酶（rpoA、rpoC2、rpoC1、rpoB）、閱讀框（ycf）（ycf4、ycf1、ycf2、ycf3）、轉移RNA（trnL-CAA、trnR-ACG、trnC-GCA、trnW-CCA、trnS-CGA、trnD-GUC、trnN-GUU、trnL-UAA、trnK-UUU、trnR-UCU、trnY-GUA、trnH-GUG、trnP-UGG、trnS-GGA、trnM-CAU、trnT-UGU、trnA-UGC、trnL-UAG、trnV-GAC、trnS-UGA、trnE-UUC、trnT-GGU、trnG-GCC、trnQ-UUG、trnF-GAA、trnS-GCU）、蛋白酶（clpP）、還原型輔酶Ⅰ（NADH）脫氫酶（ndhJ、ndhK、ndhE、ndhC、ndhF、ndhH、ndhG、ndhD、ndhI、ndhA、ndhB）、核糖體蛋白（LSU）（rpl2、rpl33、rpl23、rpl20、rpl22、rpl16、rpl14、rpl36、rpl32）、核糖體RNA（rrn4.5S、rrn16S、rrn23S、rrn5S）、細胞色素b/f復合物（petB、petL、petN、petG、petD、petA）、RubisCO大亞基（rbcL）、成熟酶（matK）、光系統(tǒng)I（psaI、psaA、psaB、psaJ、psaC）、核糖體蛋白（SSU）（rps2、rps11、rps3、rps8、rps16、rps19、rps15、rps4、rps12、rps14、rps7、rps18）、光系統(tǒng)Ⅱ（psbM、psbH、psbI、psbE、psbC、psbJ、psbZ、psbL、psbK、psbA、psbN、psbB、psbT、psbD、psbF）、其他基因（accD、cemA、ccsA）。

此外，共檢測到‘紅霞葉綠體基因組的SSR序列247個（圖3），包括163個復雜重復序列（綠色短桿）和84個簡單重復序列（其中兩堿基重復序列73個，黑色短桿；四堿基重復序列10個，黃色短桿；六堿基重復序列1個）。葉綠體基因組圖譜的內(nèi)圈為MISA（V.1.0）識別的微衛(wèi)星序列，外圈是用CPGAVAS2（V.2）繪制，顯示質(zhì)體上的基因結構，基因的顏色根據(jù)它們的功能分類來區(qū)分。

2.2 ‘紅霞葉綠體基因組的系統(tǒng)分析

通過構建櫻屬16個葉綠體全基因組的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。圖4結果顯示，大葉早櫻（MN695296）、日本櫻花（KP732472）聚為姊妹群（支持率為96%）?！t霞與上述姊妹群聚為一支，又與蜜腺櫻桃（Cerasus discadenia）聚為一支，并且均獲得了100%的支持率。大葉早櫻+日本櫻花+‘紅霞+腺蜜櫻桃和高盆櫻+紅毛櫻桃（C. rufa）雖聚為姊妹群，但獲得的支持率僅為37%。由此可見，‘紅霞和大葉早櫻、日本櫻花的親緣關系最近，而與高盆櫻的親緣關系較遠。

通過葉綠體全基因組的序列比對，發(fā)現(xiàn)‘紅霞與高盆櫻（ID：MF621234）的葉綠體全基因組DNA相似率僅為89.1%，而與近緣種鐘花櫻葉綠體基因組DNA（MH491529）的相似率則為89.4%，均低于‘紅霞與大葉早櫻葉綠體基因組DNA（MN695296）的相似率（89.8%）。由此可見，與‘紅霞親緣關系最近的物種并不是高盆櫻。

綜上認為，3月開花的云南櫻花品種‘紅霞可能不是高盆櫻（12月開花）的品種。

3 討論

3.1 基于葉綠體全基因組的‘紅霞品種溯源

本研究中，曾被認為是變種紅花高盆櫻（俞德浚，1986）的品種‘紅霞，其葉綠體全基因卻與高盆櫻的親緣關系較遠，這與前人的研究結果（‘紅霞等品種均不聚在高盆櫻種系）（張瓊，2013；付濤等，2018；聶超仁等，2018）一致。從形態(tài)特征來看，‘紅霞的萼筒寬鐘形、萼裂片寬卵狀三角形、先端突尖、先葉開放、3月開花等特征，與高盆櫻的“萼筒鐘形、萼裂片三角形、先端急尖、花葉同放、10—12月開花”有顯著的差異（俞德浚，1986；張瓊，2013）?！t霞等品種的樹體、葉片和花朵，常顯著大于高盆櫻。因此，‘紅霞的種系可能并不是高盆櫻，兩者可能有不同的起源。

在我國的植物標本庫中，僅有一份關于紅花高盆櫻的標本記錄［KUN 1312617 （cvh.ac.cn）］，采集地點在云南滄源縣勐董鎮(zhèn)的壩卡山頂，所述的采樣時間是2010年3月29日，標本的果實已完全成熟，果實成熟期與‘紅霞的花期基本一致。因此，這一標本的花期可能是在冬季，極有可能是高盆櫻原種。盡管如此，‘紅霞等3月開花的云南櫻花重瓣品種是否可以直接歸屬于高盆櫻，今后仍可前往上述標本采集點進行實地考察，進一步從形態(tài)和分子等水平展開深入的研究。

同時，本研究中，‘紅霞與鐘花櫻的親緣關系也較遠；而在我國南方野生櫻屬植物的系統(tǒng)發(fā)育分析中，紅花高盆櫻和同為細齒組的鐘花櫻等關系較近（付濤等，2018）。本研究中，‘紅霞和鐘花櫻的親緣關系差異較大，主要原因可能是基于葉綠體全基因組構建的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹；而付濤等（2018）是利用細胞核ITS+4段葉綠體組合序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，兩者結果不完全相同。此外，采樣存在的差異也可能導致結果不一樣。

從形態(tài)特征來看，‘紅霞的萼裂片寬卵狀三角形、先葉開放、3月開花等特征，與鐘花櫻更為接近（俞德浚，1986），這與細胞核層面的分子研究結果（‘紅霞‘碧心均聚在鐘花櫻種系）（張瓊，2013；付濤等，2018；聶超仁等，2018）一致。而在葉綠體基因組層面，‘紅霞和大葉早櫻、日本櫻花的親緣關系最為相近。因此本研究推測，‘紅霞等3月開花的重瓣品種可能是鐘花櫻和日本早櫻或大葉早櫻的雜交品種，甚至可能是雜交多倍化形成的異源多倍體。因為在大多數(shù)植物中，葉綠體基因?qū)儆谀感赃z傳，所以如果‘紅霞的品種起源涉及雜交事件的話，雜交母本最有可能是大葉早櫻或日本櫻花，而雜交父本最有可能是鐘花櫻。但是，上述推測還需要進一步的細胞學、分子生物學等證據(jù)來進行驗證。

3.2 高盆櫻（冬櫻花）的栽培種質(zhì)亟待整理

《植物名實圖考》（吳其濬，1848）中記載：“冬海棠生云南山中，園圃中亦植之，樹如山桃，葉似櫻桃而長，冬天開桃色花……”。由此可見，高盆櫻在云南的栽培歷史悠久。近30年來，高盆櫻在園林中的栽培與日俱增，對提升亞熱帶地區(qū)的冬季景觀發(fā)揮了非常重要的作用，得到了人們的普遍認可和關注。目前，高盆櫻已被引種至全國多地乃至東南亞栽培，可見，高盆櫻的國際化已拉開序幕、勢在必行。

高盆櫻的栽培種質(zhì)正逐漸增多，如云南萬家紅園藝有限公司報道的“重瓣冬櫻花”（13～15瓣）和3個品種‘仙女散花‘翡翠‘冬之舞；沈鑫等（2019）報道的高盆櫻品種‘改良和‘重瓣；大理鶴慶縣報道的“小陽春”；李秀琴（2018）報道的“重瓣冬櫻花”；安寧市報道的“滇鶴紅櫻”；謝鳳云等（2017）報道的“粉冬櫻花”“綠冬櫻花”“重瓣冬櫻花”“新品冬櫻花”；楊曉東（1992）等報道的“石屏冬櫻花”等。這些栽培種質(zhì)的花瓣有單瓣、重瓣和復瓣；花色有白色、粉紅色、玫紅色；花萼有綠色、紅色，為高盆櫻的品種分類提供了多樣的性狀。

然而，根據(jù)《國際栽培植物命名法規(guī)》（《International Code of Nomenclature for Cultivated Plants》，ICNCP，第八版）（靳曉白等，2013），部分品種名稱的規(guī)范性還有待提升，如‘改良‘重瓣等。雙引號標注的“滇鶴紅櫻”等，也只能視為俗稱，如要稱為品種，應選用單引號。此外，雖然各栽培群體從本地移栽的優(yōu)良野生類型越來越多，但這部分栽培種質(zhì)卻沒有規(guī)范的品種名稱。

因此，高盆櫻栽培種質(zhì)在形態(tài)、細胞和分子水平的遺傳多樣性亟待開展系統(tǒng)的研究，分析其雜交或多倍化事件，進而系統(tǒng)整理高盆櫻的栽培品種，提出符合ICNCP的品種名錄和基于種系的分類系統(tǒng)，為高盆櫻的遺傳育種研究、品種鑒定與分類、國際化應用等提供重要的基礎資料。

3.3 鐘花櫻的分類地位

鐘花櫻曾被認為是高盆櫻分布區(qū)偏東、低海拔地區(qū)的變種（朱淑霞等，2019）。雖然鐘花櫻和高盆櫻在滇東南周邊有一定的重疊分布，但Flora of China （Lu et al.， 2003）和付濤等（2018）將高盆櫻和鐘花櫻認定成兩個種。高盆櫻與相似分布區(qū)的紅毛櫻桃（Cerasus rufa）聚為姊妹群，親緣關系最近，而與鐘花櫻的親緣關系較遠。從葉綠體全基因組的系統(tǒng)關系分析來看，本研究認為鐘花櫻單獨成種更為合理，而不是作為高盆櫻的變種。

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（責任編輯 李 莉 王登惠）