CXCL2在結(jié)直腸癌中的表達及臨床意義

陸娜娜 白真真

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,并且在我國結(jié)直腸癌的中位發(fā)病年齡呈逐年遞減的趨勢[1]。早期結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年生存率可達90%以上,在有長期篩查計劃的國家,結(jié)直腸癌死亡率下降幅度最大[2]。因此,尋找更敏感、更特異的結(jié)直腸癌分子靶點已迫在眉睫。CXCL2也稱為生長相關(guān)基因產(chǎn)物(GROβ),是趨化因子家族(CXCLs)的一員,在炎癥損傷修復(fù)過程中起著非常重要的作用,例如參與細胞骨架的重組、細胞遷移、粘附和免疫反應(yīng)[3]。目前關(guān)于CXCL2蛋白在結(jié)直腸癌中的表達以及意義研究較少,本研究旨在研究CXCL2的結(jié)直腸癌分子病理學(xué)特征,為結(jié)直腸癌臨床診斷治療等提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月至2021年12月60例在合肥市濱湖醫(yī)院接受結(jié)直腸癌根治手術(shù)治療患者的組織標(biāo)本,對其臨床病理和生存預(yù)后資料進行收集?；颊咝g(shù)前均未接受過放射治療或化學(xué)治療,每例患者取一對癌和癌旁樣本。60例患者中,男30例,女30例;中位年齡53歲;結(jié)直腸癌的病理分級根據(jù)WHO的分級標(biāo)準進行評估,同時根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會的標(biāo)準進行TNM分期。本次研究符合合肥市濱湖醫(yī)院倫理學(xué)要求,所有納入研究的患者和家屬都已知情,并簽署書面協(xié)議。

1.2 方法 將石蠟包埋的組織切片(厚度4 μm)在二甲苯中脫蠟并以梯度濃度降低的乙醇重新水化。將切片置于3%濃度的過氧化氫中孵育30 min,以淬滅組織內(nèi)源性過氧化物酶。將切片沒于檸檬酸鈉修復(fù)液中高壓修復(fù)5 min,以進行抗原修復(fù)。將切片在正常山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)中于室溫孵育1 h,以封閉非特異性結(jié)合位點。然后去除多余封閉液,滴加以1∶100稀釋的CXCL2一抗工作液(A12639,武漢愛博泰克生物科技有限公司),并在4℃下孵育8 h,使用PBS作為陰性對照,陽性對照為隨一抗試劑贈送的已知陽性片。次日將切片在25℃下復(fù)溫1 h并洗滌后,滴加二抗工作液(丹科醫(yī)療器械技術(shù)服務(wù)有限公司),室溫孵育30 min后洗滌,最后使用DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進行顯色,待一組切片有陽性反應(yīng)出現(xiàn)后,將切片插入PBS中終止所有顯色反應(yīng)。使用Mayer蘇木精進行復(fù)染,常規(guī)分化、返藍、脫水和透明后,中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果評價 所有免疫組化結(jié)果由2位5年以上年資的病理科醫(yī)師在顯微鏡下進行評分,要求每個400倍視野至少有200個可用于評分標(biāo)準的細胞,評分結(jié)果經(jīng)聯(lián)合閱片后協(xié)商給出。評分標(biāo)準:將陽性強度按照無色算為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分;陽性細胞數(shù)<5%為0分,5%～25%為1分,25%～50%為2分,50～75%為3分,>75%為4分。然后將染色強度×陽性細胞百分比對應(yīng)的值作為評分。0～1為-,2～4為+,5～8為++,9～12為+++。以-和+認為表達陰性,以++和+++認為表達陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,采用Log-rank檢驗比較生存率之間的差異,采用Cox比例風(fēng)險模型分析預(yù)后結(jié)果的單變量和多變量,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL2在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達 免疫組化結(jié)果顯示CXCL2蛋白在結(jié)直腸癌細胞中陽性部位主要定位于細胞核和細胞漿,鏡下觀察陽性表達表現(xiàn)為鮮黃色、棕黃色和黃褐色顆粒,染色強度明顯高于背景。CXCL2在結(jié)直腸癌組織中的表達陽性率為80%(48例),在正常結(jié)直腸組織表達陽性率僅為36.7%(22例),CXCL2在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于正常結(jié)直腸組織(P<0.01)。見圖1,表1。

表1 CXCL2在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達 n=60,例

圖1 CXCL2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(HE×400);A 結(jié)直腸癌組織中CXCL2呈強陽性(+++);B 結(jié)直腸癌組織中CXCL2呈中陽性(++);C 結(jié)直腸癌組織中CXCL2呈弱陽性(+);D 結(jié)直腸癌組織中CXCL2呈陰性(-)

2.2 結(jié)直腸組織中CXCL2蛋白的表達與患者病理參數(shù)的關(guān)系 將60例結(jié)直腸癌組織根據(jù)CXCL2蛋白免疫組化評分高低分為CXCL2高表達和CXCL2低表達,與CXCL2低表達比較,CXCL2高表達表現(xiàn)為更高的N分期(P=0.017)和M分期(P=0.035),均有顯著相關(guān)性;然而CXCL2高表達與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、病理分級和T分期均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 CXCL2表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

2.3 高CXCL2水平預(yù)示結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良 隨訪所有患者的預(yù)后數(shù)據(jù),并分析CXCL2的表達與結(jié)直腸患者預(yù)后的關(guān)系。采用Log-rank法進行生存分析,結(jié)果顯示CXCL2高表達的患者OS時間比CXCL2低表達的患者(Hazard Raito=2.718,95% CI:1.067～6.921,Log-rankP=0.036)更短。同時,DFS生存曲線顯示,與CXCL2低表達的患者比較,CXCL2高表達的患者的DFS時間較短(Hazard Raito=2.612,95% CI:1.128～6.635,Log-rankP=0.045)。此外,單因素分析和多因素分析顯示,CXCL2表達水平是結(jié)直腸癌患者OS和DFS的獨立危險因素(P均<0.05)。見圖2,表3,4。

表3 影響結(jié)直腸癌患者OS和DFS的變量的單因素分析

表4 影響結(jié)直腸癌患者OS和DFS的變量的多因素分析

圖2 CXCL2表達與結(jié)直腸癌患者總生存期(左)和無病生存期(右)的相關(guān)性分析

3 討論

細胞趨化因子通過與細胞表面的受體結(jié)合在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[4]。CXC家族主要由內(nèi)皮細胞、活化單核細胞、巨核細胞、成纖維細胞產(chǎn)生,多數(shù)成員參與中性粒細胞的趨化和激活,也可趨化B細胞和T細胞[5]。CXCL2又被稱為GRO-2、GROβ、MIP2-α等,最早發(fā)現(xiàn)于惡性黑色素瘤細胞表面,CXCL2與CXCR2受體結(jié)合主要參與體內(nèi)炎性反應(yīng),趨化和激活各類炎性細胞到達目的部位,介導(dǎo)血管形成干細胞分化和神經(jīng)遞質(zhì)釋放修復(fù)創(chuàng)傷[6,7]。在肝癌中,甲基化引起CXCL2低表達從而促進肝細胞肝癌的發(fā)生[8]。在結(jié)腸癌中,CXCL2通過Gαi-2和Gαq/11介導(dǎo)以促進腫瘤發(fā)生,并有助于維持結(jié)腸癌細胞的干性特性[9]。除此之外,CXCL2還促進前列腺癌和口腔鱗狀細胞癌的骨破壞,在慢性淋巴細胞白血病進展中也發(fā)揮著重要作用[10-12]。因此CXCL2在惡性腫瘤發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用。

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是多基因表達調(diào)控失衡共同作用的結(jié)果[13],并且隨著人們對結(jié)直腸癌分子機制的研究,結(jié)直腸癌的生存率較從前已有很大提高,因此進一步尋找結(jié)直腸癌有關(guān)的關(guān)鍵分子至關(guān)重要。在本研究中,我們通過免疫組化技術(shù)檢測CXCL2蛋白在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達水平,結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌組織中,CXCL2蛋白表達水平顯著性上調(diào),結(jié)直腸癌組織中CXCL2蛋白高表達與N分期和M分期有關(guān),而與患者的年齡、性別、病理分級和T分期均無顯著相關(guān)性。提示CXCL2可能作為結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的重要篩查指標(biāo),并且為結(jié)直腸癌靶向治療提供早期依據(jù)以及預(yù)后評估。此外,單因素分析和多因素分析顯示,CXCL2水平是結(jié)直腸癌患者OS和DFS的獨立危險因素。先前的研究已經(jīng)證明了CXCL2在其他惡性腫瘤中的預(yù)后價值。我們通過Log-rank檢驗獲得的結(jié)果表明CXCL2高表達的結(jié)直腸癌患者比CXCL2低表達的患者具有更短的OS和DFS。此外,我們通過使用Cox比例風(fēng)險模型得出結(jié)論,CXCL2是手術(shù)后結(jié)直腸癌患者的獨立預(yù)后因素。

綜上所述,我們首次發(fā)現(xiàn)CXCL2的表達在結(jié)直腸癌中上調(diào),其高表達與結(jié)直腸癌患者的不良臨床特征以及不良OS和DFS差有關(guān)。CXCL2可能在結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后預(yù)測中起關(guān)鍵作用,因此CXCL2有望成為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。