N-乙酰半胱氨酸抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對前列腺癌的治療作用

徐梅 魏雯

前列腺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,是男性死于癌癥的第二大原因[1,2]。前列腺癌大多數(shù)發(fā)生于>65歲男性,其與遺傳和環(huán)境因素相關(guān),如飲食習(xí)慣、生活方式、缺乏運(yùn)動能力和吸煙等[3]。目前,臨床治療前列腺癌的方法多種多樣,包括化療、前列腺切除術(shù)及抗雄激素治療等[4]?？剐奂に刂委熓乔傲邢侔┗颊咴缙诘闹饕委煼椒?但患者對抗雄激素治療出現(xiàn)耐藥性[5],因此,尋找用于治療前列腺癌的藥物是前列腺癌治療的一項重要策略。N-乙酰半胱氨酸是一種抗氧化劑,具有抗氧化、粘液溶解和抗炎等多種活性[6,7]。N-乙酰半胱氨酸在體內(nèi)和體外均具有抗腫瘤效應(yīng),降低腫瘤細(xì)胞侵襲性和促腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。本研究通過體內(nèi)外實驗評價了N-乙酰半胱氨酸的潛在抗前列腺癌作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自碧云天生物科技有限公司(中國);Anti-MMP-2,Anti-caspase3,Anti-p38,Anti-GAPDH抗體均購自Cell Signaling生物公司(美國);N-乙酰半胱氨酸注射液購自杭州民生藥業(yè)有限公司(中國)。

1.2 動物 SPF級別6月齡雄性裸小鼠40只,體重18～20 g,購于新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心,實驗動物許可證號:SCXK(新)2021-0001。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):人前列腺癌PC3細(xì)胞購買于ATCC(美國),用含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的1640細(xì)胞培養(yǎng)基于37℃和5% CO2條件下,培養(yǎng)于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.3.2 四甲基偶氮唑鹽(MTT)實驗:以1×106個/ml密度將PC3細(xì)胞接種于96孔板,過夜培養(yǎng),待細(xì)胞長至80%時,用不同濃度的NAC(0、2.5、5和10 μmol/L)處理24 h,用MTT液檢測細(xì)胞活力。

1.3.3 細(xì)胞克隆形成實驗:將細(xì)胞以1 000個/孔接種于6孔板,按上述給藥濃度給予藥物,并培養(yǎng)7 d,隨后用1%結(jié)晶紫溶液對細(xì)胞染色,拍照并計數(shù)。

1.3.4 細(xì)胞劃痕實驗:將PC3細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)80%時,按上述給藥濃度給予藥物,然后用移液管吸頭刮擦單層前列腺細(xì)胞,拍照觀察細(xì)胞的遷移能力。

1.3.5 流式細(xì)胞凋亡分析實驗:取對數(shù)期生長的PC3細(xì)胞,消化成單細(xì)胞懸浮液,稀釋細(xì)胞數(shù)至1×104個/ml,接種于96孔板,100 μl/孔,待細(xì)胞貼壁后,按上述給藥濃度給予藥物,加Annexin-V-FITC/PI標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 荷瘤裸鼠模型:動物實驗均通過我院倫理委員會的批準(zhǔn),腹側(cè)皮下注射PC3細(xì)胞,每只裸鼠皮下注射5×105個細(xì)胞。待背部皮下出現(xiàn)顆粒大小的硬結(jié)節(jié),即造模成功。選擇造模成功的裸鼠40只,隨機(jī)分為對照組,N-乙酰半胱氨酸組(12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg)和陽性對照組(PBS),每組8只。從接種細(xì)胞后第2周開始,腹腔注射N-乙酰半胱氨酸,陽性對照組注射氟他胺(20 mg/kg),對照組注射等體積0.9%氯化鈉溶液,每3天1次,連續(xù)6周。腫瘤塊出現(xiàn)后,每周測量一次腫瘤塊體積(TV)。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤塊的最大直徑(A)和最小直徑(B),按公式TV=0.5 × A × B2計算。

1.3.7 RT-PCR法:收集荷瘤裸鼠腫瘤組織,加1mLTrizol,組織研磨儀勻漿,提取組織總RNA,用NanoDrop 2000檢測RNA的濃度和純度,用PrimeScriptTMRT試劑盒和gDNA Eraser將RNA(1 μg)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用配有SYBRs Green Master Mix的CFX ConnectTMReal-Time系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR定量分析,計算MMP2、p38、caspase3相對于GAPDH mRNA的表達(dá)水平,引物序列:MMP2-Forward:5’-CCCACTGCGGTTTTCTCGAAT-3’;MMP2-Reverse:5’-CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3’;caspase3-Forward:5’-CAGCACCTGGTTATTATTCT-3’;caspase3-Reverse:5’-TTGTCGGCATACTGTTTC-3’;p38-Forward:5’-GCTGTGAATGAAGACTGTGAG-3’;p38-Reverse:5’-GCATCCCACTGACCAAATATC-3’;GAPDH-Forward:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’;GAPDH-Reverse:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.3.8 蛋白免疫印跡(Western blot)法:提取組織和細(xì)胞總蛋白,采用BCA法蛋白定量,加入Loading buffer(4×)于100℃煮沸5 min,然后采用SDS-PAGE電泳分離蛋白。隨后采將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏佛乙烯膜,用5% BSA室溫封閉60 min,用一抗(MMP2,caspase3,p38和GAPDH,按1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜,用二抗室溫孵育90 min,用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影檢測,ImageJ分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 4組PC3細(xì)胞活力和細(xì)胞克隆形成比較 與對照組(0 μmol/L)相比,N-乙酰半胱氨酸(2.5、5和10 μmol/L)組的細(xì)胞活力和存活菌落顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組PC3細(xì)胞活力和細(xì)胞克隆形成比較 n=3,%,

2.2 4組PC細(xì)胞MMP-2、p38和caspase-3表達(dá)比較 與對照組(0 μmol/L)相比,N-乙酰半胱氨酸(2.5、5和10 μmol/L)組細(xì)胞中MMP2和p38表達(dá)水平顯著下調(diào),caspase3的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 4組PC細(xì)胞MMP-2、p38和caspase-3表達(dá)

表2 4組PC細(xì)胞MMP2、p38和caspase3表達(dá)結(jié)果比較 n=3,

2.3 4組PC3細(xì)胞遷移和凋亡情況比較 與對照組(0 μmol/L)相比,N-乙酰半胱氨酸(2.5 μmol/L,5 μmol/L和10 μmol/L)組PC3細(xì)胞的遷移能力降低。與對照組(0 μmol/L)相比,N-乙酰半胱氨酸(2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)組的細(xì)胞凋亡率升高,分別為2.1%、25.8%、49.0%和86.1%。見圖2。

圖2 N-乙酰半胱氨酸對PC3細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞凋亡的影響;A 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果;B 流失細(xì)胞分析凋亡實驗結(jié)果

2.4 4組荷瘤裸鼠腫瘤塊體積和重量比較 與對照組相比,N-乙酰半胱氨酸(12.5 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg)組小鼠的腫瘤塊的體積和重量顯著減小(P<0.05)。見表3。

表3 5組荷瘤裸鼠腫瘤塊體積和重量比較 n=8,

2.5 荷瘤裸鼠腫瘤組織中MMP2、p38和caspase3表達(dá)水平比較 與對照組相比,N-乙酰半胱氨酸(12.5、25和50 mg/kg)組MMP2和p38表達(dá)水平顯著下調(diào),caspase3表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見表4。

表4 腫瘤組織中MMP2、p38和caspase3表達(dá)水平比較 n=8,

3 討論

N-乙酰半胱氨酸作為一種抗氧化劑,具有抗乳腺癌細(xì)胞增殖效應(yīng),但對前列腺癌的作用和機(jī)制依然不太清晰。因此,本研究采用體外PC3前列腺癌細(xì)胞和體內(nèi)荷瘤裸鼠模型評價了N-乙酰半胱氨酸的抗前列腺癌活性和分子機(jī)制。

不同的腫瘤細(xì)胞均具有相同的生物學(xué)特征,如對細(xì)胞死亡信號無反應(yīng),不能正常凋亡;不受控制地增殖;能夠遷移并擴(kuò)散至其他細(xì)胞或身體部位,發(fā)生轉(zhuǎn)移;能夠形成新的血管等[9]。因此,尋找同時針對多種腫瘤生物學(xué)特征的藥物是腫瘤治療的一項重要策略。本研究首先評價了N-乙酰半胱氨酸對PC3細(xì)胞的抗增殖、促凋亡和抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移效應(yīng),發(fā)現(xiàn)不同濃度的N-乙酰半胱氨酸(2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)均可抗腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗腫瘤細(xì)胞遷移,這表明N-乙酰半胱氨酸同時作用于多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征,并產(chǎn)生抗前列腺癌效應(yīng)。

N-乙酰半胱氨酸的抗腫瘤活性與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)信號分子的表達(dá)有關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路,包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK),c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK亞型[10,11]。p38 MAPK通過蛋白激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞死亡和腫瘤抑制[12,13]。細(xì)胞凋亡通過內(nèi)在和外在凋亡細(xì)胞途徑調(diào)節(jié),內(nèi)在信號途徑中,線粒體細(xì)胞色素C釋放激活胱天蛋白酶(caspase)-9和caspase-3,在后一種途徑中,配體與其死亡受體相互作用將激活caspase-8和caspase-3,因此,caspase-3在細(xì)胞凋亡信號中起著至關(guān)重要的作用,是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志物[14,15]。轉(zhuǎn)移是腫瘤后期的主要特征,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)通過降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用,MMP-2廣泛高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞,與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16,17]。本研究認(rèn)為N-乙酰半胱氨酸對癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的抑制作用與MAPK信號有關(guān),因為轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)介導(dǎo)的MMP-2的誘導(dǎo)依賴于p38 MAPK途徑的激活[18,19]。本研究表明N-乙酰半胱氨酸抑制了PC3細(xì)胞中p38表達(dá),并且上調(diào)caspase-3和MMP-2表達(dá)。

本研究體外結(jié)果表明N-乙酰半胱氨酸具有抗腫瘤細(xì)胞增殖、促凋亡和抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移效應(yīng),并且其可能與調(diào)節(jié)p38,caspase-3和MMP-2蛋白表達(dá)有關(guān)。因此,接下來本研究通過建立體內(nèi)荷瘤裸鼠模型評價了N-乙酰半胱氨酸的體內(nèi)生物學(xué)活性,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,腹腔注射N-乙酰半胱氨酸能夠抑制荷瘤裸鼠腫瘤塊的形成,并呈劑量依賴性下調(diào)腫瘤組織中p38表達(dá),并上調(diào)caspase-3和MMP-2表達(dá)。上述結(jié)果表明N-乙酰半胱氨酸在體內(nèi)也具有抗腫瘤活性,并與調(diào)節(jié)p38,caspase-3和MMP-2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,通過體內(nèi)外實驗表明N-乙酰半胱氨酸具有潛在的抗前列腺癌作用,并且這種作用與調(diào)節(jié)p38,caspase-3和MMP2蛋白表達(dá)有關(guān)。但N-乙酰半胱氨酸是否能夠通過其他信號通路產(chǎn)生抗前列腺癌作用依然是未知的,需要進(jìn)一步研究。