下調(diào)miR-210對(duì)精索靜脈曲張大鼠干預(yù)效果及作用機(jī)制研究

方茂霖 李兆萍 王蘊(yùn)琪 楊文濤 周磊 李群生

精索靜脈曲張是造成男性不育癥的主要原因,以左側(cè)發(fā)病為主,精索靜脈曲張可使睪丸灌注減少,進(jìn)而導(dǎo)致了睪丸體積下降、精液質(zhì)量異常、睪丸生精功能異常的發(fā)生,最終對(duì)患者的生育功能造成了影響[1-3]。精索靜脈曲張的主要病理表現(xiàn)為間質(zhì)性水腫、睪丸組織內(nèi)生精細(xì)胞脫落、微血管病變等,微小RNA-210(miR-210)是一種在缺氧相關(guān)疾病、腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞中表達(dá)存在顯著差異的缺氧因子之一,miR-210對(duì)微血管的形成具有促進(jìn)作用,進(jìn)而促進(jìn)了精索靜脈曲張患者病情的發(fā)展[4]?；谏鲜霰尘?本文研究中分析了下調(diào)miR-210對(duì)精索靜脈曲張大鼠干預(yù)效果及作用機(jī)制,以期望為后續(xù)臨床及實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取44只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠,體重150～200 g,由中科中山藥物創(chuàng)新研究院提供,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(粵)2020-0239,本次試驗(yàn)操作參照動(dòng)物試驗(yàn)倫理要求的相關(guān)規(guī)定,且經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模:選取44只大鼠,12只作為假手術(shù)組,其余32只參照劉建國(guó)等[5]的方法建立精索靜脈曲張模型作為精索靜脈曲張模型組,對(duì)左腎靜脈、左腎總靜脈之間交通支進(jìn)行部分結(jié)扎,假手術(shù)組只進(jìn)行左腎靜脈分離,不結(jié)扎,所有大鼠在術(shù)后給予肌內(nèi)注射青霉素鈉預(yù)防感染,劑量為20萬(wàn)U/d,共注射3 d,喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料,喂養(yǎng)48周后,每組取2只進(jìn)行剖腹觀察,通過(guò)游標(biāo)卡尺對(duì)大鼠左側(cè)精索靜脈直徑進(jìn)行測(cè)量,觀察其曲張程度,大鼠左側(cè)精索內(nèi)靜脈直徑比與假手術(shù)組擴(kuò)張2倍,雙腎大小無(wú)明顯差異,左腎無(wú)缺血萎縮等明顯病變即為建模成功。建模成功后將精索靜脈曲張模型組剩余30只大鼠分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組,每組10只。

1.2.2 miR-210轉(zhuǎn)染:將所購(gòu)買的miR-210模擬物(miR-210 mimic,上調(diào))、miR-210抑制物(miR-210 inhibitor,下調(diào))利用Lippofectamine 2000試劑盒稀釋為5 mmol/L,將稀釋后的miR-210模擬物、miR-210抑制物分別注射于上調(diào)組、下調(diào)組大鼠胃組織中,假手術(shù)組、模型組注射同劑量的蒸餾水灌胃,注射24 h后觀察大鼠變化。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 病理學(xué)形態(tài)學(xué)觀察:于miR-210轉(zhuǎn)染后,每組取2只大鼠麻醉后處死,獲取大鼠附睪組織,經(jīng)脫水、石蠟包埋處理后,做HE染色,光鏡下觀察病理形態(tài)改變。

1.3.2 miR-210轉(zhuǎn)染效率鑒定:于miR-210轉(zhuǎn)染后,每組取2只大鼠麻醉后處死, miR-210轉(zhuǎn)染效率經(jīng)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量法進(jìn)行鑒定,提取造膜側(cè)睪丸組織總RNA,使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將組織中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,啟動(dòng)PCR儀,反應(yīng)體系:0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYBGreen,加蒸餾水至20 μl。反應(yīng)條件:97℃預(yù)熱8 min、95℃變性5 s、60℃退火31 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán),采用2-ΔΔCt方法計(jì)算出 miR-210的表達(dá)量。miR-210上游引物序列:5’-CTGGAGCTGTGCGTGTGACAGC-3’,下游引物序列:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;內(nèi)參GAPDH上游引物序列:5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’,下游引物序列:5’-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’。

1.3.3 精液質(zhì)量檢測(cè):按照WHO《人類精液及精子-宮頸黏液互相作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)(第四版)》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)精子質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)[6]。于miR-210轉(zhuǎn)染后,斷頸處死4組大鼠,迅速取左側(cè)附睪,剪碎,溶于8 ml 0.9氯化鈉溶液,37℃繼續(xù)孵育15 min直至精子完全游出,獲得精子懸液,滴到精子計(jì)數(shù)板上對(duì)4組大鼠精子濃度、精子活率進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)水平檢測(cè):于miR-210轉(zhuǎn)染后,取大鼠睪丸組織越1 mm3,加入適量(1∶10)組織蛋白抽離液,充分碾碎,在半徑3 cm,轉(zhuǎn)速3 000 r/min的條件下離心15 min,提取上清液,0℃保存待測(cè),采用黃嘌呤氧化酶法對(duì)4組大鼠超氧化物歧化酶(SOD)水平進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)TBA法對(duì)4組大鼠丙二醛(MDA)水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 Nrf2/HO-1信號(hào)通路相對(duì)表達(dá)量檢測(cè):通過(guò)Western Blot方法對(duì)睪丸組織中的Nrf2/HO-1信號(hào)通路蛋白核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO-1)相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),將4組大鼠睪丸組織剪碎后加入裂解液,進(jìn)行30 min裂解,以離心半徑3 cm,轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心處理10 min,取上清液,做BCA(bicinchoninic acid)蛋白定性檢測(cè),將樣品上樣至8% SDS-PAGE凝膠上,經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用PBS封閉2 h后,加入TBST稀釋的羊抗鼠 Nrf2、HO-1(1∶2 500)一抗,后4℃條件下孵育過(guò)夜,洗膜3次,加入1∶10 000的稀釋羊抗鼠二抗,溫室孵育1 h,做TBST洗膜3次,以β-actin為內(nèi)參照,定量分析蛋白表達(dá)情況,重復(fù)試驗(yàn)3次。鼠源性一抗由上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司提供。

2 結(jié)果

2.1 精索靜脈曲張模型建模成功的判定 光鏡下觀察,假手術(shù)組大鼠生精小管內(nèi)生精上皮層數(shù)完整,小管形態(tài)飽滿,生精細(xì)胞排列有序,精索靜脈曲張模型組大鼠的生精小管內(nèi)生精上皮明顯變薄,并且大量生精細(xì)胞缺失。見(jiàn)圖1。

圖1 光鏡下病理切片對(duì)照(HE染色×200)

2.2 病理特征比較 光鏡下,假手術(shù)組大鼠各生精小管排列有序、結(jié)構(gòu)正常,各級(jí)細(xì)胞層次整齊光鏡下,且清晰,未觀測(cè)到明顯形態(tài)異常,模型組生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞層次較為紊亂,管腔內(nèi)有少量精子存在,并且部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同程度受損;上調(diào)組大鼠的生精小管管腔縮窄,腔內(nèi)少見(jiàn)正常精子,生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞大量缺失,且脫落現(xiàn)象嚴(yán)重;下調(diào)組生精小管腔壁有明顯擴(kuò)大,一部分生精小管恢復(fù)正常管腔內(nèi)可見(jiàn)多數(shù)正常精子。見(jiàn)圖2。

圖2 病理特征比較(HE染色×200)

2.3 miR-210轉(zhuǎn)染效率鑒定 與假手術(shù)組相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組miR-210表達(dá)量上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,下調(diào)組miR-210表達(dá)量下降,上調(diào)組miR-210表達(dá)量上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組miR-210表達(dá)量下降,說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。見(jiàn)表1。

表1 miR-210轉(zhuǎn)染效率鑒定 n=10,

2.4 4組大鼠精液質(zhì)量比較 與假手術(shù)組相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組精子濃度、精子活率水平下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組精子濃度、精子活率水平下降,下調(diào)組精子濃度、精子活率水平上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組組精子濃度、精子活率水平上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠精液質(zhì)量比較 n=10,

2.5 4組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 與假手術(shù)組相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組SOD水平下降,MDA水平上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組SOD水平下降,MDA水平上升,下調(diào)組SOD水平上升,MDA水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組SOD水平上升,MDA水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 n=10,

2.6 4組大鼠睪丸組織Nrf2/HO-1通路蛋白相對(duì)表達(dá)量 與假手術(shù)組相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)量下降,下調(diào)組Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)量上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組組Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)量上升(P<0.05)。見(jiàn)表4,圖3。

表4 4組大鼠睪丸組織Nrf2/HO-1通路蛋白相對(duì)表達(dá)量 n=10,

圖3 Nrf2/HO-1通路蛋白WB圖

3 討論

目前臨床最主要通過(guò)藥物、腹腔鏡手術(shù)、顯微外科手術(shù)、開(kāi)放手術(shù)對(duì)精索靜脈曲張患者進(jìn)行治療,藥物雖然可使靜脈回流增加,但整體治療效果不佳,手術(shù)治療患者術(shù)后可能出現(xiàn)血小板活化、聚集、黏附等現(xiàn)象,進(jìn)而引發(fā)了輕微血栓、管壁炎癥反應(yīng)的發(fā)生,最終導(dǎo)致了精索靜脈曲張復(fù)發(fā)或不良反應(yīng)的出現(xiàn)[7,8]。研究顯示,精索靜脈曲張病情的發(fā)展與組織缺氧、氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的炎癥、細(xì)胞凋亡存在密切聯(lián)系,因此改善組組織缺氧及氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)精索靜脈曲張的治療具有重要意義[9]。

miR-210在腫瘤形成、缺氧機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,在缺氧時(shí)miR-210對(duì)DNA損傷、線粒體活動(dòng)、細(xì)胞增殖具有抑制作用,在腫瘤發(fā)生機(jī)制中,miR-210一方面受HIF-1α的調(diào)控,另一方面miR-210可對(duì)HIF-1α進(jìn)行調(diào)控,兩者相互調(diào)節(jié),進(jìn)而使得兩者的表達(dá)量增加,調(diào)節(jié)了機(jī)體的缺氧環(huán)境[10,11]。研究顯示,miR-210、HIF-1α在精索靜脈曲張睪丸組織中表達(dá)升高,可能與睪丸附睪損傷有關(guān)[12]。本文研究顯示,下調(diào)miR-210可干預(yù)精索靜脈曲張的病情發(fā)展,病理組織觀察顯示,經(jīng)miR-210下調(diào)干預(yù)后大鼠生精小管腔壁有明顯擴(kuò)大,一部分生精小管恢復(fù)正常管腔內(nèi)可見(jiàn)多數(shù)正常精子,此結(jié)果提示著下調(diào)miR-210可改善精索靜脈曲張大鼠精液質(zhì)量,其機(jī)制可能于組織缺氧改善,Nrf2/HO-1信號(hào)通路被激活有關(guān)。

精子密度、精子活動(dòng)度是研究雄性生殖健康的重要指標(biāo),精子密度是影響生育的重要因素,當(dāng)精子密度等于0時(shí)會(huì)造成無(wú)精子癥的發(fā)生,精子活動(dòng)度直接決定著精子是否可以正常游走到生殖管道與卵子進(jìn)行結(jié)合,精索靜脈曲張是影響精子發(fā)育和精液質(zhì)量的主要疾病之一,患者精子密度、精子活動(dòng)度會(huì)隨之下降[13,14]。研究顯示,反應(yīng)活性氧、內(nèi)源性促氧化因子表達(dá)過(guò)度可導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生,同時(shí)反應(yīng)活性氧的過(guò)度表達(dá)會(huì)造成附睪上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變及功能障礙,最終引發(fā)了男性不育[15]。SOD可通過(guò)對(duì)多余反應(yīng)活性氧的消除,進(jìn)而起到了保護(hù)細(xì)胞的作用,阻止了精索靜脈曲張病情的發(fā)展[16]。MDA是一種具有細(xì)胞獨(dú)行的脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物,可用于細(xì)胞質(zhì)膜損傷程度的評(píng)價(jià)[17]。本文研究顯示,精索靜脈曲張可導(dǎo)致精子密度、精子活動(dòng)度、SOD水平下降,MDA水平上升,經(jīng)下調(diào)miR-210干預(yù)后上述指標(biāo)改善,表明下調(diào)miR-210可抑制病情發(fā)展,改善精液質(zhì)量。

Nrf2是一種具有抗癌、拮抗細(xì)胞凋亡、抗炎、維持細(xì)胞氧化還原平衡作用的轉(zhuǎn)錄因子,Nrf2在正常情況下可與特異性受體Keap1在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行結(jié)合進(jìn)而失去自身活性,在氧化應(yīng)激反應(yīng)刺激下Nrf2可從Keap1中解離,與抗氧化類反應(yīng)元見(jiàn)進(jìn)行結(jié)合,進(jìn)而激活了HO-1等下游基因,最終使細(xì)胞的抗氧化能力得到增強(qiáng)[18,19]。HO-1可阻止游離血紅素參與氧化反應(yīng),同時(shí)HO-1可與其酶解產(chǎn)物相互協(xié)作起到了抑制細(xì)胞凋亡、改善組織微循環(huán)、抗氧化、擴(kuò)血管、抗炎的作用[20,21]。本文研究顯示,Nrf2/HO-1通路蛋白相對(duì)表達(dá)量在精索靜脈曲張發(fā)生后下降,經(jīng)miR-210下調(diào)干預(yù)后,Nrf2/HO-1通路蛋白相對(duì)表達(dá)量上升,表明miR-210下調(diào)可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路來(lái)抑制生精細(xì)胞凋亡,起到了阻止精索靜脈曲張大鼠附睪組織損傷的作用,為精子的發(fā)育、成熟提供了有利條件。

雖然本文認(rèn)為下調(diào)miR-210具有改善精索靜脈曲張的作用,其作用機(jī)制可能與Nrf2/HO-1通路被激活相關(guān),但僅為本文研究,未有研究分析其具體作用機(jī)制,因此上述研究需后續(xù)研究進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

綜上所述,本文研究顯示,精索靜脈曲張發(fā)生后伴隨精子密度、精子活動(dòng)度水平下降,等表現(xiàn),經(jīng)下調(diào)miR-210干預(yù)后可改善上述情況,其機(jī)制可能與Nrf2/HO-1通路被激活有關(guān)。