糖尿病腎病患者血清N/OFQ、IL-6的表達(dá)變化及相關(guān)性分析

柴丹 韓毅 侯文飛

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease,DKD)是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的首位病因,其患病率的增加與全球范圍內(nèi)糖尿病患病率的急劇上升相平行,大約40%的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者會(huì)出現(xiàn)這種微血管并發(fā)癥[1,2]。DKD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前普遍認(rèn)為其發(fā)生與代謝紊亂[3]、氧化應(yīng)激[4]、免疫炎性[5]、遺傳因素[6]、自噬[7]等多種因素有關(guān)。越來越多的流行病學(xué)和臨床前證據(jù)表明炎性質(zhì)反應(yīng)在DKD的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[8]。在DKD相關(guān)炎癥因子中,白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)與其關(guān)系最為緊密,因其介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,刺激腎小球硬化和腎小管間質(zhì)炎癥及纖維化[9]。內(nèi)源性孤啡肽(nociceptin/orphanin FQ,N/OFQ)是感覺神經(jīng)肽的一種,N/OFQ及其受體參與炎癥相關(guān)信號(hào)通路,誘導(dǎo)IL-6高表達(dá)[10],且在血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高親和力結(jié)合位點(diǎn),與多種大血管及微血管疾病有關(guān)[11],筆者發(fā)現(xiàn),鮮有N/OFQ與DKD的相關(guān)性研究。本研究通過觀察血清N/OFQ、IL-6在DKD患者中的水平變化,分析二者與DKD的相關(guān)性,旨在為DKD的早期識(shí)別和診治提供新的理論依據(jù)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2021年3月至2022年3月于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院確診的T2DM患者180例,其中男96例,女84例;年齡(58.31±1.54)歲;均符合1999年世界衛(wèi)生組織提出的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)和分型[12]。DKD采用2021年糖尿病腎臟疾病臨床診療中國指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn),即腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate,GFR)<60 ml·min-1·1.73 m-2和(或)尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin/creatinine ratio,ACR)≥30 mg/g持續(xù)>3個(gè)月[13]。根據(jù)ACR將180例患者分為正常白蛋白尿組60例(ACR<30 mg/g)、微量白蛋白尿組60例(30 mg/g≤ACR≤300 mg/g)和大量白蛋白尿組60例(ACR>300 mg/g)。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021-YX第059號(hào)),患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織公布的糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn),確診為T2DM的患者;(2)年齡30～70歲,相互無親緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)[14]:(1)原發(fā)性腎臟疾病者(例如:急慢性腎小球腎炎、免疫性及遺傳性腎病、腎盂腎炎、痛風(fēng)相關(guān)性腎病等);(2)其他因素所致尿微量白蛋白與尿糖異常改變者(例如泌尿系統(tǒng)感染、發(fā)熱、24 h內(nèi)有劇烈運(yùn)動(dòng)、頑固性高血壓、充血性心力衰竭、妊娠、酮癥酸中毒等);(3)伴全身其他重要臟器(心、肺、肝)功能衰竭;(4)尿沉渣有活動(dòng)表現(xiàn);(5)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類藥物開始治療后2～3個(gè)月內(nèi)GFR下降>30%;(6)癌癥、創(chuàng)傷、應(yīng)激及其他內(nèi)分泌疾病的患者;(7)1型糖尿病及腎損傷患者;(8)先天性智力障礙或依從性較差者。

1.3 方法

1.3.1 樣本量計(jì)算:采用公式n1=n2=2[(μα+μβ)/(δ/σ)]2+1/4μ2α進(jìn)行計(jì)算,n1和n2分別為DKD組和糖尿病腎病組所需含量;δ=μ1-μ2,為兩總體均數(shù)之差值,σ為總體標(biāo)準(zhǔn)差(此處假設(shè)兩總體標(biāo)準(zhǔn)差相等);μα和μβ分別為檢驗(yàn)水準(zhǔn)α和Ⅱ型錯(cuò)誤概率β相對應(yīng)的值。此處α取雙側(cè),μα=μ0.05/2=1.96;β取單側(cè),μβ=μ0.01=1.28。本研究未指定δ,因此對δ/σ進(jìn)行適當(dāng)假定,此處假定δ/σ=0.60,則本研究樣本量計(jì)算如下n1=n2=2[(1.96+1.28)/0.6]2+1/4×1.962=111.396≈60。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測:所有患者于入院第2天抽取非輸液側(cè)肘靜脈血進(jìn)行生化檢測,并收取24 h 尿液用于檢測尿微量白蛋白(mALB)和肌酐(Scr)水平,計(jì)算其估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)、ACR。采用高壓液相法測定糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測空腹血糖(FBG)、總膽固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。使用 Sysmex 全自動(dòng)血樣分析儀(日本 Sysmex 公司,XE-2100)測定中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT)及中性粒細(xì)胞百分比(NEU%)。

1.3.3 N/OFQ、IL-6水平檢測:于入院第2天清晨采集患者空腹非輸液側(cè)肘靜脈血 4 ml,于含有STTⅡ分離膠促凝劑的靜脈真空采血管中分離血清并儲(chǔ)存在-70℃冰箱中待測。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測血清N/OFQ及IL-6濃度(人N/OFQ ELISA試劑盒購自太原市云啟科貿(mào)有限公司,96T-JL19427;人IL-6 ELISA試劑盒購自太原市云啟科貿(mào)有限公司,96T-JL14113),嚴(yán)格按照 ELISA 試劑盒操作步驟,依次通過包被、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物液顯色、終止反應(yīng)和檢測吸光度(A)值完成標(biāo)本檢測。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 與正常白蛋白尿組相比,微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組合并糖尿病視網(wǎng)膜病變比例、糖尿病病程逐漸升高(P<0.05),3組患者的年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、吸煙及飲酒史、相關(guān)合并癥比例(高血壓、冠心病、腦血管病、糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病足)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般資料比較 n=60

2.2 生化指標(biāo)比較 與正常白蛋白尿組相比,微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組HbA1c、mALB、ACR逐漸升高(P<0.05)、eGFR逐漸降低(P<0.05);與微量白蛋白尿組相比,大量白蛋白尿組FBG、NEU%升高(P<0.05);3組患者的CHO、TG、HDL-C、LDL-C、NEUT等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組生化指標(biāo)比較 n=60,

2.3 N/OFQ、IL-6濃度比較 與正常白蛋白尿組相比較,微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組N/OFQ、IL-6逐漸升高(P<0.05);大量白蛋白尿組N/OFQ、IL-6水平高于微量白蛋白尿組(P<0.05)。見表3。

表3 3組血清N/OFQ、IL-6濃度比較 n=60,ng/L,

2.4 DKD患者血清N/OFQ、IL-6濃度與臨床各指標(biāo)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,糖尿病病程、FBG、HbA1c、mALB、ACR與血清N/OFQ、IL-6均呈正相關(guān)(P<0.05),eGFR與血清N/OFQ、IL-6均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),NEU%與血清N/OFQ呈正相關(guān)(P<0.05)，而與IL-6無相關(guān)性(P=0.257);血清N/

OFQ與IL-6水平呈正相關(guān)(P<0.001);血清N/OFQ、IL-6水平與年齡、性別、BMI、CHO、TG、HDL-C、LDL-C、mALB、NEUT無相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表4 DKD患者血清N/OFQ、IL-6與臨床各指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.5 T2DM患者并發(fā)DKD影響因素分析 以T2DM患者是否合并DKD作為因變量(0=否,1=是),將可能影響DKD的因素(年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病病程、FBG、HbA1c、TG、CHO、HDL-C、LDL-C、N/OFQ、IL-6)作為自變量納入Logistic回歸分析,其中分類數(shù)據(jù)賦值如下:糖尿病視網(wǎng)膜病變、吸煙、飲酒均為0=無,1=有;性別為0=女,1=男。結(jié)果顯示,合并糖尿病視網(wǎng)膜病變,糖尿病病程、HbA1c、LDL-C、N/OFQ、IL-6水平升高是T2DM并發(fā)DKD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05);其余因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 DKD影響因素的logistic回歸分析

2.6 N/OFQ、IL-6單項(xiàng)及二者聯(lián)合檢測對DKD的預(yù)測價(jià)值 以微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組為陽性樣本,以正常白蛋白尿組為陰性樣本,建立ROC診斷分析模型。結(jié)果顯示,N/OFQ預(yù)測DKD的ROC曲線下面積(AUC)為0.836(95%CI 0.764～0.909,P<0.001)。IL-6預(yù)測DKD的AUC為0.882(95%CI 0.826～0.938,P<0.001)。N/OFQ、IL-6二者聯(lián)合預(yù)測DKD的AUC為0.924(95%CI 0.887～0.961,P<0.001)。見圖1,表6。

圖1 N/OFQ、IL-6及二者聯(lián)合預(yù)測DKD發(fā)生的ROC曲線

表6 N/OFQ、IL-6單項(xiàng)及聯(lián)合檢測對DKD的預(yù)測價(jià)值

3 討論

DKD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,雖然高血糖、氧化應(yīng)激和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活是糖尿病相關(guān)腎損害的驅(qū)動(dòng)力,但大量證據(jù)指出炎性在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[15]。炎癥介質(zhì)升高后通過降低腎臟血流量和濾過率以及改變毛細(xì)血管壁的屏障功能導(dǎo)致糖尿病患者的腎損傷,一些針對特定炎癥介質(zhì)(細(xì)胞粘附分子、趨化因子和細(xì)胞因子)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的抗炎策略在實(shí)驗(yàn)性DKD模型中顯示出有利的效果,減少了蛋白尿和腎臟損害[16]。因此,深入研究DKD炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或其關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,對從炎癥角度早期識(shí)別、干預(yù)DKD進(jìn)展具有重要意義。

有研究表明,腎臟的炎癥標(biāo)志物與蛋白尿、細(xì)胞外基質(zhì)沉積以及腎小球?yàn)V過率進(jìn)行性下降相關(guān)[17]。DKD早期,白細(xì)胞釋放不同的促炎和促纖維化細(xì)胞因子,從而引發(fā)炎性和不可逆轉(zhuǎn)的纖維化過程[18]。近年來在研究DKD炎性因子中,IL-6的重要性為大家所關(guān)注:IL-6 mRNA廣泛存在于腎臟間質(zhì)及小管細(xì)胞中[19];IL-6水平在慢性腎病患者中顯著升高,并與白蛋白排泄和腎臟肥大相關(guān)[20,21]。本研究結(jié)果顯示,大量白蛋白尿組IL-6濃度明顯高于微量白蛋白尿組及正常白蛋白尿組,相關(guān)性分析結(jié)果中IL-6的水平與FBG、HbA1c、ACR、mALB呈正相關(guān)(r=0.213、0.260、0.562、0.548,P<0.05),與eGFR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.509,P<0.05),本研究結(jié)果表明在其他因素不變的情況下,IL-6每增加1 ng/L,T2DM患者并發(fā)DKD的危險(xiǎn)性增加55.0%,以上提示血清IL-6濃度與DKD病情的嚴(yán)重程度相關(guān),這與既往研究結(jié)果[22]一致。故推測其機(jī)制可能是IL-6 可促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素,而過量的IL-6會(huì)損傷胰島細(xì)胞進(jìn)而使得血糖升高[23]。此外,IL-6介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷:IL-6 結(jié)合于相應(yīng)的IL-6受體,通過JAK/STAT、NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積和肌成纖維細(xì)胞的分化或增殖,以上可能促進(jìn)腎小球基底膜增厚、足突消失和腎小管死亡,導(dǎo)致糖尿病患者腎臟不可逆的功能和結(jié)構(gòu)改變,從而表現(xiàn)為尿微量白蛋白不同程度的增加[24]。由以上可以推斷,DKD患者腎組織表達(dá)高水平的IL-6可能參與了DKD發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程,IL-6水平可作為臨床觀察DKD病情的一項(xiàng)參考指標(biāo)。

N/OFQ是一種新發(fā)現(xiàn)的與經(jīng)典阿片肽具有序列同源性的神經(jīng)肽,作用于非經(jīng)典的阿片受體,N/OFQ及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及外周器官中廣泛表達(dá)[25]。近年來N/OFQ在免疫功能方面的作用受到特別關(guān)注,已被描述為免疫調(diào)節(jié)分子的重要來源:N/OFQ誘導(dǎo)免疫細(xì)胞趨化性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和其他炎性介質(zhì)的表達(dá)以及控制細(xì)胞和體液免疫的能力;N/OFQ以濃度依賴的方式誘NF-κB核轉(zhuǎn)位、與DNA結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄[26]。既往研究表明,高血糖通過激活NF-κB通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子如IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)等的表達(dá)[19,27], 而IL-6等促炎細(xì)胞因子也可以通過NF-κB通路誘導(dǎo)N/OFQ的轉(zhuǎn)錄增加,從而形呈正反饋通路[28]。在體外和體內(nèi)研究的基礎(chǔ)上,N/OFQ增加了健康麻醉動(dòng)物和有膿毒性或炎性過程的動(dòng)物的炎性反應(yīng)[29],它影響組織灌注,增加毛細(xì)血管滲漏和炎性標(biāo)記物,并導(dǎo)致免疫細(xì)胞趨化性。進(jìn)一步研究中指出N/OFQ具有直接募集多形核白細(xì)胞的能力[30]。本研究中DKD患者NEU%雖控制在正常范圍內(nèi),但明顯高于T2DM患者,相關(guān)性分析結(jié)果中N/OFQ與NEU%呈正相關(guān)(r=0.166,P<0.05)。白細(xì)胞通過兩種不同的機(jī)制促進(jìn)腎損害:(1)腎小球和腎小管細(xì)胞的直接相互作用和激活;(2)釋放激活間質(zhì)腎細(xì)胞的趨化因子、細(xì)胞因子和促纖維化因子。此外,這些間質(zhì)腎細(xì)胞分泌額外的趨化因子,促進(jìn)白細(xì)胞的進(jìn)一步浸潤[31]。所有這些事件在正反饋回路中放大了炎性反應(yīng),從而增強(qiáng)了糖尿病患者的腎臟損傷。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組血清N/OFQ水平明顯高于正常白蛋白尿組,大量白蛋白尿組血清N/OFQ水平又明顯高于微量白蛋白尿組,即隨著DKD病情的進(jìn)展,N/OFQ濃度也在升高;相關(guān)性分析結(jié)果顯示,mALB、ACR與N/OFQ、IL-6均呈正相關(guān),eGFR與N/OFQ、IL-6均呈負(fù)相關(guān),且N/OFQ與IL-6之間呈正相關(guān);Logistic回歸分析結(jié)果顯示,血清N/OFQ、IL-6水平升高是T2DM患者合并DKD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示IL-6和N/OFQ與DKD密切相關(guān),并且在DKD的發(fā)生發(fā)展中可能起著協(xié)同作用。本研究結(jié)果還表明在其他因素不變的情況下,N/OFQ每增加1 ng/L,T2DM患者并發(fā)DKD的危險(xiǎn)性增加56.6%。結(jié)合上述研究推測DKD患者血清 N/OFQ 升高的機(jī)制可能與持續(xù)的高血糖激活NF-κB通路導(dǎo)致IL-6、TNF-α等炎性因子釋放增加進(jìn)而導(dǎo)致N/OFQ轉(zhuǎn)錄增加有關(guān),N/OFQ可能通過IL-6介導(dǎo)的炎性機(jī)制直接或間接參與腎臟血管內(nèi)膜的損害,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)纖維化等病理生理過程。最后,本研究中N/OFQ、IL-6單項(xiàng)及聯(lián)合檢測對DKD預(yù)測價(jià)值結(jié)果顯示,檢測N/OFQ、IL-6均可作為DKD的預(yù)測因子(AUC=0.836、0.882),二者聯(lián)合預(yù)測DKD明顯高于單項(xiàng)檢測(AUC=0.924,P<0.001),提示聯(lián)合檢測血清N/OFQ、IL-6對DKD的預(yù)測價(jià)值更高,二者可作為觀察DKD病情進(jìn)展的參考指標(biāo)。

糖尿病病程的長短與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)[32]。一項(xiàng)對T2DM患者并發(fā)DKD的回顧性研究證實(shí),糖尿病病程是DKD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測因素[33]。糖尿病患者由于長期的糖代謝紊亂,血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損,進(jìn)而使得腎臟組織極易發(fā)生微血管病變[34]。本研究結(jié)果中糖尿病病程是T2DM患者并發(fā)DKD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,在其他因素不變的情況下,糖尿病病程每增加1年,T2DM患者發(fā)生DKD的危險(xiǎn)性增加56.8%?？紤]為隨著患者患病時(shí)間的增加,患者的微血管病變逐漸加重,導(dǎo)致其不同程度的腎功能損傷,引起患者尿微量白蛋白的增加,這與Ahmad等[35]研究的情況相符。由此可見,T2DM患者應(yīng)每年至少進(jìn)行1次mALB或ACR的篩查,有利于早發(fā)現(xiàn)是否并發(fā)腎臟損傷。

糖尿病視網(wǎng)膜病變也是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥,被NKF/KDOQI指南作為DKD的診斷依據(jù)之一[36]。糖尿病視網(wǎng)膜病變與DKD有共同的發(fā)病機(jī)制:AGEs、ROS、蛋白激酶C、炎性因子等,導(dǎo)致血管視網(wǎng)膜組織屏障和進(jìn)行性腎功能障礙的破壞[37],使得兩者的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)聯(lián)性。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生常早于DKD,大部分DKD患者患有糖尿病視網(wǎng)膜病變[38]。本研究針對糖尿病視網(wǎng)膜病變對T2DM患者腎臟損傷的影響進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析發(fā)現(xiàn),合并糖尿病視網(wǎng)膜病變是T2DM患者腎臟損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,即在其他因素不變的情況下,合并糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者比未合并糖尿病視網(wǎng)膜病變患者出現(xiàn)腎臟損傷的風(fēng)險(xiǎn)高12.2%,這與其他研究結(jié)果[39]一致。對T2DM患者定期進(jìn)行眼底檢查,有利于幫助其早期診斷DKD。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,DKD患者血清中N/OFQ、IL-6含量明顯升高且存在相關(guān)性,N/OFQ、IL-6是2型糖尿病患者并發(fā)DKD的危險(xiǎn)因素,通過檢測2型糖尿病患者血清N/OFQ、IL-6的水平可為DKD的早期篩查和臨床干預(yù)提供新思路。