CNV-seq技術(shù)在輔助生殖技術(shù)妊娠流產(chǎn)胚胎染色體異常中的研究?jī)r(jià)值

石國(guó)西，翟俊英，鈕紅麗，劉波

（1.南陽市第一人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，河南 南陽 473000；2.河南省人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 475000 ）

早期流產(chǎn)是指胎兒體重不足1 000 g、孕周不足28 周，胎兒等附屬物從母體脫離，妊娠過程自然終止，大部分自然妊娠流產(chǎn)均發(fā)生與妊娠12 周之前［1］。目前，臨床普遍認(rèn)為誘發(fā)自然流產(chǎn)的原因有免疫功能異常、環(huán)境因素、母體因素、胚胎因素等，將近50%的自然妊娠流產(chǎn)與染色體異常有關(guān)［2-3］。近年來，隨著輔助生殖技術(shù)（ART）的發(fā)展，雖然給諸多不孕癥患者帶來了福音，但由于ART 造成的染色體異常妊娠流產(chǎn)率明顯增高，現(xiàn)已引起臨床高度重視［4］。低深度全基因組測(cè)序技術(shù)（CNV-seq）具有基因組覆蓋率高、準(zhǔn)確性高、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，可分析染色體有無畸變，幫助醫(yī)生判斷妊娠流產(chǎn)的遺傳學(xué)病因［5-6］?；诖?，為探究CNV-seq 在ART 妊娠流產(chǎn)胚胎染色體異常中的臨床價(jià)值，本文選定南陽市第一人民醫(yī)院2020 年6 月至2022 年6 月接診的98 例ART 妊娠流產(chǎn)患者研究，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選定南陽市第一人民醫(yī)院2020 年6 月至2022年6 月接診的98 例ART 妊娠流產(chǎn)患者，年齡23～40 歲，平均（31.52±3.04）歲；孕周5～25 周，平均（15.62±1.64）周；孕次1～5 次，平均（3.16±1.34）次；流產(chǎn)次數(shù)0～4 次，平均（2.06±0.76）次；體重指 數(shù)（BMI）21～27 kg/m2，平 均（23.72±1.11）kg/m2。研究經(jīng)南陽市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)B 超檢查：確認(rèn)胚胎停育。②年齡20～40 周歲。③神志清楚，可配合醫(yī)生完成本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并狂躁癥等精神系統(tǒng)疾病者。②同期參與其他研究者。③存在妊娠期感染以及有害物質(zhì)接觸史者。

1.2 方法

CNV-seq 檢測(cè)方法：①準(zhǔn)備樣本：采集所有患者流產(chǎn)物（胚胎組織或絨毛）100 mg，以0.9%的氯化鈉溶液清洗干凈，置于無菌采樣管中，放置在-20℃的冰箱保存，采用QIAamp DNeasy Blood&Tissue Kit 提取流產(chǎn)物中的DNA，所提取DNA的濃度必須在20 ng/μL 以上，總量在500 ng 以上。②檢查方法：用超聲波進(jìn)行末端修復(fù)，加入接頭、A 尾、引物PCR，構(gòu)建DAN 文庫，采用QF-PCR以及Agilent 定量質(zhì)控文庫，以Nextseq550AR 測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，每一個(gè)測(cè)序標(biāo)簽應(yīng)匹配對(duì)應(yīng)的染色體，分析標(biāo)準(zhǔn)化Z值，判定染色體異常情況。③染色體G 顯帶核型檢查：抽取羊水20 mL，進(jìn)行細(xì)胞接種，每一個(gè)孕婦的樣本，均展開兩線培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d 左右，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，再次換液培養(yǎng)，培養(yǎng)1～2 d 展開細(xì)胞收獲、染色制片以及核型分析。④質(zhì)量控制：本次研究所有受檢者的流產(chǎn)物均由同2 名醫(yī)生完成檢測(cè)、結(jié)果判定，對(duì)于存在異議的地方，應(yīng)再次討論或者介入第3 名醫(yī)生參與診斷，確定最終診斷結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)染色體異常率、異常染色體分布情況，分析孕婦既往流產(chǎn)次數(shù)、孕周、年齡與染色體異常發(fā)生率的關(guān)系，比較既往自然流產(chǎn)次數(shù)≥3 次者、＜3 次者染色體異常率，比較孕周≥12 周、＜12 周者染色體異常率，比較孕婦年齡≥35 歲、＜35 歲者染色體異常率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理選擇SPSS 26.0 軟件，計(jì)量資料正態(tài)分布t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；計(jì)數(shù)資料χ2檢驗(yàn)，以百分率（%）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CNV-seq 檢查結(jié)果與核型檢查結(jié)果比較

98 例患者共檢出染色體異常70 例，染色體異常率為71.43%，以常染色體重排或缺失、45,X 染色體異常最為常見，異常率為14.29%。CNV-seq檢查結(jié)果與核型檢查結(jié)果僅有5 例不一致，其余檢查結(jié)果均一致。見表1。

2.2 自然流產(chǎn)次數(shù)≥3 次、＜3 次染色體異常發(fā)生率比較

染色體異常發(fā)生率自然流產(chǎn)次數(shù)≥3 次者高于自然流產(chǎn)次數(shù)＜3 次者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.247,P=0.039）。見表2。

表2 自然流產(chǎn)次數(shù)≥3 次、＜3 次染色體異常發(fā)生率比較［n(%)］

2.3 孕周≥12 周、＜12 周染色體異常發(fā)生率比較

孕周≥12 周者染色體異常發(fā)生率低于孕周＜12周者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.350,P=0.007）。見表3。

表3 孕周≥12 周、＜12 周染色體異常發(fā)生率比較［n(%)］

2.4 年齡≥35 歲、＜35 歲染色體異常發(fā)生率比較

染色體異常發(fā)生率年齡≥35 歲者高于年齡＜35歲者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.059,P=0.044）。見表4。

表4 年齡≥35 歲、＜35 歲染色體異常發(fā)生率比較［n(%)］

2.5 隨訪結(jié)果

對(duì)CNV-seq 檢查結(jié)果與核型檢查結(jié)果不一致的患者進(jìn)行隨訪，其中2 例足月分娩，胎兒未見明顯異常。2 例足月分娩，胎兒出生后存在心臟異常，1 例低比例嵌合。

3 討論

近年來，隨著人們生活壓力增大，性觀念改變，由于不孕癥而接受ART 的人群明顯增多，從而導(dǎo)致ART 妊娠流產(chǎn)率顯著增高［7］。妊娠流產(chǎn)作為一種妊娠病理性疾病，會(huì)對(duì)孕婦的生命安全、身體健康構(gòu)成一定威脅［8］。臨床有研究［9］表明：染色體異常是引發(fā)自然流產(chǎn)、不良妊娠結(jié)局的重要原因之一。既往臨床檢測(cè)染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)是核型分析檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)對(duì)采集樣品的處理要求較高，檢測(cè)過程繁瑣復(fù)雜，且樣品培養(yǎng)需要耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，培養(yǎng)失敗率較高，并未在臨床中廣泛推廣開來［10］。故尋求一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)，分析ART 妊娠流產(chǎn)患者染色體異常情況及分布，成為目前臨床高度關(guān)注的內(nèi)容。

CNV-seq 檢測(cè)能力較強(qiáng)，可以在同一平臺(tái)同時(shí)檢測(cè)上萬個(gè)測(cè)序技術(shù)，與生物學(xué)信息相結(jié)合，一次性檢測(cè)23 對(duì)染色體，及早發(fā)現(xiàn)染色體重排或者缺失等情況，CNV-seq 對(duì)檢測(cè)樣品的要求較低，可重復(fù)檢查，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的不足［11-12］。通過CNV-seq 檢測(cè)，可及早發(fā)現(xiàn)染色體異常，如果未發(fā)現(xiàn)染色體畸變，則可以將染色體畸變的影響排除，考慮妊娠流產(chǎn)是否與感染、免疫、精子異常等有關(guān)［13］。如果CNV-seq 檢測(cè)中染色體畸變是重復(fù)或者缺失，則需要進(jìn)一步分析妊娠流產(chǎn)的染色體異常是家族遺傳或者新發(fā)變異，必要時(shí)夫妻雙方均要做CNV-seq 檢測(cè)，評(píng)估SNT 多態(tài)性對(duì)妊娠流產(chǎn)的影響。本研究顯示：98 例患者染色體異常率為71.43%，以常染色體重排或缺失、45,X 染色體異常最為常見，異常率為14.29%。提示ART妊娠流產(chǎn)的染色體異常率較高，與既往報(bào)道［14］的ART 妊娠流產(chǎn)染色體異常率在50% 以上接近。CNV-seq 檢測(cè)技術(shù)具有無需細(xì)胞培養(yǎng)、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，臨床可考慮將其作為染色體異常篩查的主要方法。但CNV-seq 技術(shù)也存在一定不足，例如堿基缺失或插入、無法檢出低水平點(diǎn)變異、嵌合體、不能檢出平衡倒位及異位等。本研究顯示：CNV-seq 檢查結(jié)果與核型檢查結(jié)果僅有5 例不一致，其余檢查結(jié)果均一致。由此可見，對(duì)ART 患者及早進(jìn)行產(chǎn)前診斷至關(guān)重要，通過CNV-seq 技術(shù)檢查，可提高對(duì)部分染色體微重復(fù)、微缺失的檢出率，染色體微重復(fù)、微缺失容易引發(fā)內(nèi)臟器官畸形、智力發(fā)育遲緩、生長(zhǎng)發(fā)育異常等復(fù)雜臨床表型，通過CNV-seq 技術(shù)檢查，可最大限度的提高染色體異常檢出率。

本研究顯示：染色體異常發(fā)生率自然流產(chǎn)次數(shù)≥3 次者（90.00%）高于自然流產(chǎn)次數(shù)＜3 次者（66.67%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明染色體異常多見于自然妊娠流產(chǎn)次數(shù)多的女性。故目前臨床對(duì)于上一次存在不良孕產(chǎn)史或自然流產(chǎn)史的女性，下一次妊娠時(shí)在孕早期或孕中期應(yīng)及時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，判斷胎兒染色體核型是否正常，如果正常，即可保留此胎，如果不正常，則需要及時(shí)與胎兒父母取得聯(lián)系，征求胎兒父母的意見，決定是否保留胎兒。本研究顯示：孕周≥12 周者染色體異常發(fā)生率（57.14%）低于孕周＜12 周者（82.14%）（P＜0.05）。表明ART 自然流產(chǎn)染色體異常多發(fā)生于妊娠12 周之內(nèi)。

本研究顯示：染色體異常發(fā)生率年齡≥35 歲者（82.50%）高于年齡＜35 歲者（63.79%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明孕婦妊娠年齡在35 周歲以上，更容易出現(xiàn)染色體異常。分析如下：母體年齡對(duì)妊娠結(jié)局的影響是非常大的，臨床有研究表明：母體妊娠時(shí)的年齡與非整倍體子代發(fā)生率呈正相關(guān)性［15］。主要是由于首次減數(shù)分裂處于S1 期的卵母細(xì)胞在機(jī)體停留時(shí)間越長(zhǎng)，減數(shù)分裂S2 期發(fā)生異常以及卵細(xì)胞異常率就越高［16-17］。故臨床將高齡作為ART 妊娠流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素。女性隨著年齡的增長(zhǎng)，卵巢功能也會(huì)逐漸減退，對(duì)同對(duì)染色體間相互關(guān)系造成不良影響。另外，年齡大的女性，卵巢功能老化，黃體酮、雌激素含量均降低，從而造成卵泡紡錘體老化，有絲分裂染色體堿基對(duì)分離不完全或者不分離，進(jìn)而增加三體發(fā)生率［18］。在張哲慧等［19］研究中，通過Logistic 回歸分析，年齡是胚胎染色體異常的危險(xiǎn)因素（P=0.002,95%CI：1.038～1.179），接近本研究結(jié)果。

綜上所述：ART 妊娠流產(chǎn)在孕早期的發(fā)生率較高，通過CNV-seq 技術(shù)，可提高染色體異常檢出率，年齡≥35 周歲、既往自然流產(chǎn)次數(shù)≥2 次的ART 患者更容易出現(xiàn)染色體異常，臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)此類人群的關(guān)注，及早評(píng)估其自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，及早給予針對(duì)性處理，最大限度改善妊娠結(jié)局。