皇帝蕉組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究

樊憲偉,李志芳,韓向峰,王廣琪

(1 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,南寧,530004;2 廣東佛山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,廣東佛山,528145)

皇帝蕉MusaparadisiacaAA是我國(guó)南方種植重要草本果樹(shù),又被稱(chēng)為貢蕉、甜蕉、帝王蕉等,其果實(shí)較小巧,皮較薄,含糖量高,營(yíng)養(yǎng)豐富,且有特殊的芳香味,廣受大眾喜愛(ài),較普通香蕉具有更高的商品價(jià)值[1-3]。由于皇帝蕉多以芽進(jìn)行無(wú)性繁殖,生產(chǎn)中易受尖孢鐮刀菌等真菌為害,致使皇帝蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)下降[5]。因此,建立皇帝蕉快速組織培養(yǎng)體系是脫毒、預(yù)防真菌病害的有效途徑。 國(guó)內(nèi)皇帝蕉栽培技術(shù)方面研究較多[2,5-6],組織培養(yǎng)方面相對(duì)較少。朱靖杰等[7]首次利用試管苗莖段薄片誘導(dǎo)出胚性愈傷組織,進(jìn)一步分化為芽,獲得再生植株。王麗萍等[8]利用吸芽為外植體,通過(guò)消毒處理和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合建立了皇帝蕉快速繁殖體系。本研究利用皇帝蕉球莖,優(yōu)化培養(yǎng)消毒處理和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合,建立了皇帝蕉組織培養(yǎng)簡(jiǎn)化體系,為皇帝蕉生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2011年5月采自佛山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所大田引種的皇帝蕉種苗供試,選健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的地下球莖作為外植體。

1.2 方法

外植體消毒方法篩選:采取健壯外植體,去除泥土、根等雜物洗凈后剝?nèi)ネ鈱尤~鞘,用洗潔精擦洗,再用自來(lái)水流水沖洗30 min,將材料放置在超凈工作臺(tái)上。設(shè)置不同消毒方式處理,即75%酒精30 s+0.1%升汞15 min;75%酒精30 s+0.1%升汞10 min;75%酒精30 s+0.1%升汞10 min消毒兩次(第一次消毒后的酒精和汞回收再次使用)等3個(gè)處理。消毒后球莖切成1 cm3塊,迅速放入初代培養(yǎng)基,即MS+細(xì)胞分裂素6-芐氨基嘌呤1.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L中培養(yǎng),每個(gè)外植體單獨(dú)放1瓶,每處理復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)10瓶,10 d后調(diào)查3種不同消毒處理的污染情況及發(fā)芽狀態(tài),污染率(%)=污染數(shù)/接種數(shù)×100。

繼代、生根培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基每升添加蔗糖30 g、瓊脂5.5 g,pH值5.8～6.0。

增殖培養(yǎng)基:以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加不同濃度6-芐氨基嘌呤、吲哚乙酸等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)吸芽萌發(fā)、增殖,即MS+6-芐氨基嘌呤1.0 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L、MS+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L和MS+6-芐氨基嘌呤2.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L等3個(gè)處理,篩選適宜的增殖培養(yǎng)基。

生根培養(yǎng)基:以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,設(shè)置1/2MS+吲哚乙酸0.4 mg/L和1/2MS+吲哚乙酸0.2 mg/L兩個(gè)處理。

繼代試驗(yàn)每瓶接種芽苗10株,重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)接種5瓶,30 d后調(diào)查平均分化系數(shù)及芽體生長(zhǎng)情況,平均分化系數(shù)(%)=分化不定芽株數(shù)/接種株數(shù)×100;生根試驗(yàn)每瓶接種芽苗12株,重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)接種6瓶,20 d后調(diào)查生根率、有效生根率及根系生長(zhǎng)情況,生根率(%)=生根株數(shù)/接種株數(shù)×100,有效生根率(%)=具有2條以上粗壯根株數(shù)/接種株數(shù)×100。

除初培和生根試驗(yàn)需要暗培養(yǎng),其余試驗(yàn)培養(yǎng)光照均為1 500～2 000 Lx,溫度(23±2) ℃,每2～3 d觀察1次,并做好記錄。通過(guò)初培、繼代、生根培養(yǎng)試驗(yàn),篩選快速繁殖的最佳培養(yǎng)處理。

煉苗試驗(yàn)方法:先進(jìn)行3 d閉瓶煉苗,再經(jīng)過(guò)3 d開(kāi)瓶煉苗,然后將生根幼苗從培養(yǎng)瓶慢慢取出,用流水輕輕沖洗掉根系上的培養(yǎng)基,并用0.1%多菌靈殺菌液清洗;最后將幼苗分別種植在消毒后不同基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)盤(pán)中,即設(shè)置泥炭土、塘泥+椰糠、椰糠等3種不同基質(zhì),重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)生根苗約40株,20 d后統(tǒng)計(jì)煉苗成活率,成活率(%)=成活株數(shù)/種植株數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行多重比較或T-test,在p<0.05時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)情況

皇帝蕉外植體在初代培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)不同程度褐變,接種時(shí)間越短,褐變?cè)捷p;培養(yǎng)1周后外植體開(kāi)始膨大,由最初的乳白色逐漸轉(zhuǎn)綠;生長(zhǎng)點(diǎn)部位開(kāi)始凸起,10 d左右開(kāi)始露出芽點(diǎn);15～20 d后,中心生長(zhǎng)點(diǎn)周?chē)_(kāi)始出現(xiàn)許多淡黃或淺綠色的不定芽,然后逐漸轉(zhuǎn)為黃綠,漸漸長(zhǎng)出許多葉片變成完整芽體(見(jiàn)圖1)。

圖1 皇帝蕉組培及田間種植生長(zhǎng)情況

2.2 不同消毒處理的影響

消毒處理的外植體培養(yǎng)3 d,部分材料發(fā)生少量細(xì)菌污染,5 d部分材料出現(xiàn)霉菌污染,10 d調(diào)查污染率發(fā)現(xiàn),75%酒精30 s+0.1%升汞15 min處理的污染率較低,為33.3%,污染少,褐變重,出芽少,少量死亡,誘導(dǎo)出芽少;75%酒精30 s+0.1% 升汞10 min處理的污染率為43.3%,褐變較輕,菌少,出芽較多;消毒兩次處理的污染率最高,為50.0%,褐變輕,細(xì)菌污染較多,與75%酒精30 s+0.1%升汞15 min處理的污染率差異顯著(見(jiàn)表1)。結(jié)合污染及生長(zhǎng)情況認(rèn)為,75%酒精30 s+0.1%升汞10 min消毒處理對(duì)初代培養(yǎng)效果較好。

表1 不同消毒處理對(duì)初代培養(yǎng)及不同增殖培養(yǎng)基對(duì)不定芽增殖的影響

2.3 不同增殖培養(yǎng)基的影響

不同增殖培養(yǎng)基處理的不定芽增殖存在顯著性差異,MS+6-芐氨基嘌呤2.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L處理的不定芽增殖效果最好。3個(gè)增殖培養(yǎng)基中,隨著6-芐氨基嘌呤處理濃度升高,繼代苗的生根量減少,只有個(gè)別大芽有生根現(xiàn)象(見(jiàn)表1和圖1)。

2.4 不同濃度吲哚乙酸對(duì)生根的影響

皇帝蕉易生根,在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d時(shí)產(chǎn)生少量根,培養(yǎng)10 d后大部分組培苗生根,根長(zhǎng)1 cm左右,且無(wú)愈傷組織產(chǎn)生(見(jiàn)圖1)。1/2MS +吲哚乙酸0.4 mg/L處理的生根率為94.0%,有效生根率(單株生根數(shù)>2條)為86.0%,單株多為4條根,根粗壯,生根效果較好;1/2MS+吲哚乙酸0.2 mg/L處理的生根率為89.5%,有效生根率為80.0%,單株生根2～3條,單根較多,根細(xì),生根效果一般,2個(gè)處理之間無(wú)顯著性差異(見(jiàn)表2)。2個(gè)處理隨著吲哚乙酸濃度增加,單株生根量增加,根也較粗壯,有效生根率也提高。

表2 不同濃度吲哚乙酸對(duì)皇帝蕉組培苗生根及基質(zhì)對(duì)移栽的影響

2.5 不同基質(zhì)的影響

3個(gè)基質(zhì)處理的移栽成活率無(wú)顯著性差異,移栽成活率均大于97%(見(jiàn)表2)?；实劢渡L(zhǎng)對(duì)土質(zhì)要求不嚴(yán)格,在泥炭土、椰糠、塘泥+椰糠的基質(zhì)上均能良好生長(zhǎng)。因此,只要溫濕度和光照合適,皇帝蕉組培苗生長(zhǎng)勢(shì)都較強(qiáng),供試基質(zhì)對(duì)煉苗成活率無(wú)顯著性影響,均能達(dá)到較好的煉苗效果(見(jiàn)圖1);組培苗營(yíng)養(yǎng)情況差異也較小,只要后期肥水管理到位,對(duì)成品苗的生長(zhǎng)并無(wú)影響。

2.6 組培苗田間生長(zhǎng)情況

田間觀察發(fā)現(xiàn),皇帝蕉組培苗生長(zhǎng)整齊度高,染病少,組培皇帝蕉果指中大,口感甜,產(chǎn)量高,品質(zhì)好(見(jiàn)圖1)。巴西蕉是當(dāng)?shù)叵憬吨髟云贩N,產(chǎn)量是皇帝蕉的2倍多;但巴西蕉田間批發(fā)價(jià)格較低,最高2元/kg左右,而皇帝蕉批發(fā)價(jià)5元/kg左右,皇帝蕉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值比巴西蕉高。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)中,皇帝蕉外植體不同消毒處理后污染率偏高,可能由于當(dāng)時(shí)采樣期間連續(xù)降雨高溫,材料采自泥水浸泡的地下塊莖部分,外植體攜帶菌群較多,組培條件菌類(lèi)繁殖速度快且多;若在干旱少雨季節(jié)取材料,污染率應(yīng)該會(huì)降低,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng),升汞對(duì)植物的毒害殺傷作用也越強(qiáng),輕者殺傷褐變,影響芽萌發(fā),重者直接導(dǎo)致材料死亡。鑒于升汞對(duì)環(huán)境具有污染性,后期試驗(yàn)可嘗試用次氯酸鈉或其他消毒劑代替升汞作為外植體的消毒試劑。

香蕉組織培養(yǎng)中容易發(fā)生褐化。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),皇帝蕉在組織培養(yǎng)過(guò)程中較其他植物材料易褐變,且褐變嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響皇帝蕉發(fā)芽,創(chuàng)傷面越大褐變?cè)絽柡?材料越老越容易褐變;隨著繼代次數(shù)增加和創(chuàng)傷面減小,褐變現(xiàn)象會(huì)減輕,說(shuō)明幼嫩組織褐變輕。因此,選取外植體時(shí)應(yīng)盡量靠近地上部分新生芽,較小的吸芽作為外植體可能會(huì)減少污染及減輕褐變現(xiàn)象。

細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素濃度配比是決定組織培養(yǎng)誘導(dǎo)叢生芽的關(guān)鍵因素。王麗萍等[8]研究指出,6-芐氨基嘌呤3.0 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L時(shí)皇帝蕉增殖較快。本研究采用初代培養(yǎng)基進(jìn)行吸芽誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)增加細(xì)胞分裂素——6-芐氨基嘌呤的濃度,即MS+6-芐氨基嘌呤2.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L時(shí),皇帝蕉增殖最快,分化不定芽系數(shù)達(dá)到3.3;且不定芽無(wú)玻璃苗,芽體飽滿(mǎn),長(zhǎng)勢(shì)健壯。有研究發(fā)現(xiàn),采用MS+3-吲哚丁酸2.5 mg/L+萘乙酸0.2 mg/L最適合皇帝蕉幼苗促根培養(yǎng)[8]。本研究發(fā)現(xiàn),1/2MS+吲哚乙酸0.4 mg/L生根培養(yǎng)基效果較好,生根率達(dá)到94%,根系健壯、發(fā)達(dá),這也是煉苗期間皇帝蕉成活率高的基礎(chǔ)?；实劢渡蛋l(fā)達(dá),煉苗期間對(duì)不同基質(zhì)適應(yīng)性廣,成活率均在97%以上。田間觀察發(fā)現(xiàn),供試皇帝蕉組織培養(yǎng)苗生長(zhǎng)速度快,整齊度高,無(wú)病毒病和尖孢鐮刀菌枯萎病發(fā)生。