3D 打印磷酸鈣涂層多孔鎂金屬支架的力學(xué)性能和生物相容性評估

葉健廷，繆鉑尊，熊英杰，孟昊業(yè)，單驗博，孫小涵，盧雨征,4，武艷斌，林萬程,4，關(guān)聰聰，劉修志，王 鑫，許文靜，袁廣銀，彭 江，周成福

1 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，黑龍江佳木斯 154000；2 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科醫(yī)學(xué)部研究所，北京 100853；3 上海交通大學(xué)輕合金精密成型國家工程研究中心，上海 200240；4 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院骨科，北京 100038

外傷、感染、人工關(guān)節(jié)失用等原因所致負(fù)重部位骨松質(zhì)缺損的治療是骨科面臨的一大挑戰(zhàn)[1]。負(fù)重部位骨松質(zhì)的修復(fù)強調(diào)整體化置入，置入材料必須保證力學(xué)結(jié)構(gòu)的完整性，同時與周圍骨床盡快實現(xiàn)整合，便于傳遞載荷。多孔鈦、鉭等金屬置入是目前有效的解決方法，但存在不可降解性、應(yīng)力遮擋等缺點。生物陶瓷類材料因具有較好的生物相容性，受到科學(xué)家的青睞，但脆性等缺點限制了其在臨床中推廣[2-3]。不銹鋼、金屬坦棒、鈦金屬等臨床常用金屬能為骨松質(zhì)缺損區(qū)提供足夠的力學(xué)支撐，其不可降解性及高彈性模數(shù)等缺陷極易引發(fā)應(yīng)力屏蔽和二次骨折，且上述金屬缺乏生物活性，無法與周圍組織實現(xiàn)快速整合[4]。生物可降解鎂金屬具有良好的生物相容性、優(yōu)異的力學(xué)性能、生物可降解性，降解產(chǎn)物鎂離子又是人體內(nèi)必須元素之一，這使其逐漸走向前臺[5-7]。但金屬鎂存在過快降解和大量產(chǎn)氣等缺點。人們逐漸意識到鎂金屬表面添加涂層的重要性[8]。將鎂金屬與各種生物活性涂層結(jié)合可克服局部嚴(yán)重產(chǎn)氣這一缺點?；诒狙芯克捌谘芯縖9]，采用選擇性激光熔化工藝制備多孔鎂金屬支架，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法在純鎂金屬表面制備生物可降解磷酸鈣涂層；本文側(cè)重探討磷酸鈣涂層多孔鎂金屬支架的力學(xué)性能和生物相容性。

材料與方法

1 主要材料、試劑與儀器 鎂粉(威豪，中國)；胎牛血清(Gibco，美國)；青-鏈霉素雙抗(Gibco 15070063)； 胰酶(Gibco 15050065)；磷酸鹽緩沖液(CORNING 21-031-CV)；α-MEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國)；CCK-8 試劑盒(碧云天，中國)；選擇性激光熔化機器(Solution，德國)；體視顯微鏡(Nikon DSRi2)；酶標(biāo)儀(Biotek，美國)；掃描電子顯微鏡(Hitachi，日本)。

2 多孔鎂金屬支架的制備 利用Rhinoceros 6.0軟件設(shè)計一種零平均曲率的三周期極小曲面結(jié)構(gòu)。調(diào)整支架厚度，支架的孔隙率為75%，平均孔徑為800 μm，支架的表面積/體積比為3.0 mm-1。制備過程中，惰性氣體中氧含量低于1/10 000，使用選擇性激光熔化機器將支架構(gòu)建在鎂基板上。采用氣體霧化法制備球形鎂粉末，并用于激光粉末熔煉。在能量密度為83.3 J/mm3、相鄰層間旋轉(zhuǎn)角度為73°的參數(shù)中打印，然后通過電火花加工將樣品從構(gòu)建板上移回，并在70%乙醇中超聲清洗10 min，以去除未粘連的松散粉末。最后支架在10%高氯酸和90% C2H5OH 組成的電解液中經(jīng)電化學(xué)拋光。

3 涂層的制備 采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法在多孔鎂金屬表面制備Ca-P 生物活性涂層。首先將60℃的NaOH/Na2CO3溶液1∶1 混合均勻，超聲清洗多孔鎂支架。去離子水和無水乙醇沖洗干凈、晾干。將晾干后的多孔鎂金屬支架浸泡于鈣磷處理溶液中12 h，用去離子水和無水乙醇清洗后晾干，即可獲得有鈣磷涂層的多孔鎂支架。

4 支架材料的物理表征 利用體視顯微鏡觀察無涂層多孔鎂金屬支架及Ca-P 涂層支架的外觀。通過掃描電子顯微鏡和能量色散X 線能譜(Energydispersive X-ray spectrometry，EDS)觀察磷酸鈣涂層鎂基支架的表面形貌和元素組成。

5 力學(xué)性能試驗 圓柱多孔鎂金屬支架固定于電子萬能試驗機托盤上，分別在X 軸和Z 軸方向上壓縮。調(diào)整位移速率為1 mm/min。自動記錄載荷-位移曲線，直至位移達到3.0 mm。并繪制出應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

6 制備浸提液 首先用75%乙醇將10 mm ×3 mm 的多孔鎂金屬支架消毒20 min 以上，密封袋封裝，鈷60 消毒。按照GB/T 16886.12-2017 和ISO 10993-12 標(biāo)準(zhǔn)，按照樣品表面積與溶液體積比1.25 cm2/mL 將支架浸泡在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的α-MEM 中，置于培養(yǎng)箱(5% CO2，37℃)中。72 h 后吸出浸提液，4℃保存用于后續(xù)實驗。

7 細(xì)胞增殖實驗 小鼠來源的胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)購于上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。在所有體外實驗中均采用第4 ～ 6 代MC3T3-E1 細(xì)胞。支架提取物用于細(xì)胞培養(yǎng)。將圓盤樣品(Φ10 × 3 mm)浸入3 mL 含10%胎牛血清的3 mL完全培養(yǎng)基中，100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。然后將MC3T3-E1 以每孔3 × 103/mL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種后第1 天細(xì)胞完全貼壁后，將浸提液取代完全培養(yǎng)基。細(xì)胞在37℃、5% CO2中孵育1 d、3 d、5 d 進行細(xì)胞增殖實驗，將完全培養(yǎng)基組設(shè)為空白對照組。CCK-8 試劑盒用于評估每孔培養(yǎng)1.5 h 后的活細(xì)胞數(shù)，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測量光密度(OD)值。

8 細(xì)胞黏附實驗 由于無磷酸鈣涂層鎂金屬降解過程中有明顯氣體產(chǎn)生，表面不適于接種細(xì)胞，因此細(xì)胞黏附實驗僅在磷酸鈣涂層支架進行。將MC3T3-E1 以1 × 104/孔接種于24 孔板無菌支架，培養(yǎng)7 d。接種細(xì)胞的支架用PBS 沖洗，在4.0%甲醛溶液中固定2 h，然后依次在50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液中脫水。CO2臨界點干燥除乙醇后噴金，掃描電鏡觀察。

9 細(xì)胞活性實驗 用活死染色評估細(xì)胞的活性。活死染色實驗僅在浸提液培養(yǎng)下進行。MC3T3-E1以1 × 104/孔接種于24 孔板，待細(xì)胞貼壁后換支架浸提液培養(yǎng)72 h，將完全培養(yǎng)基組設(shè)為空白對照組，然后用500 μL 的混合染料染色10 min，體視顯微鏡觀察。與鈣黃素-AM 結(jié)合的活細(xì)胞呈綠色，而與乙錠-高二聚體-1 結(jié)合的死亡細(xì)胞呈紅色。

10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析以及繪圖，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析(Dunnett-t檢驗)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 支架表面結(jié)構(gòu) 無涂層多孔鎂金屬支架及Ca-P涂層支架均具有高度相互聯(lián)通的大孔(圖1)。無涂層多孔鎂金屬支架呈現(xiàn)三維貫通的開孔結(jié)構(gòu)且孔壁表面較光滑(圖1A)，表面僅存在少量氧化層；磷酸鈣涂層支架表面均勻覆蓋了一層結(jié)晶狀涂層(圖1B)。

圖1 Ca-P 涂層覆蓋前后多孔鎂樣品數(shù)字圖像(6×)A：無涂層支架；B：Ca-P 涂層支架Fig.1 Digital images of porous magnesium samples before and after Ca-P coating (6×)A: Non-coated scaffolds; B: Scaffolds coated with Ca-P

2 支架的表征 掃描電鏡結(jié)果顯示，無涂層支架表面光滑，呈現(xiàn)出融合體狀，未見散在鎂金屬顆粒(圖2A)；Ca-P 涂層支架表面呈現(xiàn)花瓣狀結(jié)構(gòu)，均一鋪展在多孔鎂金屬支架表面，且與多孔純鎂基體表面結(jié)合緊密，未觀察到明顯間隙(圖2B)。能量色散X 線能譜分析結(jié)果，無涂層支架主要成分為Mg(圖2C)；Ca-P 生物活性涂層的主要成分為C、O、Ca、P元素(圖2D)。

圖2 支架表面形貌和元素圖譜分析 (5 000×)A、C：無涂層支架及 EDS 能譜分析；B、D：Ca-P 涂層支架及EDS 能譜分析Fig.2 The surface morphologies and the corresponding elemental mapping images of the scaffolds (5 000×)A, C: Non-coated scaffolds and EDS analysis; B, D: Scaffolds coated with Ca-P EDS analysis

3 支架的力學(xué)性能 兩種支架均具有優(yōu)異的力學(xué)性能(圖3)。Ca-P 涂層支架彈性模量高于無涂層組[(656 ± 8.7) Mpavs(623 ± 7.0) Mpa，P=0.007，n=3](圖3B)；壓縮強度高于無涂層支架[(35.3 ±0.7) Mpavs(31 ± 1.0) Mpa，P=0.003，n=3](圖3C)。

圖3 支架力學(xué)性能A：應(yīng)力-應(yīng)變曲線；B：彈性模量；C：壓縮強度Fig.3 The mechanical properties of the scaffoldsA: Stress-strain curves; B: Elastic modulus; C: Compression modulus

4 生物相容性 CCK-8 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，在第1 天和第3 天，無涂層支架浸提液未表現(xiàn)出顯著毒性(P＞0.05)，第5 天表現(xiàn)出顯著抑制(P＜0.05)；而Ca-P 涂層支架浸提液在各時間點對細(xì)胞都有顯著促增殖作用(圖4)。第3 天活死染色結(jié)果顯示，Ca-P 涂層組表現(xiàn)出更多的活細(xì)胞和更少的死細(xì)胞，并且呈現(xiàn)出正常的細(xì)胞形態(tài)(圖5)。涂層支架細(xì)胞黏附結(jié)果顯示，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)舒展、片狀、絲狀多種形態(tài)與支架表面充分接觸，細(xì)胞在支架表面大量增殖(圖6)。

圖4 CCK-8 法檢測細(xì)胞在不同支架浸提液中培養(yǎng) 1 d、3 d、5 d 的增殖情況Fig.4 Cell counting kit-8 assay showing cell proliferation after culturing in the extract of different scaffolds for 1,3 and 5 d respectively

圖5 培養(yǎng)3 d 后 MC3T3-E1 細(xì)胞活力活/死染色(紅色，死亡細(xì)胞；綠色，活細(xì)胞。6×)Fig.5 Live/dead staining of MC3T3-E1 cell viability after 3 days of culture (red, dead cells; green, live cells. 6×)

圖6 掃描電子顯微鏡觀察 MC3T3E1 細(xì)胞在 Ca-P 涂層支架上的附著情況(500×)Fig.6 Scanning electron microscopy observation of MC3T3-E1 cell attachment on Ca-P coated scaffold (500×)

討 論

目前，關(guān)于骨缺損修復(fù)金屬支架的研究進展迅速，主要包括鎂、鋅、銅、鈣、鋁、鈦、鐵等金屬材料的研究，其中鎂金屬材料是目前研究最廣泛、最深入的可降解置入金屬材料之一，其研究成果得到了全世界的認(rèn)可，是目前非常有前途的醫(yī)用金屬材料。鎂離子是人體細(xì)胞內(nèi)僅次于鉀離子的金屬陽離子，參與催化和激活體內(nèi)上百種生化反應(yīng)，是人體內(nèi)必不可少的一種金屬離子[5,10-12]。Mg2+可促進骨形成和促血管生成，這使得鎂基生物材料作為骨組織工程生物材料更具可行性[4,13-14]。鎂金屬(41 ～ 45 GPa)擁有與天然骨(3 ～ 20 GPa)相似的彈性模量和密度，能為置入?yún)^(qū)提供可靠且穩(wěn)定的力學(xué)支撐。結(jié)合選擇性激光熔化工藝，利用計算機程序構(gòu)建仿生天然骨結(jié)構(gòu)置入支架。因此，我們采用選擇性激光熔化工藝，設(shè)計并打印出純鎂金屬支架，并通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法在多孔鎂金屬支架表面添加Ca-P 生物活性涂層。

負(fù)重部位骨松質(zhì)骨缺損支架材料應(yīng)用必須同時具備以下基本特征: (1)具有較好的力學(xué)性能，維持骨修復(fù)過程中力學(xué)完整性，同時傳遞分布載荷[15]；(2)良好的生物相容性，與周圍組織實現(xiàn)快速整合[16]；(3)具有多孔結(jié)構(gòu)，利于新生骨和血管長入[17]；(4)相對緩慢的降解速率，與新骨生成相匹配的降解速率和骨誘導(dǎo)是生物支架的重要功能[18]。

適宜且穩(wěn)定的力學(xué)性能是維持負(fù)重部位骨缺損修復(fù)的重要前提，Wang 等[6]采用模板法制備的鎂合金Mg-Nd-Zn-Zr (JDBM)，孔隙率為70.6%其屈服強度為6.87 MPa，彈性模量為0.4 GPa，并擁有很好的成骨成血管效果和適宜的降解速度。然而，JDBM 支架的初始力學(xué)強度稍低于骨松質(zhì)，不足以滿足骨松質(zhì)骨缺損區(qū)的初始力學(xué)強度。一些學(xué)者使用低溫沉積技術(shù)制造PT 多孔支架，這種PT 支架呈現(xiàn)出具有適宜降解速率的小梁狀幾何形狀[19-22]。然而，PT 支架[彈性模量=(45.7±5.4) MPa]置入的初始機械性能不足[20]。選擇性激光熔化工藝是目前精確度較高，能準(zhǔn)確還原骨微結(jié)構(gòu)的先進手段，其推動了生物材料學(xué)的快速發(fā)展[23-24]。Lai 等[3]通過3D 打印方法制備了含不同鎂濃度的PLGA/TCP 多孔支架，這種支架具有與天然骨相似的孔隙率和高聯(lián)通性，并且擁有很顯著的成骨成血管效果，但力學(xué)性能仍小于骨松質(zhì)，不能為缺損區(qū)提供足夠的初始力學(xué)支撐。Lin 等[14]采用3D 凝膠打印技術(shù)制備出多孔鎂支架，該支架在體內(nèi)外表現(xiàn)出很好的成骨效果，但該支架的屈服強度和彈性模量低于負(fù)重部位骨松質(zhì)，表明該支架不能為負(fù)重部位骨松質(zhì)提供有效的力學(xué)支撐。Dimitriou 等[25]通過3D 打印技術(shù)制備的多孔鐵錳合金擁有很好的生物相容性和緩慢的降解速率。這種支架的力學(xué)性能結(jié)果表明，支架力學(xué)強度遠(yuǎn)高于負(fù)重部位骨松質(zhì)，過高的力學(xué)強度易導(dǎo)致二次損傷。我們通過3D 打印工藝結(jié)合化學(xué)轉(zhuǎn)化法制備的Ca-P 涂層多孔鎂金屬支架具有很好的力學(xué)性能，其屈服強度(35.3 ± 0.7) MPa，高于天然骨松質(zhì)(12 MPa)；Ca-P 涂層多孔鎂金屬支架彈性模量為(656 ± 8.7) MPa，在骨松質(zhì)彈性模量40 ～ 1 400 MPa范圍內(nèi)，力學(xué)結(jié)果表明，我們制備的多孔鎂金屬支架的力學(xué)性能與骨松質(zhì)相匹配。

掃描電鏡觀察顯示，我們所制備的Ca-P 涂層多孔鎂金屬支架的涂層呈現(xiàn)出均一花瓣狀結(jié)構(gòu)，無縫隙結(jié)合緊密，這種獨特的結(jié)構(gòu)，顯著增加了支架表面積和表面粗糙程度，意味著支架可接受更多細(xì)胞附著(圖6)[26]。Carluccio 等[27]通過微弧氧化方法，在鎂合金表面成功制備出厚約20 μm的涂層，此種方法制備的涂層擁有很好的生物相容性，并能降低鎂合金的降解速度，但該方法制備的涂層呈現(xiàn)出火山口狀的微孔，加大了外界與鎂金屬接觸面積，不利于保護基體鎂合金。同樣，電鏡下鎂金屬支架基體呈現(xiàn)完整一體性，與本課題組前期研究的3D 凝膠打印純鎂金屬支架微觀結(jié)構(gòu)明顯不同，未見顆粒狀鎂金屬[9]；即使在力學(xué)測試實驗后，這種支架僅表現(xiàn)出輕微形變和微小裂痕，而未表現(xiàn)出松散的碎末樣結(jié)構(gòu)。

良好的生物相容性是檢測金屬材料向臨床轉(zhuǎn)化的首要前提。CCK-8 結(jié)果表明，支架浸提液與MC3T3-E1 細(xì)胞共培養(yǎng)后，無涂層組表現(xiàn)為輕微毒性，而涂層組未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，這種現(xiàn)象可能歸因于無涂層支架快速降解過程帶來的高鎂和高堿環(huán)境，抑制細(xì)胞生長；相反，Ca-P 生物活性涂層保護下的鎂金屬降解速率顯著降低，適宜濃度鎂和微環(huán)境有利于細(xì)胞生長。相較于本組前期3D 凝膠打印純鎂金屬支架[9]，并未表現(xiàn)出顯著差異，同樣符合國家標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞活死染色結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間延長，經(jīng)染色后，死細(xì)胞數(shù)量少，活細(xì)胞數(shù)量隨時間呈現(xiàn)增加的趨勢，與本實驗室前期研究的3D 凝膠打印純鎂金屬支架類似。掃描電鏡下，支架表面細(xì)胞黏附結(jié)果表明，MC3T3-E1 細(xì)胞在支架表面附著，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)扁平、舒展、片狀、絲狀多種形態(tài)充分與支架表面接觸，細(xì)胞在支架表面大量增殖。以上結(jié)果顯示，我們制備的這種支架具有良好的生物相容性。

綜上所述，我們通過選擇性激光熔化工藝結(jié)合化學(xué)轉(zhuǎn)化法成功制備出Ca-P 涂層多孔鎂金屬支架，并研究其力學(xué)性能和生物相容性，發(fā)現(xiàn)該材料能夠為負(fù)重部位骨松質(zhì)骨缺損區(qū)提供足夠的力學(xué)支撐，且擁有良好的生物相容性，為骨松質(zhì)缺損修復(fù)鎂材料的深入研究奠定基礎(chǔ)。

致謝感謝佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科、解放軍總醫(yī)院骨科研究所、上海交通大學(xué)材料研究院所有工作人員的技術(shù)指導(dǎo)和幫助。

作者貢獻葉健廷：細(xì)胞培養(yǎng)，實驗指標(biāo)檢測，實驗數(shù)據(jù)分析處理，論文撰寫；繆鉑尊：材料制備，實驗數(shù)據(jù)分析處理，論文撰寫；熊英杰、孟昊業(yè)、單驗博、孫小涵、盧雨征：細(xì)胞培養(yǎng)，數(shù)據(jù)收集，實驗數(shù)據(jù)分析；武艷斌、林萬程、關(guān)聰聰、劉修志、王鑫、許文靜：實驗儀器操作，實驗數(shù)據(jù)分析；袁廣銀：材料設(shè)計，實驗設(shè)計，文章校對；彭江：實驗設(shè)計，文章校對；周成福：實驗設(shè)計，文章校對。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：yejianting12@126.com。