小麥莖基腐病拮抗菌發(fā)酵條件優(yōu)化及穩(wěn)定性評價

張 強，吳利民，李朋燕，趙 娜，戶申奧，陸寧海

（河南科技學院 資源與環(huán)境學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

小麥莖基腐病作為世界性病害，在美國、澳大利亞、意大利等國家和北非、中東等地區(qū)均有發(fā)生[1]。自2012 年首次在河南省報道以來，小麥莖基腐病已在河南、河北、陜西等麥區(qū)普遍發(fā)生[2‐5]。受耕作方式及秸稈還田等因素的影響，病原菌在土壤中大量殘留，導致小麥莖基腐病逐年加重，進而嚴重威脅小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)[5‐6]。多種鐮刀菌可以導致小麥莖基腐病的發(fā)生，我國小麥莖基腐病的病原菌包括禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、假禾谷鐮 刀 菌（F.pseudograminearum）、亞 洲 鐮 刀 菌（F.asiaticum）等[7]。目前，河南省小麥產(chǎn)區(qū)的主要病原為假禾谷鐮刀菌[6]。莖基腐病嚴重發(fā)生后，小麥莖稈中存在毒素積累，無法作為飼料原料，否則會給動物養(yǎng)殖帶來風險[8‐9]。由于缺少有效的抗病品種，小麥莖基腐病的防治主要采用化學措施[5，9]。與化學防治相比，對環(huán)境友好的生物防治也成為防治小麥莖基腐病的重要方式[10]。

目前，生物防治微生物中研究較為廣泛的為芽孢桿菌，芽孢桿菌在自然界中普遍存在，很多類群都具有抑制植物病原菌的能力。其中的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，具有有效抑制多種病原菌的活性[11]。HU等[12]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌LYZ69 產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)可以誘導苜蓿炭疽病菌菌絲中活性氧的積累，從而導致病原菌細胞出現(xiàn)死亡。解淀粉芽孢桿菌FS6對人參真菌病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)過程具有明顯的抑制作用，而且能夠影響人參根際土壤中真菌和細菌的組成，從而對人參灰霉病起到防治效果[13]。此外，解淀粉芽孢桿菌對大豆疫霉菌[14]、香蕉枯萎病菌[15]、串珠鐮刀菌[16]都具有抑制作用。在小麥莖基腐病防治方面，解淀粉芽孢桿菌YB-161能夠抑制假禾谷鐮刀菌的菌絲生長，用菌液拌種后可以有效降低小麥莖基腐病的發(fā)生，并且還具有一定的增產(chǎn)效果[17]。

解淀粉芽孢桿菌HB-081 是河南科技學院資源與環(huán)境學院植物病理學實驗室從女貞葉片中分離獲得的1 株內(nèi)生細菌，前期研究發(fā)現(xiàn)該菌株對假禾谷鐮刀菌具有較好的拮抗效果[18]。為提升菌株HB-081 的發(fā)酵水平，采用單因素試驗和正交試驗對菌株HB-081 的培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，同時分析了無菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性，從而為該菌株的開發(fā)和實際應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 假禾谷鐮刀菌、解淀粉芽孢桿菌HB-081，均由河南科技學院資源與環(huán)境學院植物病理學實驗室分離并保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g、水1 000 mL；BPY 培養(yǎng)基：牛肉浸膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、水1 000 mL，pH 值7.2；LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g、水1 000 mL，pH 值7.2；NA 培養(yǎng)基：牛肉浸膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、水1 000 mL，pH值7.2；NB培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖10.0 g、酵母提取物1.0 g、水1 000 mL，pH 值7.2；YT 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖1.0 g、NaCl 5.0 g、水1 000 mL，pH值7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株HB-081發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.1.1 種子液制備 挑取菌株HB-081 適量菌體于50 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2 最適培養(yǎng)基篩選 將菌株HB-081 種子液1 mL 分別接種到50 mL 的BPY、LB、NA、NB、YT 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h 后，用紫外分光光度計對不同培養(yǎng)基中發(fā)酵液的OD600進行測量。另外，將發(fā)酵液于12 000 r/min 離心15 min，再將上清液用0.22μm 微孔濾膜過濾，以獲得無菌發(fā)酵液。將無菌發(fā)酵液按照10%體積比與PDA 培養(yǎng)基混合倒板，之后在平板中心接入直徑約5 mm 的假禾谷鐮刀菌菌餅。以不加無菌發(fā)酵液的PDA 培養(yǎng)基為對照，每個處理重復3 次。28 ℃培養(yǎng)5 d 左右，待對照即將長滿培養(yǎng)皿時，計算抑菌率。抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.2.1.3 最適碳源、氮源及無機鹽篩選 以最適培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加1 g/L的葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖作為碳源，制成不同碳源培養(yǎng)基；最適碳源確定后，分別添加10 g/L 的牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物和硝酸鉀制成不同氮源培養(yǎng)基；在最適碳源、氮源基礎(chǔ)上，分別添加5 g/L的氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸二氫鉀制成不同無機鹽培養(yǎng)基。將菌株HB-081 種子液以2%接種量置于不同培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h后，分別對發(fā)酵液的OD600和無菌發(fā)酵液的抑菌率進行計算。根據(jù)最適碳源、氮源、無機鹽的篩選結(jié)果，設(shè)計三因素三水平正交試驗確定不同培養(yǎng)基成分的最佳配比。

1.2.1.4 最適pH 值篩選 以上述篩選出來的最適培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，調(diào)整pH 值分別為4、5、6、7、8、9，按照2%接種量將菌株HB-081 種子液接種至不同pH值培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h后，對無菌發(fā)酵液的抑菌率進行計算。

1.2.1.5 最適溫度篩選 按照2%接種量將菌株HB-081 種子液接種至最適pH 值培養(yǎng)基中，分別于24、28、32、36、40 ℃，180 r/min 培養(yǎng)48 h 后，對無菌發(fā)酵液的抑菌率進行計算。

1.2.1.6 最適裝液量篩選 在上述篩選出來的最適培養(yǎng)條件下，于250 mL 三角瓶中分別盛裝50、75、100、125、150 mL 最適培養(yǎng)基，并按照2%接種量接種菌株HB-081 種子液，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h后，對無菌發(fā)酵液的抑菌率進行計算。

1.2.1.7 最適接種量篩選 在上述篩選出來的最適培養(yǎng)條件下，分別按照2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種菌株HB-081種子液，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后，對無菌發(fā)酵液的抑菌率進行計算。

1.2.1.8 最適發(fā)酵時間篩選 在上述篩選出來的最適培養(yǎng)條件下，分別發(fā)酵培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，對無菌發(fā)酵液的抑菌率進行計算。

1.2.2 菌株HB-081無菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性分析

1.2.2.1 熱穩(wěn)定性 將菌株HB-081 在最適發(fā)酵條件下培養(yǎng)后獲得的無菌發(fā)酵液分別在40、60、80、100 ℃條件下水浴30 min，冷卻至室溫后，按照10%體積比與PDA 培養(yǎng)基混合倒板，皿內(nèi)接入直徑約5 mm 的假禾谷鐮刀菌菌餅。以未用溫度處理的無菌發(fā)酵液為對照，以不加無菌發(fā)酵液的PDA 培養(yǎng)基為空白對照，每個處理重復3 次。28 ℃培養(yǎng)5 d 后，計算不同溫度處理下無菌發(fā)酵液的相對抑菌率。相對抑菌率=（空白對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（空白對照菌落直徑-未處理菌落直徑）×100%。

1.2.2.2 紫外線穩(wěn)定性 將菌株HB-081 無菌發(fā)酵液置于40 W 紫外燈下照射（距離30 cm），照射時間分別為30、60、120、180、240 min。以未用紫外線處理的無菌發(fā)酵液為對照，以不加無菌發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基為空白對照，對無菌發(fā)酵液的相對抑菌率進行計算。

1.2.2.3 酸堿穩(wěn)定性 將菌株HB-081 無菌發(fā)酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 分別調(diào)整pH 值為3、5、7、9、11，室溫靜置2 h 后，再將pH 值調(diào)為7。以未用酸堿處理的無菌發(fā)酵液為對照，以不加無菌發(fā)酵液的PDA 培養(yǎng)基為空白對照，對無菌發(fā)酵液的相對抑菌率進行計算。

1.2.2.4 蛋白酶穩(wěn)定性 在菌株HB-081 無菌發(fā)酵液中分別加入1 mg/mL 終質(zhì)量濃度的胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K，37 ℃處理2 h。以未用蛋白酶處理的無菌發(fā)酵液為對照，以不加無菌發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基為空白對照，對無菌發(fā)酵液的相對抑菌率進行計算。

1.2.3 菌株HB-081脂肽類物質(zhì)合成基因的PCR 檢測 利用細菌基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）對菌株HB-081 基因組DNA 進行提取。采用通用引物分別對bacAB、bamC、eriSa、fenB、ituC、sfp基因進行PCR 擴增[19]（表1）。PCR 反應(yīng) 體 系：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，BACD/BAMC/ERISA/FENB/ITUC/SFP-F（10 μmol/L）1.0 μL，BACD/BAMC/ERISA/FENB/ITUC/SFP-R（10 μmol/L）1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。擴增產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 脂肽類物質(zhì)合成基因的PCR檢測引物Tab.1 PCR primers of lipopeptide antibiotics synthetic genes

1.2.4 菌株HB-081 對小麥莖基腐病的防治效果試驗 挑選顆粒飽滿的周麥22種子（河南科技學院小麥中心提供），表面消毒后置于濕潤濾紙上進行催芽，待種子露白后分別放入1×108cfu/mL 菌株HB-081 的原始發(fā)酵液（以LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得）和優(yōu)化發(fā)酵液中浸種12 h，然后將種子播種于直徑15 cm 的塑料盆缽中，每盆播種20 粒。露白后的種子分別用清水和3%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑浸種12 h 作為空白對照（CK）和藥劑對照，每個處理重復3 次，25 ℃、14 L∶10 D 條件下培養(yǎng)。當小麥長到一葉一心時，將直徑約5 mm 的生長于PDA 培養(yǎng)基上的新鮮假禾谷鐮刀菌菌餅置于小麥幼苗莖基部，每株麥苗接種一塊菌餅，表面覆土2 cm 并保濕48 h。14 d后參照潘婭梅等[20]的方法對小麥莖基腐病的發(fā)病情況進行調(diào)查，并計算病情指數(shù)和防治效果。病情指數(shù)=Σ（各病情分級×該病級的發(fā)病株數(shù)）/（分級標準中最高級別數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）×100，防治效果=（空白對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/空白對照組病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HB-081的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 最適培養(yǎng)基篩選 在5 種培養(yǎng)基條件下，菌株HB-081 的無菌發(fā)酵液都可以抑制假禾谷鐮刀菌的菌落生長，其中以YT為培養(yǎng)基時OD600最大，同時無菌發(fā)酵液的抑菌率最高，為52.09%；而LB、NA、NB 培養(yǎng)基中菌株生長較慢，并且無菌發(fā)酵液的抑菌活性相對較低，都在40.00%以內(nèi)（圖1）。由此說明，菌株HB-081的最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基為YT培養(yǎng)基。

2.1.2 最適碳源、氮源及無機鹽篩選 以葡萄糖、果糖、甘露醇和麥芽糖為碳源時，菌株HB-081 的無菌發(fā)酵液具有明顯的抑菌活性，其中以麥芽糖為碳源時的抑菌率最高，為60.00%，并且發(fā)酵液的OD600也最大；以蔗糖為碳源時，菌株HB-081 的OD600和抑菌率最低，分別為0.33 和1.30%（圖2）。因此，選擇麥芽糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源。

以蛋白胨和胰蛋白胨為氮源時，菌株HB-081發(fā)酵液的OD600相當，都在1.60 左右，但以蛋白胨為氮源時無菌發(fā)酵液的抑菌率最高，為64.35%；硝酸鉀為氮源時，發(fā)酵液的OD600和無菌發(fā)酵液的抑菌率最低，分別僅為0.11和12.17%（圖3）。因此，選擇蛋白胨為發(fā)酵培養(yǎng)基的最適氮源。

圖3 不同氮源對菌株HB-081生長量及無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the growth of strain HB?081 and inhibition activity of cell?free fermentation broth

以氯化鉀為無機鹽時，菌株HB-081 發(fā)酵液的OD600和無菌發(fā)酵液的抑菌率最高，分別為1.96 和63.36%；氯化鈉為無機鹽時，無菌發(fā)酵液的抑菌率為58.20%，但發(fā)酵液的OD600只有1.27；磷酸二氫鉀為無機鹽時，無菌發(fā)酵液的抑菌率最低，僅為21.55%（圖4）。所以，選擇氯化鉀為發(fā)酵培養(yǎng)基的最適無機鹽。

圖4 不同無機鹽對菌株HB-081生長量及無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Effects of different inorganic salts on the growth of strain HB?081 and inhibition activity of cell?free fermentation broth

根據(jù)單因素試驗所得最佳碳源、氮源及無機鹽設(shè)計三因素三水平正交試驗，由于菌株HB-081 在3種條件下的發(fā)酵液OD600都較好，所以正交試驗僅以無菌發(fā)酵液對假禾谷鐮刀菌的抑菌率為指標。結(jié)果表明，3種因素影響菌株HB-081無菌發(fā)酵液抑菌效果的順序為A（麥芽糖）>B（蛋白胨）>C（氯化鉀），最佳水平組合為A3B2C2，即最佳培養(yǎng)基配方為麥芽糖10.0 g/L，蛋白胨15.0 g/L，氯化鉀5.0 g/L（表2）。

表2 菌株HB-081營養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果Tab.2 Results of the orthogonal experiment about medium composition of strain HB?081

2.1.3 發(fā)酵條件篩選 在初始pH 值為6～8 的條件下，菌株HB-081 無菌發(fā)酵液的抑菌率都在60.00%左右，且pH 值為6 時的抑菌率最高，為63.59%；在pH 值為4和9的條件下，抑菌率分別只有23.24%和10.97%（圖5A）。因此，菌株HB-081 最佳發(fā)酵初始pH值為6。

圖5 不同發(fā)酵條件對菌株HB-081無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of different fermentation conditions on the inhibition activity of strain HB?081 cell?free fermentation broth

在發(fā)酵溫度為28～32 ℃的條件下，菌株HB-081無菌發(fā)酵液的抑菌率都在60.00%以上，且溫度為28 ℃時的抑菌率最高，為63.05%；溫度過低和過高都會影響無菌發(fā)酵液的抑菌效果，24 ℃時的抑菌率最低，只有41.74%（圖5B）。因此，菌株HB-081 最佳發(fā)酵溫度為28～32 ℃。

在裝液量為50～75 mL 條件下，菌株HB-081 無菌發(fā)酵液的抑菌率最高，為62.00%；隨著裝液量的增加，抑菌率下降，裝液量為150 mL 時的抑菌率為53.26%（圖5C）。因此，菌株HB-081 最佳發(fā)酵裝液量為50～75 mL。

在接種量為2%～4%的條件下，菌株HB-081 無菌發(fā)酵液的抑菌率相對最好，都在62.00%左右；隨著接種量的增加，抑菌率下降，接種量為10%時的抑菌率最低，為51.94%（圖5D）。因此，菌株HB-081最佳發(fā)酵接種量為2%～4%。

在發(fā)酵時間為12 h 時，菌株HB-081 無菌發(fā)酵液的抑菌率最低，為13.94%；48 h 時的抑菌率明顯提高，為61.48%；隨著培養(yǎng)時間的延長，抑菌率出現(xiàn)下降，72 h 時的抑菌率下降到45.89%（圖5E）。因此，菌株HB-081最佳發(fā)酵時間為48 h。

2.2 菌株HB-081無菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性

菌株HB-081 無菌發(fā)酵液經(jīng)40～100 ℃分別處理30 min 后，無菌發(fā)酵液的抑菌效果幾乎不受影響，相對抑菌率都保持在99.00%以上（圖6A）。說明無菌發(fā)酵液中的活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖6 不同條件下菌株HB-081無菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性Fig.6 Antifungal stability of strain HB?081 cell?free fermentation broth under different conditions

利用紫外線對菌株HB-081 無菌發(fā)酵液進行照射，在30～180 min 的時間內(nèi)，相對抑菌率都可以保持在95.00%以上；紫外線照射240 min后，相對抑菌率下降為77.23%（圖6B）?？梢?，無菌發(fā)酵液具有較好的紫外線穩(wěn)定性。

菌株HB-081 無菌發(fā)酵液在pH 值為5～9 的條件下進行處理后，抑菌效果不受影響，相對抑菌率保持在100.00%左右；但是在pH值分別為3和11的條件下，抑菌活性有所下降，相對抑菌率分別為73.38%和83.74%（圖6C）。由此說明，抑菌活性物質(zhì)不耐強酸和強堿，適宜pH值為5～9。

分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K 對菌株HB-081 無菌發(fā)酵液進行處理，相對抑菌率未出現(xiàn)明顯變化，都可以保持在99.00%以上（圖6D）。表明抑菌活性物質(zhì)對供試蛋白酶不敏感。

2.3 菌株HB-081脂肽類物質(zhì)合成基因的PCR檢測結(jié)果

選擇6 種脂肽類物質(zhì)相關(guān)基因的引物對菌株HB-081基因組DNA進行PCR擴增，電泳結(jié)果表明，成功擴增出bacAB和fenB基因（圖7）。由此推測，菌株HB-081 可能存在芽孢桿菌溶素及豐原素B 合成基因，并產(chǎn)生相應(yīng)的抗菌物質(zhì)。

圖7 菌株HB-081脂肽類物質(zhì)合成基因的PCR擴增結(jié)果Fig.7 PCR amplification results of lipopeptide biosynthesis genes of strain HB?081

2.4 菌株HB-081對小麥莖基腐病的防治效果

盆栽試驗結(jié)果顯示，對照組小麥莖基腐病的病情指數(shù)為21.57，菌株HB-081 原始發(fā)酵液對小麥莖基腐病的防治效果為64.31%，優(yōu)化后發(fā)酵液的防病效果上升到69.74%。此外，使用3%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑拌種，小麥莖基腐病的病情指數(shù)為3.88，防治效果為81.97%（表3）。以上結(jié)果表明，菌株HB-081對小麥莖基腐病的發(fā)生具有一定的防病能力。

表3 菌株HB-081對小麥莖基腐病的防病效果Tab.3 Effect of strain HB?081 against wheat crown rot

3 結(jié)論與討論

生防菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，與其是否能夠應(yīng)用于生產(chǎn)密切相關(guān)[21]。本研究以菌株HB-081 的菌體量和對假禾谷鐮刀菌的抑菌效果作為指標，利用培養(yǎng)基組分的單因素試驗和正交試驗明確了解淀粉芽孢桿菌HB-081 的最適碳源為麥芽糖（10.0 g/L），氮源為蛋白胨（15.0 g/L），無機鹽為氯化鉀（5.0 g/L）。采用單因素試驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，最適發(fā)酵初始pH 值為6、溫度為28～32 ℃、裝液量為50～75 mL、接種量為2%～4%、發(fā)酵時間為48 h。通過對培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高了菌株HB-081的抑菌效果。

適宜的發(fā)酵條件能夠促進拮抗菌產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，但不同菌株產(chǎn)生抑菌活性的發(fā)酵條件各有不同。如解淀粉芽孢桿菌DP03-4 和Xe01 的最適碳源同為葡萄糖，但最適氮源、無機鹽、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時間都存在差異[21‐22]。本研究中，菌株HB-081 的最適發(fā)酵條件與菌株DP03-4 和Xe01 均有所不同。菌株之間發(fā)酵條件存在差異的原因可能與菌株自身特征、分離來源以及靶標病原菌選擇不同有關(guān)。后續(xù)還需進一步完善發(fā)酵條件，以符合生產(chǎn)實際的需要。

生防菌能否應(yīng)用于生產(chǎn)與其穩(wěn)定性有關(guān)，例如芽孢桿菌QHZ-3的發(fā)酵液經(jīng)高溫、紫外照射以及強酸強堿的處理后，仍然可以保持較好的抑菌效果[23]。解淀粉芽孢桿菌ck-05 的發(fā)酵液耐受80 ℃以下的溫度，pH 值為6～8 條件下具有較好的抑制效果，并且對紫外線和自然光照射不敏感，對胃蛋白酶等3種蛋白酶不敏感[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株HB-081 無菌發(fā)酵液經(jīng)100 ℃處理后相對抑菌率可在99.00%左右，在pH 值為5～9 的條件下抑菌活性不受影響，耐受紫外線的照射，對胃蛋白酶等3 種酶的處理不敏感。可見，菌株HB-081 無菌發(fā)酵液穩(wěn)定性較好，具有應(yīng)用于田間生產(chǎn)的潛力。

芽孢桿菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要包括抗生素及抗菌蛋白等，其中的脂肽類物質(zhì)結(jié)構(gòu)多樣、性質(zhì)穩(wěn)定，對多種植物病原菌都具有較好的生物活性[24]。高振峰等[25]研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1 脂肽物質(zhì)能夠有效降低番茄早疫病的發(fā)生，并延緩果實軟化。對金黃色葡萄球菌具有顯著抑菌作用的解淀粉芽孢桿菌SY11 具有fenA等3 種脂肽類物質(zhì)的功能基因，并且質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，該菌株產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)為Bacillomycin D[26]。解淀粉芽孢桿菌JY-d1 基因組中具有fenB和ituD基因，而且伊枯草菌素粗提物具有較好的抑菌效果[27]。本研究通過PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，菌株HB-081 存在bacAB和fenB基因，后續(xù)還應(yīng)對該菌株產(chǎn)生的脂肽類抗菌物質(zhì)進行分離與鑒定，為進一步的開發(fā)利用提供依據(jù)。