pH 值對(duì)豬糞與菌糠共發(fā)酵產(chǎn)酸特性及微生物群落的影響

任元森，張海波，程紅艷，王雨萌，羅 淵，劉 娜

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，山西 太谷 030801）

隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展以及人民生活水平的逐步提高，生豬養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷加大，我國(guó)2020 年生豬出欄數(shù)達(dá)4.07 億頭，糞尿年產(chǎn)生量巨大[1]。生豬糞含有大量的病原體，包括總大腸菌群、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌[2]，處理不當(dāng)會(huì)對(duì)環(huán)境安全和人體健康造成影響。因此，加快豬糞無(wú)害化處理和資源化利用對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。針對(duì)畜禽糞便面源污染，目前主要有3種處理方式，分別為集中利用、堆肥和厭氧發(fā)酵[3]。與前2 種方式相比，厭氧發(fā)酵既能生成清潔能源，又可解決豬糞亂堆放造成的環(huán)境問(wèn)題，具有很好的環(huán)境效益與經(jīng)濟(jì)效益[4]。揮發(fā)性脂肪酸（VFA）是厭氧發(fā)酵重要的中間產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸和正戊酸。VFA 相比于甲烷具有更高的利用價(jià)值和更廣泛的應(yīng)用，例如能夠用于廢水處理和高附加值生物聚合物合成[5‐6]，還可用于聚羥基鏈烷酸酯生物合成[7]、微生物燃料電池發(fā)電以及合成中鏈羧酸[8]。因此，利用豬糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)VFA 是實(shí)現(xiàn)豬糞資源化利用的有效途徑之一。然而，傳統(tǒng)豬糞低碳氮比（C/N）厭氧發(fā)酵效率低，限制了其在厭氧消化領(lǐng)域中的應(yīng)用[9]。豬糞與高C/N 物質(zhì)共發(fā)酵可有效解決上述問(wèn)題。目前，與豬糞厭氧共發(fā)酵的添加物多采用農(nóng)業(yè)廢棄物（如秸稈）。菌糠是食用菌栽培后廢棄的培養(yǎng)基質(zhì)，具有較高的C/N，且含有大量的粗纖維、多糖、粗蛋白等物質(zhì)，是豬糞厭氧共發(fā)酵理想的添加物。另外，我國(guó)菌糠產(chǎn)量大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)的食用菌總產(chǎn)量達(dá)4 000 萬(wàn)t，約占世界總產(chǎn)量的80%[10]。每生產(chǎn)1 kg食用菌可產(chǎn)生3.25～5.00 kg菌糠，照此計(jì)算，我國(guó)每年可產(chǎn)生1.3～2.0 億t 菌糠。但大部分菌糠都被當(dāng)作肥料利用或被丟棄、焚燒[11‐12]，較少將其作為厭氧共發(fā)酵添加物利用。

厭氧發(fā)酵是微生物和酶共同參與的生物學(xué)過(guò)程，其中pH 值是影響VFA 類(lèi)型和產(chǎn)量的重要因素[13]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)初始pH 值為6 時(shí)，厭氧發(fā)酵餐廚垃圾的水解效率和產(chǎn)酸量最高，產(chǎn)物以乙酸和丁酸為主，約占總VFA 的77%[14]；FENG 等[15]將活性污泥的pH 值從4.0 調(diào)至11.0 發(fā)現(xiàn)，初始pH 值為8.0 時(shí)產(chǎn)酸量最大，VFA 的成分主要為丙酸，其次為乙酸；CHEAH 等[16]利用厭氧消化污泥和餐廚垃圾厭氧共發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，堿性（pH 值9）條件下產(chǎn)酸量高于酸性（pH 值6），pH 值為9時(shí)乙酸占總VFA 的91%?；诖?，推斷pH 值與發(fā)酵底物的類(lèi)型密切相關(guān)，即pH值對(duì)不同原料的發(fā)酵產(chǎn)物積累量、組分與微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不一致。然而，到目前為止，未見(jiàn)關(guān)于pH 值對(duì)豬糞和菌糠厭氧共發(fā)酵及微生物群落結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道。

因此，擬以豬糞和靈芝菌糠為原料進(jìn)行厭氧發(fā)酵試驗(yàn)，探究不同pH 值對(duì)豬糞與菌糠共發(fā)酵產(chǎn)酸特性以及微生物群落的影響，明確利于豬糞、菌糠厭氧共發(fā)酵產(chǎn)VFA 的最適pH 值，闡述不同pH 值調(diào)控下微生物群落的變化規(guī)律，為豬糞和菌糠的資源化利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試豬糞取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)牧站，經(jīng)簡(jiǎn)單剔除動(dòng)物毛發(fā)和大塊石子等雜物后放入-4 ℃冰箱保存；供試靈芝菌糠取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心，自然風(fēng)干后，使用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)250 μm 篩，備用。發(fā)酵原料的基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵原料特性參數(shù)Tab.1 Characteristic parameters of anaerobic fermentation feedstock

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置7 個(gè)處理：不調(diào)節(jié)pH 值（對(duì)照，CK）、pH 值為4.0、pH 值為5.5、pH 值為7.0、pH 值為8.5、pH 值 為10.0、pH 值 為11.5，以 下 分 別 簡(jiǎn) 稱CK、pH4.0、pH5.5、pH7.0、pH8.5、pH10.0、pH11.5，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。具體操作：首先，將存放于-4 ℃的豬糞攪拌均勻，豬糞與水按質(zhì)量比1∶1稀釋，然后按豬糞與菌糠干質(zhì)量比（TS豬糞/TS菌糠）5∶1 加入靈芝菌糠，發(fā)酵液有效體積控制為400 mL（用去離子水調(diào)節(jié)），發(fā)酵底物TS 控制為10.0%，將其放置于振蕩箱中振蕩至混勻。然后使用2 mol/L 的鹽酸（HCl）或氫氧化鈉（NaOH）溶液分別調(diào)節(jié)pH 值至4.0、5.5、7.0、8.5、10.0、11.5，其中未調(diào)節(jié)pH 值組作為對(duì)照組（每次取樣后重新調(diào)節(jié)pH 值為4.0、5.5、7.0、8.5、10.0、11.5）。調(diào)好pH值之后通入氮?dú)? min，創(chuàng)造厭氧環(huán)境，迅速塞上涂抹凡士林的橡膠塞并用保鮮膜纏繞包裹封口，然后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13 d。分別在第0、1、3、5、7、9、11、13 天時(shí)取CK、pH4.0、pH5.5、pH7.0、pH8.5、pH10.0、pH11.5 處理的發(fā)酵液，經(jīng)3 000 r/min 離心5 min 后，取上清液過(guò)0.45μm 濾膜，測(cè)定樣品的pH 值及可溶性化學(xué)需氧量（SCOD）、氨氮、總磷、VFA 質(zhì)量濃度。選取不同處理的酸積累最大日與最優(yōu)產(chǎn)酸組處理的不同發(fā)酵天數(shù)（第0、7、11、13 天）樣品，進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析。所取微生物分析樣品均放入10 mL 離心管，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 理化參數(shù)測(cè)定

1.3.1 理化指標(biāo)測(cè)定 TS 和VS 采用質(zhì)量法測(cè)定[17‐18]，pH 值采用雷磁pHS-3C 型pH 計(jì)測(cè)定，SCOD質(zhì)量濃度采用重鉻酸鉀法測(cè)定，氨氮和總磷質(zhì)量濃度都使用參數(shù)水質(zhì)測(cè)定儀（5B-3B，北京連華永興科技）測(cè)定，C 和N 含量使用有機(jī)元素分析儀（Elementar Vario MACRO cube，德國(guó)）測(cè)定。

1.3.2 VFA測(cè)定 VFA質(zhì)量濃度采用配有FID檢測(cè)器的TRACE?1300型氣相色譜儀測(cè)定，色譜柱型號(hào)為DB-FFAP（30μm×1.0μm×0.53μm），采用程序升溫模式：首先在80 ℃柱溫下停留1 min；以20 ℃/min速度升溫至110 ℃，停留1 min；再以10 ℃/min 升溫至180 ℃，停留1 min。整個(gè)過(guò)程共耗時(shí)11 min，最后根據(jù)各VFA 的保留時(shí)間對(duì)其進(jìn)行定性，并通過(guò)外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。各VFA 質(zhì)量濃度均以化學(xué)需氧量（COD）計(jì)算，其COD轉(zhuǎn)換系數(shù)詳見(jiàn)表2。

表2 VFA組分COD轉(zhuǎn)換系數(shù)Tab.2 COD conversion factors of VFA components

1.3.3 微生物測(cè)定 根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行微生物群落總DNA 抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的提取質(zhì)量，DNA 濃度和純度采用NanoDrop 2000測(cè)定；采用338F（5′-ACTCCTACGGG‐AGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGG‐TWTCTAAT-3′）引物對(duì)16S rRNA基因V3—V4可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2020 處理數(shù)據(jù)，使用Origin 2020、R語(yǔ)言vegan軟件包作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵液pH值的變化

由圖1可知，pH7.0、pH8.5、pH10.0、pH11.5處理與CK 在發(fā)酵初期發(fā)酵液中pH 值波動(dòng)明顯，然后逐漸趨于穩(wěn)定。這是由于發(fā)酵初期系統(tǒng)生成VFA 的速率大于生成甲烷的速率，導(dǎo)致VFA 逐漸積累，pH值快速下降。由圖1 可知，共發(fā)酵11 d 后，pH 值變化趨于穩(wěn)定。pH4.0、pH5.5 處理，發(fā)酵初期pH 值不降反升可能原因有兩方面：一方面是由于產(chǎn)酸量較少，積累的酸量未能使發(fā)酵系統(tǒng)的pH 值降低；另一方面是發(fā)酵液的總堿度對(duì)酸化環(huán)境具有自我緩沖調(diào)控能力。

圖1 不同pH值處理豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵液中pH值的變化Fig.1 Change of pH value in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co?fermentation under different pH values regulating

2.2 豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵液VFA質(zhì)量濃度的變化

由圖2可知，從總體上看，VFA質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時(shí)間推移呈先上升后下降的趨勢(shì)。這是由于在厭氧發(fā)酵初期，易降解有機(jī)物迅速分解，厭氧酸化速率遠(yuǎn)高于產(chǎn)甲烷速率，造成VFA 大量積累。所有處理的酸積累量在第9～11 天時(shí)達(dá)到最大值，其中pH8.5 處理產(chǎn)生的VFA 最多，為36 736.29 mg/L，較發(fā)酵初期質(zhì)量濃度增加了32 298.61 mg/L，是CK 的1.36倍。pH4.0、pH11.5處理VFA產(chǎn)量較低。

圖2 不同pH值處理豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵液中VFA質(zhì)量濃度的變化Fig.2 Change of concentration of VFA in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co?fermentation under different pH values regulating

2.3 豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵液VFA組分的變化

由圖3 可得，發(fā)酵第0 天（圖3a）的VFA 各組分占比與各處理酸積累最大日（b）時(shí)有很大差別。CK組分占比變化最大，第0天時(shí)丁酸（正丁酸、異丁酸）為VFA 主要成分；隨發(fā)酵進(jìn)行，在VFA 積累量最大日，丁酸占比由原來(lái)的41.36%降低至25.67%，戊酸（異戊酸、正戊酸）占比也由24.27%下降至12.70%，乙酸則成為占比最高的VFA，由20.65%上升至40.82%。pH4.0、pH5.5 處理均是乙酸占比下降，而戊酸占比上升，分別由12.29%、8.60% 上升至19.51%、19.61%。pH7.0、pH8.5、pH10.0 處理均是乙酸占比明顯上升，分別由31.68%、30.77%、41.27%上升至41.06%、46.00%、48.70%。pH11.5 處理的VFA 組分變化不明顯，這可能與該處理產(chǎn)酸量不高有關(guān)系。

圖3 不同pH值處理豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵液中VFA組分的變化Fig.3 Change of VFA components in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co?fermentation under different pH values regulating

2.4 豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵液總磷與氨氮質(zhì)量濃度的變化

由圖4a 可知，CK、pH4.0、pH5.5 處理發(fā)酵液中總磷質(zhì)量濃度較高，且隨發(fā)酵時(shí)間推移總體呈波動(dòng)上升趨勢(shì)。pH8.5、pH10.0 處理總磷質(zhì)量濃度較低，隨時(shí)間推移波動(dòng)小。隨發(fā)酵時(shí)間推移，pH11.5 處理總磷質(zhì)量濃度較pH8.5、pH10.0處理有明顯提高。

圖4 不同pH值處理豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵液中總磷（a）和氨氮（b）質(zhì)量濃度的變化Fig.4 Change of total phosphorus concentration（a）and ammonia nitrogen concentration（b）in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co?fermentation under different pH values regulating

氨氮質(zhì)量濃度隨時(shí)間推移變化如圖4b 所示。發(fā)酵液中的氨氮主要來(lái)自豬糞和菌糠厭氧消化過(guò)程中氨基酸、蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)物質(zhì)的水解?？傮w來(lái)看，在偏酸性的環(huán)境中（CK、pH4.0、pH5.5處理）氨氮質(zhì)量濃度隨時(shí)間推移逐漸升高，且較堿性條件下氨氮質(zhì)量濃度高。pH7.0、pH8.5 處理氨氮質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時(shí)間推移呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。pH10.0、pH11.5 處理氨氮質(zhì)量濃度始終維持在較低水平。

2.5 豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵液SCOD質(zhì)量濃度的變化

不同pH 值調(diào)控下各反應(yīng)體系的SCOD 質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時(shí)間推移變化如圖5所示。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，SCOD 質(zhì)量濃度總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。各處理的SCOD 質(zhì)量濃度最大值分別為38 827.50 mg/L（CK）、27 842.50 mg/L（pH4.0 處理）、29 422.50 mg/L（pH5.5 處理）、40 595.00 mg/L（pH7.0 處理）、36 832.50 mg/L（pH8.5 處 理）、41 422.50 mg/L（pH10.0 處理）、53 875.00 mg/L（pH11.5 處理），較各自發(fā)酵初始（發(fā)酵第0 天）SCOD 質(zhì)量濃度分別增長(zhǎng)了 63.16%、33.10%、38.03%、88.97%、64.95%、41.18%、90.79%。

圖5 不同pH值處理豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵液中SCOD質(zhì)量濃度的變化Fig.5 Change of SCOD concentration in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co?fermentation under different pH values regulating

2.6 豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵微生物α多樣性分析

在OTU 為97%的相似性水平下，對(duì)不同pH 值處理酸積累最大日和不同發(fā)酵時(shí)期最優(yōu)產(chǎn)酸組的細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所有樣本均有99%的覆蓋率，說(shuō)明未被檢測(cè)到的物種較少。由表3 可知，pH值對(duì)厭氧發(fā)酵細(xì)菌的豐富度和多樣性影響明顯。在所有處理中，CK 的香儂（Shannon）指數(shù)最大（3.95），這是因?yàn)閜H 值調(diào)控改變了厭氧發(fā)酵細(xì)菌的生存環(huán)境，影響了其活性，細(xì)菌需更多時(shí)間適應(yīng)新環(huán)境。pH11.5 處理的Shannon 指數(shù)最小（2.78），說(shuō)明強(qiáng)堿環(huán)境會(huì)嚴(yán)重抑制厭氧發(fā)酵細(xì)菌的活性。Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)與細(xì)菌群落的豐富度呈正相關(guān)，pH8.5 處理的Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)最大，分別為838.50 和896.97，表明pH8.5 處理的細(xì)菌群落豐富度最高，為最優(yōu)產(chǎn)酸組。些細(xì)菌逐漸失去活性。Chao 指數(shù)和ACE 在第11 天達(dá)到最大值，此時(shí)VFA 的產(chǎn)量也最大，而在第13 天這2 個(gè)指數(shù)均下降，可能是厭氧發(fā)酵后期可供細(xì)菌利用的底物濃度較低導(dǎo)致的。

表3 不同pH值處理豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵酸積累最大日的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Tab.3 Bacterial community diversity index on the maximum day of acid accumulation in pig manure and spent mushroom substrate co?fermentation under different pH values

表4 最優(yōu)產(chǎn)酸組pH8.5處理豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Tab.4 Bacterial community diversity index at different periods of pig manure and spent mushroom substrate co?fermentation in the optimal treatment of pH value 8.5

2.7 豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵細(xì)菌物種組成分析

不同pH 值處理與不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)菌群落的影響較大。如圖6a所示，在酸積累最大日細(xì)菌門(mén)水平上，所有處理Firmicutes（厚壁菌門(mén)）相對(duì)豐度最高（61.11%～95.94%），為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。所有處理中，pH8.5 處理的 Firmicutes 相對(duì)豐度最低，Bacteroidetes（擬桿菌門(mén)）的相對(duì)豐度最高。

圖6 豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵門(mén)水平細(xì)菌多樣性分析Fig.6 Bacterial diversities analysis of pig manure and spent mushroom substrate co?fermentation at the phylum level

圖6b為最優(yōu)產(chǎn)酸組（pH8.5處理）條件下不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌門(mén)水平變化情況。由圖6b可知，總體上看，F(xiàn)irmicutes 呈先下降后上升再下降趨勢(shì)，Bacteroidetes 呈上升趨勢(shì)，Proteobacteria（變形菌門(mén)）呈下降趨勢(shì)。

圖7為微生物屬水平的變化。酸積累最大日屬水平細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌群主要為Clostridium_sensu_stricto_1（狹義梭菌屬）和Terrisporobacter（錐孢桿菌屬）。由圖7a 知，各處理酸積累最大日時(shí)Clostridium_sensu_stricto_1 為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為12.31%～48.23%。第二優(yōu)勢(shì)菌屬Terrisporobacter 的相對(duì)豐度在酸性條件下明顯高于堿性條件下，說(shuō)明酸性條件更適合其生長(zhǎng)繁殖。

圖7 豬糞與菌糠厭氧共發(fā)酵屬水平細(xì)菌多樣性分析Fig.7 Bacterial diversities analysis of pig manure and spent mushroom substrate co?fermentation at the genus level

由圖7b 知，第0 天時(shí)，pH8.5 處理的優(yōu)勢(shì)菌屬Clostridium_sensu_stricto_1、Terrisporobacter和Lactobacillus（乳酸菌屬）相對(duì)豐度分別為13.46%、14.17%、22.48%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，Lactobacillus的豐度降低，這表明乳酸被降解利用。第7 天與第0天相比，細(xì)菌群落變化較大，Clostridium_sensu_stricto_1 和Terrisporobacter相對(duì)豐度下降至10.84%、6.55%，Lactobacillus相對(duì)豐度<0.1%，Bacteroides（擬桿菌屬）相對(duì)豐度上升至13.24%。至第13 天發(fā)酵結(jié)束，Caldicoprobacter（鈣桿菌屬）相對(duì)豐度上升至15.46%，Clostridium_sensu_stricto_1、Terrisporobacter下降至11.32%、4.73%。

3 結(jié)論與討論

與畜禽糞便面源污染的集中利用、堆肥處理方式相比，厭氧發(fā)酵既能生成清潔能源，又可解決豬糞亂堆放造成的環(huán)境問(wèn)題，并具有很好的環(huán)境效益與經(jīng)濟(jì)效益[4]。因此，在未來(lái)的研究工作中，應(yīng)通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的調(diào)控，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)豬糞與菌糠資源的高效利用。

pH 值是判斷厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的重要指標(biāo)，pH 值一定程度上能夠反映出厭氧發(fā)酵的產(chǎn)酸情況。本研究中，在發(fā)酵進(jìn)行到第11 天，pH 值變化趨于相對(duì)穩(wěn)定，這可能由于發(fā)酵后期甲烷菌活性增強(qiáng)，發(fā)酵體系中部分VFA 被分解利用轉(zhuǎn)化為甲烷，VFA 不易積累，使得發(fā)酵液的pH值趨于穩(wěn)定[19]。

VFA 是厭氧發(fā)酵重要的中間產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸和正戊酸，VFA 相比于甲烷具有更高的利用價(jià)值和更廣泛的應(yīng)用。本研究中，所有處理產(chǎn)酸量在第9～11天時(shí)達(dá)到最大值，隨后VFA 質(zhì)量濃度下降，這是因?yàn)殡S著發(fā)酵反應(yīng)的進(jìn)行，易降解有機(jī)物被逐漸消耗，水解與酸化速率下降，積累的VFA 被產(chǎn)甲烷菌利用轉(zhuǎn)化為厭氧發(fā)酵的終端產(chǎn)物[20]。其中，pH8.5 處理產(chǎn)生的VFA最多，是CK 的1.36 倍，這與STRAZZERA 等[21]的研究結(jié)果相似，其研究表明在pH 值8.9 時(shí)嗜熱污泥酸化率最高。pH4.0、pH11.5處理VFA 的產(chǎn)量較低，這是由于強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性環(huán)境會(huì)抑制產(chǎn)酸菌的活性[21]，另外，強(qiáng)堿條件下會(huì)向發(fā)酵系統(tǒng)引入Na+（鈉離子），高質(zhì)量濃度的Na+會(huì)抑制厭氧發(fā)酵[22]。

厭氧發(fā)酵是微生物和酶共同參與的生物學(xué)過(guò)程，其中pH 值是影響VFA 組分和產(chǎn)量的重要因素[13]。本研究中，pH4.0、pH5.5 處理均是乙酸占比下降，戊酸占比上升；pH7.0、pH8.5、pH10.0 處理均是乙酸占比明顯上升；pH11.5 處理組分變化不明顯，這可能與該組產(chǎn)酸量不高有關(guān)系。有研究表明，堿性條件下乙酸產(chǎn)量更高，本研究結(jié)果與其一致，說(shuō)明pH 值不僅能夠影響VFA 的產(chǎn)量，還能夠影響其組分[23]。

總磷質(zhì)量濃度能夠反映出有機(jī)物的水解，水解的快慢一定程度上能夠反映出厭氧發(fā)酵的快慢。酸性條件下總磷質(zhì)量濃度出現(xiàn)明顯上升可能是因?yàn)樨i糞中一部分非溶解態(tài)的磷酸鹽在鹽酸作用下溶解出來(lái)，導(dǎo)致總磷質(zhì)量濃度上升[24]。而在堿性條件下，釋放的化合物易與可溶性磷反應(yīng)后生成沉淀[24]，從而使溶液中磷質(zhì)量濃度偏低。pH11.5 處理總磷質(zhì)量濃度反而高于pH8.5、pH10.0處理，這是由于強(qiáng)堿性條件下部分微生物細(xì)胞失去活性，其平衡滲透壓遭到破壞，堿性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞膜磷酸雙分子層溶解，釋放出大量的可溶性磷[25]。

氨氮主要來(lái)自豬糞和菌糠厭氧消化過(guò)程中氨基酸、蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)物質(zhì)的水解。在酸性條件下豬糞中的氨基酸脫氨基的速度較快，容易在環(huán)境中積累大量氨氮[24]。pH7.0、pH8.5 處理氨氮質(zhì)量濃度隨發(fā)酵進(jìn)行出現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，可能是此時(shí)環(huán)境更接近產(chǎn)甲烷菌的最適pH 值范圍，在厭氧發(fā)酵后期系統(tǒng)由產(chǎn)酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)氣，且部分氨氮作為產(chǎn)甲烷菌的氮源，促使產(chǎn)甲烷菌大量繁殖，造成發(fā)酵液中氨氮質(zhì)量濃度下降[26]。pH10.0、pH11.5 處理氨氮質(zhì)量濃度始終維持在較低水平，這可能是由于厭氧發(fā)酵液中的氨氮在堿性環(huán)境中易生成NH3而揮發(fā)。

隨著厭氧發(fā)酵反應(yīng)的進(jìn)行，固體有機(jī)物可分解成易溶于水的大分子有機(jī)物和小分子VFA，從而使消化液中SCOD 質(zhì)量濃度增加[27]。pH4.0、pH5.5 處理SCOD 質(zhì)量濃度低于其他處理，這是因?yàn)榈蚿H 值會(huì)抑制反應(yīng)體系中水解微生物的活性。有研究表明，當(dāng)pH 值低于5.4 時(shí)，淀粉分解微生物會(huì)失去活性[28‐29]。pH11.5 處 理SCOD 最 大 質(zhì) 量 濃 度 遠(yuǎn) 高 于 其他處理，這可能是由于高pH 值條件下胞外聚合物（EPS）中的官能團(tuán)（羧基、羥基、酰胺基團(tuán)等）被解離，并進(jìn)一步出現(xiàn)去質(zhì)子化現(xiàn)象，EPS之間存在強(qiáng)烈靜電排斥作用，導(dǎo)致碳水化合物和蛋白質(zhì)等從細(xì)胞內(nèi)部釋放到發(fā)酵液中[30‐32]。在厭氧消化后期，SCOD質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì)，這可能是由于SCOD 產(chǎn)出速率小于其進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化消耗的速率[33]。

α 多樣性是細(xì)菌群落的一個(gè)重要屬性，能夠反映環(huán)境中物種的多樣性和豐富度[34]，pH8.5 處理的VFA 產(chǎn)量最大，Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)也最大，分別為838.50 和896.97，表明pH8.5 處理細(xì)菌群落豐富度最高。細(xì)菌群落豐富度和多樣性越高，其代謝發(fā)酵底物的效率越高，產(chǎn)生的VFA也越多[35]。

不同pH 值處理與不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大。所有處理的Firmicutes 相對(duì)豐度最高，為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這是因?yàn)镕irmicutes 中大多數(shù)菌種可生成內(nèi)生孢子以抵御外界的不良環(huán)境[36]。另外，F(xiàn)irmicutes中還包含多種厭氧菌，其可將有機(jī)物分解產(chǎn)生乙酸[37]，這與本研究得到的結(jié)果一致，即所有處理中的VFA 主要為乙酸。pH8.5 處理Bacteroidetes的相對(duì)豐度最高，這可能是大分子底物被消耗，小分子酸積累造成的[38]；Bacteroidetes 菌種在厭氧環(huán)境中很常見(jiàn)，是最為重要的產(chǎn)酸菌之一[39]，這可能是pH8.5處理產(chǎn)酸量高于其他組的重要原因之一。

最優(yōu)產(chǎn)酸組（pH8.5 處理）條件下不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌門(mén)水平變化，F(xiàn)irmicutes呈先下降后上升再下降趨勢(shì)，隨著厭氧發(fā)酵的進(jìn)行，大分子有機(jī)物被轉(zhuǎn)化成小分子有機(jī)物，導(dǎo)致Firmicutes 相對(duì)豐度下降，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行一部分難溶解物質(zhì)會(huì)轉(zhuǎn)化為易分解大分子，因而Firmicutes 相對(duì)豐度升高[38]，而B(niǎo)acteroidetes 表現(xiàn)為升高趨勢(shì)，說(shuō)明隨厭氧發(fā)酵進(jìn)行，產(chǎn)酸量持續(xù)增加。Proteobacteria 持續(xù)下降，有利于VFA 的積累，其被認(rèn)為是VFA 的消耗者，在發(fā)酵過(guò)程中能夠消耗丙酸和丁酸[40]。

酸積累最大日細(xì)菌屬水平的優(yōu)勢(shì)菌群主要為Clostridium_sensu_stricto_1 和Terrisporobacter。各 處理酸積累最大日時(shí)Clostridium_sensu_stricto_1 為優(yōu)勢(shì)菌屬，該屬能夠水解多糖促進(jìn)產(chǎn)酸[41]，也能夠?qū)⒍寝D(zhuǎn)化為以乙酸、乙醇、丁酸等為主的代謝產(chǎn)物[42‐43]。第二優(yōu)勢(shì)菌屬Terrisporobacter 能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酸和CO2[44]，該屬的相對(duì)豐度在酸性條件下明顯高于堿性，說(shuō)明酸性條件更適合該菌屬生長(zhǎng)繁殖。

pH8.5 處理的厭氧發(fā)酵過(guò)程中屬水平細(xì)菌群落變化較大，這是因?yàn)樵诰翰粩囫Z化和動(dòng)態(tài)更替的過(guò)程中，適應(yīng)厭氧發(fā)酵環(huán)境的功能菌群逐漸豐富，發(fā)酵液的菌群多樣性和豐度增加[45]。