煙草NtCCX2 基因的克隆與表達(dá)分析

馮 康，楊園園，劉 瓊，程 嵐，郝浩浩，王平平，金維環(huán)，郭紅祥

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省煙草公司 駐馬店市公司，河南 駐馬店 463000；3.中國(guó)煙草總公司 陜西省公司，陜西 西安 710061）

隨著工業(yè)化的發(fā)展，重金屬鎘（Cd）造成的土壤污染問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。研究表明，Cd 具有高聚集、難降解、毒性強(qiáng)等特性，對(duì)生物生長(zhǎng)發(fā)育和食品安全均能造成威脅。植物中過(guò)量積累的Cd 會(huì)抑制種子發(fā)芽、葉綠素合成、植物生長(zhǎng)等，對(duì)幼苗產(chǎn)生不利影響[1]。Cd 也很容易進(jìn)入農(nóng)作物的可食用部分，進(jìn)而在人體中富集。進(jìn)入人體的Cd 主要積累分布在肝臟、胰腺和骨骼中，引發(fā)腎衰竭、心血管和內(nèi)分泌失調(diào)等疾病。另外，Cd 還可以破壞人體骨骼系統(tǒng)，引起骨骼疏松，嚴(yán)重威脅人體健康[2]。因此，將植物的Cd 含量降低到安全水平，減輕Cd 對(duì)人體健康的損害，是降低Cd污染危害切實(shí)可行的方法[3]。

植物主要利用鋅（Zn2+）、錳（Mn2+）和鐵（Fe2+）等離子的轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。例如：水稻OsNramp5 是在根系中表達(dá)的膜定位Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)體，研究數(shù)據(jù)顯示，水稻OsNramp5突變體植株中Cd總含量和籽粒中Cd 積累量均呈現(xiàn)大幅度降低的現(xiàn)象，表明其在Cd 吸收過(guò)程中發(fā)揮作用[4]。IRT1 為鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可以將重金屬Cd 運(yùn)往植物莖部[5]。陽(yáng)離子/鈣離子（Ca2+）交換器（Cation/Ca2+exchangers，CCX）屬于Ca2+/陽(yáng)離子反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ca2+/cation antiporter，CaCA）超家族，能通過(guò)氫離子（H+）、鉀離子（K+）或鈉離子（Na+）等陽(yáng)離子逆電化學(xué)梯度交換Ca2+[6]。CCX 廣泛存在于細(xì)菌、植物和動(dòng)物中，不僅具有轉(zhuǎn)運(yùn)離子的功能，而且在響應(yīng)外界環(huán)境脅迫的過(guò) 程 中 起 著 重 要 作 用[7‐8]。AtCCX1、AtCCX3和AtCCX4是擬南芥中CCX 家族成員。AtCCX1在擬南芥葉片衰老過(guò)程中高度表達(dá)，基因敲除AtCCX1和AtCCX4能使葉片保持常綠，而過(guò)表達(dá)AtCCX1則加速葉片衰老[9]。Ca2+缺失的條件下，AtCCX1和AtCCX4突變體幼苗均表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)障礙，表明AtCCX1可能通過(guò)Ca2+信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)葉片的衰老[9]。AtCCX3和AtCCX4定位于液泡膜，顯示出H+依賴的K+、Mn2+和K+運(yùn)輸調(diào)節(jié)能力[10]。在煙草中過(guò)表達(dá)AtCCX3后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草中積累了大量的陽(yáng)離子[10]。在水稻基因組中，目前共發(fā)現(xiàn)4個(gè)CCX 成員，其中OsCCX2被證明能增強(qiáng)酵母和擬南芥的Cd 耐受性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsCCX2能將Cd2+裝載到木質(zhì)部中，通過(guò)介導(dǎo)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)途徑促進(jìn)水稻籽粒中Cd元素的積累[11]。目前，煙草CCX 基因家族成員及其功能還未見(jiàn)報(bào)道。

煙草是一種重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是Cd富集植物，吸收的Cd主要累積于煙葉中[12]。植煙土壤中過(guò)量的Cd不僅會(huì)抑制煙株生長(zhǎng)發(fā)育、降低煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，煙葉中的Cd還會(huì)通過(guò)抽吸過(guò)程中產(chǎn)生的主流煙氣被人體所吸收，造成潛在危害。有文獻(xiàn)報(bào)道，水稻OsCCX2參與Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。因此，擬克隆煙草NtCCX2基因及其啟動(dòng)子，研究該基因?qū)d吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)與累積的影響，探討通過(guò)調(diào)節(jié)NtCCX2降低煙葉Cd含量的途徑，為優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供理論依據(jù)，以期為基因編輯改良煙草品種找到新靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 野生型K326 土培煙草（Nicotiana tabacumL.）種植在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室（東經(jīng)113°79′，北緯34°79′），溫度26～28 ℃，相對(duì)濕度60%，光周期為16 h光照/8 h黑暗。

組織特異性表達(dá)試驗(yàn)：野生型K326 土培煙草生長(zhǎng)到幼苗期、旺長(zhǎng)期和成熟期時(shí)，取根、莖、葉樣品，置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。

鎘脅迫試驗(yàn)：在八葉一心時(shí)期，選取長(zhǎng)勢(shì)大小一致的18 株野生型K326 土培煙草，平均分為3 組，用濃度為0、200、1 000 μmol/L 的氯化鎘溶液澆灌，每組處理澆灌400 mL，每隔1 d 澆1 次，處理7 d 后取葉和根，置于-80 ℃冰箱中保存，用于Cd 含量的測(cè)定和RNA的提取。

激素信號(hào)響應(yīng)試驗(yàn)：在六葉一心時(shí)期，選取長(zhǎng)勢(shì)大小一致的25 株野生型K326 土培煙草，分別用脫落酸（ABA）、乙烯利和茉莉酸甲酯（MeJA）處理，濃 度 均 為4 mmol/L[13‐15]，每 株 噴 灑20 mL，分 別 在ABA 和乙烯利處理后0、2、4、8、24 h 取煙草的葉和根，在MeJA 處理后0、4、8、24 h 取煙草的葉和根，置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。

干旱脅迫與鹽脅迫試驗(yàn)：在煙草旺長(zhǎng)期，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的9 株野生型K326 土培煙草，其中3 株正常澆水作為對(duì)照（CK），其余的分別進(jìn)行200 mmol/L NaCl 和干旱7 d 脅迫處理[16]，觀察其表型變化，處理7 d后取葉和根置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。

降鎘試驗(yàn)：大田試驗(yàn)品種為中煙100，種植于駐馬店泌陽(yáng)縣，設(shè)置4 個(gè)處理：CK、噴灑降鎘靈（佛山市鐵人環(huán)?？萍加邢薰荆姙⒏晃鴮殻ㄋ拇◥?ài)隆植物營(yíng)業(yè)科技有限公司）、噴灑微量元素肥（山東海岱綠洲生物工程有限公司）。分別在移栽后30、60 d 按照使用說(shuō)明噴施降鎘靈、富硒寶、微量元素肥。噴施7 d 后取樣，置于-80 ℃保存，用于Cd 含量的測(cè)定和RNA的提取。

1.1.2 試劑 DNA凝膠回收試劑盒和KK快提RNA試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)于NEB 有限公司；cDNA 合成試劑盒MonScriptTMRT ⅢSuper Mix with dsDNase（Two-Step）購(gòu)自莫納生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α 購(gòu)自上海昂羽生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 煙草DNA、總RNA 的提取及cDNA 的合成采用CTAB 法提取野生型K326 土培煙草葉片中的DNA。利用莊盟公司植物KK 快提試劑盒提取煙草根、莖、葉中的RNA，利用Nanodrop 儀器測(cè)RNA 濃度，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA 降解和污染情況。用莫納生物試劑反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，于-80 ℃冰箱中保存用于基因的克隆和熒光定量PCR。

1.2.2 煙草NtCCX2基因的克隆及測(cè)序 在NCBI網(wǎng)站查找煙草基因組中NtCCX2基因序列，利用NCBI 網(wǎng)站中的Primer-BLAST 設(shè)計(jì)引物CCX2-F/CCX2-R（表1）。提取野生型K326 土培煙草葉片中的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增體系：2×TaqPlus Master MixⅡ25μL，上、下游引物和cDNA模板各1μL，以無(wú)菌水補(bǔ)足50μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸2.25 min，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。利用莊盟公司的DNA 凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物送至尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究所用引物信息Tab.1 Information of primers used in this study

1.2.3 煙草NtCCX2基因的生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN 軟件將NtCCX2基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；根據(jù)其氨基酸序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTp 上 搜 索 同 家 族CCX 蛋白；利用MEGA 7.0 構(gòu)建不同植物CCX 蛋白進(jìn)化樹(shù)；用NCBI 的Conserved domain 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；利用DNAMAN 8 軟件將煙草和其他物種的同家族CCX氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 煙草NtCCX2啟動(dòng)子的克隆 在NCBI 網(wǎng)站上查找煙草的基因組序列，將該基因上游2 000 bp左右片段作為其啟動(dòng)子區(qū)域，利用NCBI 網(wǎng)站中的Primer-BLAST 設(shè)計(jì)引物pCCX2-F/pCCX2-R（表1），以野生型K326 煙草基因組DNA 為模板，擴(kuò)增啟動(dòng)子片段，將得到的目的片段導(dǎo)入到pMD19-T（TaKaRa，北京）中。

1.2.5 煙草NtCCX2啟動(dòng)子序列分析 通過(guò)PlantCARE 網(wǎng)站分析NtCCX2啟動(dòng)子中順式作用元件位置、序列及功能。

1.2.6 煙草NtCCX2基因表達(dá)分析 利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物qCCX2-F 和qCCX2-R（表1），以NtActin基因作為內(nèi)參，用2×SYBR Premix WizTaq酶（諾貝萊，北京）進(jìn)行熒光定量PCR，采用2-ΔΔCt法計(jì)算NtCCX2基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Cd 含量檢測(cè) 委托河南華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司采用石墨爐原子吸收分光光度法測(cè)定Cd含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtCCX2基因的克隆與序列分析

在NCBI 網(wǎng)站上查找擬南芥AtCCX2的氨基酸序列，利用BLASTp查找到煙草CCX2同源基因。該基因全長(zhǎng)2 464 bp，CDS 區(qū)1 926 bp，編碼641 個(gè)氨基酸。以野生型K326 土培煙草的葉片cDNA 為模板進(jìn)行PCR，得到1 條長(zhǎng)度為1 926 bp 的條帶（圖1），該基因編碼641 個(gè)氨基酸，GenBank 登錄號(hào)為XM_016577905。

圖1 煙草NtCCX2基因的克隆Fig.1 Cloning of NtCCX2 gene in tobacco

基于WOLF PSORT 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)最可能位于質(zhì)膜。利用NCBI 的Conserved domain 預(yù)測(cè)NtCCX2 蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)在23—439 位氨基酸含有1 個(gè)保守的Na+/Ca2+-K+INDEPENDENT EXCHANGER 結(jié)構(gòu)域。NtCCX2 與其他物種CCX2 氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，NtCCX2與馬鈴薯StCCX2和辣椒CaCCX2 的氨基酸序列相似性最高，并具有CCX家族高度保守的特征，在跨膜區(qū)有2 個(gè)α-重復(fù)區(qū)域：α1 模式基序GNGAPD 和α2 模式基序G（N/D）SxGD[17‐19]。利用MEGA 7.0 軟件對(duì)NtCCX2 同家族21種植物的CCX2 蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3，煙草NtCCX2 在進(jìn)化上與番茄（Solanum lycopersicum，XP 004243702.1）、辣 椒（Capsicum annuum，XP 016580161.1）、馬 鈴 薯（Solanum tuberosum，XP 006342390.1）、曼 陀 羅（Datura stramonium，MCD 9559449.1）CCX 蛋白相似度最高，說(shuō)明其親緣關(guān)系最近，與擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP 564650.1）、水稻（Oryza sativa japonicagroup，XP 015632178.1）等親緣關(guān)系次之，而與黃瓜（Cucumis sativus，XP 004144128.1）、冬 瓜（Benincasa hispida，XP 038878908.1）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 CCX2蛋白序列比對(duì)分析Fig.2 Multiple sequence alignment of CCX2 proteins

圖3 植物CCX蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CCX proteins in plants

2.2 煙草NtCCX2啟動(dòng)子克隆及順式作用元件分析

以野生型K326 土培煙草的葉片DNA 為模板擴(kuò)增NtCCX2啟動(dòng)子，得到1 條長(zhǎng)度為2 160 bp 的條帶（圖4），產(chǎn)物純化后連接到T 載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 中，經(jīng)過(guò)菌液PCR 檢測(cè)后送至尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與煙草基因組的結(jié)果高度相似。

圖4 煙草NtCCX2基因啟動(dòng)子的克隆Fig.4 Cloning of NtCCX2 promoter in tobacco

用PlantCARE 分析NtCCX2啟動(dòng)子序列順式作用元件，結(jié)果見(jiàn)表2，NtCCX2啟動(dòng)子包含與光響應(yīng)有關(guān)的元件AE-BOX 和一些植物激素響應(yīng)元件，如脫落酸應(yīng)答元件ABRE、茉莉酸應(yīng)答元件CGTCAmotif、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element 等，表明光、茉莉酸、脫落酸和水楊酸等環(huán)境因素可能影響NtCCX2基因的表達(dá)。另外，該啟動(dòng)子區(qū)域還包含有植物逆境應(yīng)答相關(guān)元件，如干旱、高鹽、低溫響應(yīng)元件MYB，說(shuō)明該基因可能與植物抗逆相關(guān)。

表2 煙草NtCCX2基因啟動(dòng)子部分順式作用元件Tab.2 Cis?acting elements of NtCCX2 promoter in tobacco

2.3 煙草NtCCX2基因的組織特異性表達(dá)分析

煙草NtCCX2基因表達(dá)具有明顯的組織特異性。圖5顯示，幼苗期和旺長(zhǎng)期NtCCX2基因在葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，分別是莖中相對(duì)表達(dá)量的37.4、6.2 倍，而成熟期NtCCX2基因在根和花中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于莖和葉，分別是莖中相對(duì)表達(dá)量的5.9、4.1倍，是葉中相對(duì)表達(dá)量的3.6、2.4倍。

圖5 NtCCX2基因的組織表達(dá)模式分析Fig.5 Expression pattern analysis of NtCCX2 gene

2.4 煙草NtCCX2基因?qū)Ω珊?、鹽脅迫的響應(yīng)

干旱與鹽脅迫是2 種常見(jiàn)的非生物逆境脅迫，NtCCX2基因啟動(dòng)子中含有干旱與鹽脅迫的響應(yīng)元件。圖6顯示，干旱脅迫后葉中NtCCX2基因相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的2.1 倍。鹽脅迫后葉中NtCCX2基因相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的5.1 倍，根中相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的3.4 倍。因此，干旱和鹽脅迫均能促進(jìn)煙草根和葉中NtCCX2基因的表達(dá)，在葉中的誘導(dǎo)效應(yīng)大于根中，表明NtCCX2基因參與煙草的干旱與鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程。

圖6 干旱脅迫（A）和NaCl脅迫（B）下NtCCX2基因表達(dá)水平Fig.6 Expression of NtCCX2 under drought stress（A）and NaCl stress（B）

2.5 煙草NtCCX2基因?qū)に匦盘?hào)的響應(yīng)

干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致植物水分散失，即產(chǎn)生滲透脅迫，進(jìn)而促進(jìn)植物激素ABA的合成，因此，ABA 信號(hào)通路是植物非生物脅迫反應(yīng)過(guò)程的中樞調(diào)節(jié)因子[20]。圖7A、7B 顯示，ABA 處理2 h 后，NtCCX2基因在根中相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，是0 h 的3.7 倍；ABA 處理8 h 后，在葉中相對(duì)表達(dá)量是0 h 的2.1 倍。表明ABA 能夠明顯誘導(dǎo)煙草根和葉中NtCCX2基因的表達(dá)，在根中的誘導(dǎo)效應(yīng)大于葉中，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。MeJA 是響應(yīng)植物損傷的激素信號(hào)分子，外源應(yīng)用能夠激發(fā)植物防御基因的表達(dá)。圖7C、7D 顯示，MeJA 處理后，根中NtCCX2基因相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有明顯的變化；MeJA 處理8 h 后，葉中NtCCX2基因相對(duì)表達(dá)量是0 h 的2.1 倍，表明MeJA 處理8 h 后能夠顯著誘導(dǎo)葉中NtCCX2基因表達(dá)。作為一種重要的植物激素，乙烯利不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，也參與植物對(duì)干旱、水淹、鹽和低溫等各種非生物脅迫的響應(yīng)[21]。圖7E、7F 顯示，乙烯利處理2 h 后，NtCCX2基因在根和葉中相對(duì)表達(dá)量均增加；處理8 h 后，NtCCX2基因在根中的相對(duì)表達(dá)量是0 h 的2.4倍；處理24 h后，NtCCX2基因在葉中的相對(duì)表達(dá)量是0 h 的5.7 倍。表明乙烯利處理能夠顯著誘導(dǎo)NtCCX2基因的表達(dá)。

圖7 煙草NtCCX2基因?qū)BA（A和B）、MeJA（C和D）和乙烯利（E和F）的響應(yīng)Fig.7 Response of NtCCX2 to ABA（A and B），MeJA（C and D）and ethylene（E and F）

2.6 煙草NtCCX2基因?qū)d脅迫的響應(yīng)

煙草是一種Cd 富集植物，煙葉中Cd 的含量受到土壤Cd含量、水肥管理等眾多因素的影響。溫室試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖8），200 μmol/L Cd 脅迫后，根中NtCCX2基因的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)10 倍以上，葉中的表達(dá)量上調(diào)5 倍以上，1 000 μmol/L Cd 脅迫后根和葉中NtCCX2基因的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)10 倍以上，表明該基因的表達(dá)受Cd 脅迫的誘導(dǎo)。根和葉中的Cd 含量也明顯高于對(duì)照，表明NtCCX2基因與煙株Cd 的吸收運(yùn)輸相關(guān)。土壤修復(fù)劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、營(yíng)養(yǎng)元素的添加以及現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用是當(dāng)前重要的控鎘技術(shù)措施。大田試驗(yàn)結(jié)果（圖9）顯示，降鎘靈、富硒寶、微量元素肥能夠降低大田煙株根和葉中NtCCX2基因的表達(dá)量，減少各部位葉和根的Cd 含量，其中降鎘靈降低下部葉Cd 含量的效果比較明顯，進(jìn)一步表明NtCCX2基因參與煙株中Cd的吸收與運(yùn)輸。

圖8 Cd脅迫對(duì)NtCCX2基因表達(dá)（A）與煙株Cd含量（B）的影響Fig.8 Effects of cadmium stress on NtCCX2 gene expression（A）and cadmium content（B）in tobacco plants

圖9 降鎘藥劑對(duì)大田煙株NtCCX2基因表達(dá)（A）和Cd含量（B）的影響Fig.9 Effect of cadmium?reducing agents on expression of NtCCX2 gene（A）and cadmium content（B）in tobacco plants

3 結(jié)論與討論

Ca2+/陽(yáng)離子反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（CaCA）是一類膜定位的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要包含YRBG、CAX、CCX、NCX和NCKX 5個(gè)亞家族成員，CAX和CCX普遍存在于植物中，在植物非生物脅迫響應(yīng)中起到重要作用[22‐24]。CCX一般有CCX1—CCX5 5個(gè)成員，跨膜區(qū)是包含2 個(gè)α-重復(fù)區(qū)域的12 個(gè)區(qū)段，保守的α1 模式基序GNGAPD 和α2 模式基序G（N/D）SxGD分別存在于N-端的第3—4 區(qū)段和C-端的第9—10區(qū)段[25]，本研究結(jié)果表明，NtCCX2具有這種典型的保守結(jié)構(gòu)。

CCX2 參與體內(nèi)的Na+、K+、Mn2+、Ca2+等的運(yùn)輸。擬南芥中的CCX 家族具有H+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)活性，通過(guò)調(diào)控Ca2+濃度，AtCCX1、AtCCX2、AtCCX3參與干旱、鹽脅迫響應(yīng)，AtCCX1參與葉片的衰老過(guò)程[26]。研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaCCXs、水稻OsCCX2和OsCCX4的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)，而OsCCX2還與Cd 的運(yùn)輸有關(guān)[27‐29]。本研究結(jié)果顯示，NtCCX2基因啟動(dòng)子含有ABA 等激素信號(hào)以及抗逆相關(guān)的響應(yīng)元件，其在根和葉中的表達(dá)除了受到干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo)外，還對(duì)ABA、MeJA 和乙烯利產(chǎn)生不同的響應(yīng)，Ca2+等離子的調(diào)控是否也參與這些響應(yīng)過(guò)程尚需進(jìn)一步研究。另外，本研究結(jié)果還表明，Cd 脅迫能顯著增加NtCCX2基因的表達(dá)，降鎘靈等降鎘藥劑能夠下調(diào)該基因的表達(dá)，不僅表明NtCCX2與煙草中Cd 的吸收、累積有關(guān)，同時(shí)也為降鎘藥劑的推廣使用提供了理論基礎(chǔ)。