LncRNA GAS5 對(duì)結(jié)直腸癌5-FU 耐藥的作用研究

聶啟鴻 鐘曉鳴

LncRNA-GAS5 被確定為多種癌癥的抑癌基因,且被證實(shí)參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。但是LncRNA GAS5在結(jié)直腸癌中的作用尚不明確。有研究顯示,LncRNA GAS5 通過(guò)干預(yù)磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)通路參與調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑(DDP)的化學(xué)敏感性［1］。以5-FU 為基礎(chǔ)的化學(xué)治療方案可有效治療結(jié)直腸癌,對(duì)改善無(wú)手術(shù)機(jī)會(huì)的患者的生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期尤為重要。但5-FU 耐藥大大限制其療效［2］。5-FU 耐藥機(jī)制的產(chǎn)生及應(yīng)對(duì)策略是目前臨床工作中亟需解決的問(wèn)題。因此,本研究將探討LncRNA GAS5 在5-FU 耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對(duì)5-FU 耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8 和SW480 均購(gòu)自American Type Culture Collection。

1.1.2 主要儀器與試劑 二氧化碳恒溫孵育箱(Thermo Fisher Scientific),伯樂(lè)化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國(guó)伯樂(lè)),RT-PCR 儀(ABI),Applied Biosystems 9700 PCR儀(Life Technologies),凝膠圖像分析儀(Alpha innotech),流式細(xì)胞儀(BD FACalibor)。通用型RNA提取試劑盒(廣州美基生物),Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco BRL),CCK-8 試劑盒、Lipofectamine 2000(Invitrogen),細(xì)胞RNA 提取試劑盒(北京天根生物),兔抗caspase-3 多克隆抗體、兔抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)多克隆抗體、兔抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)多克隆抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體、兔抗Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)多克隆抗體、過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Affinity),LV5-GAS5 Vector(上海吉瑪)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代 將HCT-8 細(xì)胞系或SW480 細(xì)胞系用含10% FBS、100 IU/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的McCoy's 5A 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,37℃、5%二氧化碳孵育箱,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)傳代。棄去培養(yǎng)基、清洗、消化、終止消化、離心,接種于培養(yǎng)皿中傳代,每2 天換1 次培養(yǎng)基,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 5 -FU 耐藥細(xì)胞株建立 向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5-FU 溶液,與細(xì)胞共培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)并逐步升高5-FU 濃度,篩選出對(duì)5-FU 耐藥的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR 檢測(cè)LncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌 5-FU耐藥細(xì)胞系中表達(dá) 分別經(jīng)細(xì)胞總RNA 提取、RNA質(zhì)量鑒定、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、RT-PCR 反應(yīng)、PCR 產(chǎn)物的相對(duì)定量分析。

1.5 構(gòu)建LncRNA GAS5 過(guò)表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞模型設(shè)計(jì)合成LncRNA GAS5 過(guò)表達(dá)序列,將合成的序列構(gòu)建至慢病毒載體,包裝濃縮為 LncRNA GAS5 過(guò)表達(dá)慢病毒,將LV5-GAS5 慢病毒原液加入完全培養(yǎng)基；去除原細(xì)胞培養(yǎng)液,加入病毒培養(yǎng)液,孵育箱中培養(yǎng),細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)良好后,去除培養(yǎng)基,加入病毒培養(yǎng)液,繼續(xù)孵育。同時(shí)用空載體Vector 建立對(duì)照組。

1.6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 對(duì)HCT-8 和SW480 細(xì)胞分別用LV5-GAS5 慢病毒侵染(GAS5 組)與空載體慢病毒侵染(Vector 組),轉(zhuǎn)染后24、48、72 h 后加入CCK-8 溶液,孵育4 h。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處細(xì)胞吸光度。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 對(duì)HCT-8 和SW480細(xì)胞分別用LV5-GAS5 慢病毒侵染(GAS5 組)與空載體慢病毒侵染(Vector 組),48 h 后行Annexin V/PI 雙染,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較用t檢驗(yàn)；不同轉(zhuǎn)染濃度、不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞相對(duì)增殖率,采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌5-FU 耐藥細(xì)胞系中的表達(dá) RT-PCR 檢測(cè)顯示,LncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌 HCT-8 細(xì) 胞(見(jiàn) 圖1A) 與SW480 細(xì) 胞(見(jiàn) 圖1B)中的表達(dá)水平低于正常結(jié)腸細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 LncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌5-FU 耐藥細(xì)胞系中表達(dá)情況

2.2 應(yīng)用慢病毒載體構(gòu)建LncRNA GAS5 過(guò)表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞模型 RT-PCR 檢測(cè)顯示,LV5-GAS5 組HCT-8 細(xì) 胞(見(jiàn) 圖2A)、SW480 細(xì) 胞(見(jiàn) 圖2B) 中LncRNA GAS5 表達(dá)顯著高于Vector 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 LncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌 5-FU 耐藥細(xì)胞系中表達(dá)情況

2.3 過(guò)表達(dá) LncRNA GAS5 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示,LncRNA GAS5 能明顯抑制HCT-8 細(xì)胞和 SW480 細(xì)胞的增殖(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 上調(diào)LncRNA GAS5 表達(dá)可降低結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞活性

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)LncRNA GAS5 促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡 AnnexinV/PI 雙重染色及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,在結(jié)直腸癌 HCT-8 細(xì)胞(見(jiàn)圖4A)與SW480細(xì)胞(見(jiàn)圖4B)中LV5-GAS5 組的細(xì)胞凋亡比例也明顯高于Vector 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 上調(diào)LncRNA GAS5 表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞凋亡

3 討論

LncRNA GAS5 是LncRNA 家族成員之一,其在多種癌細(xì)胞中表達(dá)異常,如胃癌、非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、乳腺癌等,被確定為多種癌癥的抑癌基因［3-6］。有研究分析結(jié)腸癌中RNA 差異表達(dá)的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),結(jié)腸腺癌中存在205 個(gè)LncRNAs 差異表達(dá),LncRNA GAS5 也參與其中［7］。然而,LncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌中的作用尚不明確。

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人們生命的惡性腫瘤之一。隨著生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變,我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年升高［8,9］。多數(shù)結(jié)直腸癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)已出現(xiàn)局部進(jìn)展或轉(zhuǎn)移,喪失手術(shù)機(jī)會(huì)［10］?；瘜W(xué)治療對(duì)其改善生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期尤為重要［10］。5-FU 可抑制胸苷酸合成酶活性干擾 DNA 制,誘導(dǎo)DNA 損傷,導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡［11］。以5-FU 為基礎(chǔ)的化療方案可有效治療結(jié)直腸癌,但目前臨床上5-FU 化療獲得性耐藥現(xiàn)象普遍發(fā)生,嚴(yán)重影響療效和預(yù)后［2］。深入研究5-FU 耐藥產(chǎn)生的機(jī)制及尋找有效的應(yīng)對(duì)策略是臨床工作中亟需解決的問(wèn)題。

研究發(fā)現(xiàn),LncRNA GAS5 參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞藥物抗性。LncRNA GAS5 可通過(guò)介導(dǎo) ABCB1 調(diào)節(jié)乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性［12］。LncRNA GAS5 通過(guò)靶向抑制 miR-223-5p,抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路,逆轉(zhuǎn)MCF-7 細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的耐藥性［13］。但LncRNA GAS5 是否參與調(diào)控結(jié)直腸癌對(duì)5-FU 的耐藥尚不清楚。

為探討LncRNA GAS5 與結(jié)直腸癌5-FU 耐藥的關(guān)系,我們檢測(cè)了結(jié)直腸癌5-FU 耐藥細(xì)胞系HCT-8 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞中LncRNA GAS5 的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn) LncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌5-FU 耐藥細(xì)胞中顯著低表達(dá)。為了進(jìn)一步探尋LncRNA GAS5 與5-FU 耐藥特性之間的關(guān)系,我們過(guò)表達(dá)HCT-8 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞中LncRNA GAS5,檢測(cè)細(xì)胞對(duì)5-FU 的敏感性及生物學(xué)行為變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)LncRNA GAS5 后,HCT-8 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞的增殖受到抑制,且細(xì)胞凋亡明顯增加。這些研究結(jié)果表明LncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌5-FU 耐藥中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述,LncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌的發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡?？蔀榕R床上尋找以LncRNA GAS5 為靶點(diǎn)的結(jié)直腸癌治療方法提供理論依據(jù)。