食用農(nóng)產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的檢測方法對比

◎ 李 龍

（龍口市檢驗檢測中心，山東 龍口 265701）

四環(huán)素類藥物是一種對多數(shù)革蘭氏陽性及陰性細菌、衣原體、支原體、原生動物寄生蟲等具有良好抑制作用的廣譜抗生素[1]。在動物養(yǎng)殖過程中常用來預(yù)防和治療細菌感染性疾病，但長期使用、濫用會導(dǎo)致四環(huán)素類藥物在動物體內(nèi)蓄積，繼而引發(fā)動物源性食品中的藥物殘留問題。長期食用四環(huán)素類藥物殘留的動物性食品可引起人類的慢性毒性、身體耐藥性的增加[2]，故四環(huán)素類藥物殘留量的檢測成為每年食用農(nóng)產(chǎn)品中監(jiān)督抽檢的重點項目。日常監(jiān)督抽檢的四環(huán)素類項目主要為金霉素、土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素4 種。涉及的檢測標(biāo)準(zhǔn)為《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.17—2021）[3]、《動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》（GB/T 21317—2007）[4]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量的測定》（GB 31656.11—2021）[5]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)禽蛋、奶和奶粉中多西環(huán)素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31659.2—2022）[6]。本文從多個方面對4 個國家標(biāo)準(zhǔn)進行詳細比較分析，為日常監(jiān)督抽檢工作中的方法選擇適用性、檢驗數(shù)據(jù)、判定依據(jù)準(zhǔn)確性提供一定的參考。

1 標(biāo)準(zhǔn)適用范圍的比較分析

按照《食品安全監(jiān)督抽檢實施細則》（2023 年版）中的食品分類，食用農(nóng)產(chǎn)品為第三十三食品大類，涉及四環(huán)素類藥物殘留量檢測的食品亞類包括畜禽肉及副產(chǎn)品、水產(chǎn)品、鮮蛋。四環(huán)素類藥物殘留量的4 個檢測標(biāo)準(zhǔn)中，GB 31658.17—2021（以下簡稱GB 31658.17）標(biāo)準(zhǔn)適用范圍為牛、羊、豬和雞的肌肉、肝臟和腎臟組織中四環(huán)素類藥物殘留量的檢測，對應(yīng)抽檢實施細則中的食品細類為豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、豬肝、豬腎。GB/T 21317—2007（以下簡稱GB/T 21317）標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍為動物肌肉、內(nèi)臟組織、水產(chǎn)品、牛奶等動物源食品中四環(huán)素類藥物殘留量的檢測，在監(jiān)督抽檢中適用于鴨肉、其他禽肉的檢測。GB 31656.11—2021（以下簡稱GB 31656.11）標(biāo)準(zhǔn)適用于魚、蝦、蟹、鱉及海參等水產(chǎn)品可食組織中4 種四環(huán)素類物質(zhì)的測定，2023 版的抽檢實施細則只涉及淡水蝦、海水蝦的食品細類。GB 31659.2—2022（以下簡稱GB 31659.2）標(biāo)準(zhǔn)適用于雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、牛奶粉、羊奶粉、牛奶和羊奶中多西環(huán)素殘留量的測定，對應(yīng)的食品細類為雞蛋、其他禽蛋（限鴨蛋、鵝蛋），且只在生產(chǎn)日期2023 年2 月1 日后的產(chǎn)品中檢測多西環(huán)素藥物殘留量。

綜上分析，GB 31658.17 為2022 年2 月1 日實施的能同時檢測動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，但是標(biāo)準(zhǔn)適用的動物種類只有牛、羊、豬、雞，靶組織包括肌肉、肝臟、腎臟，其余種類不適用，故鴨肉、其他禽肉產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的測定可選用適用范圍更廣的單類藥品殘留量檢測的國家推薦性標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21317。水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物測定標(biāo)準(zhǔn)的選用原則是按照《食品安全監(jiān)督抽檢實施細則》[7]附注1.3 中的規(guī)定：食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)有指定檢驗方法的，按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)指定檢驗方法實施，故水產(chǎn)品的四環(huán)素類藥物殘留量檢測方法選用GB 31656.11 第二法，而不選擇同樣適用的國家推薦性標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21317。食用農(nóng)產(chǎn)品中的鮮蛋產(chǎn)品（雞蛋、其他禽蛋）檢測多西環(huán)素，其標(biāo)準(zhǔn)的選用原則與水產(chǎn)品一致，選用GB 31659.2 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)作為檢驗方法，且多西環(huán)素為2023 年的新增檢驗項目，自2023 年2 月1 日GB 31659.2 標(biāo)準(zhǔn)實施開始檢測。

2 四環(huán)素類藥物殘留限量與檢驗標(biāo)準(zhǔn)的定量限對比

四環(huán)素類藥物在動物養(yǎng)殖過程中是允許使用的，故GB 31650—2019[8]食品中獸藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中，按照不同動物種類、不同靶組織規(guī)定了多西環(huán)素的殘留限量，土霉素、金霉素、四環(huán)素單個或組合的不同靶組織的限量，在畜禽肉及副產(chǎn)品、水產(chǎn)品中各靶組織的四環(huán)素類最低殘留限量為100 μg·kg-1，最高殘留限量為1 200 μg·kg-1。鮮蛋的多西環(huán)素殘留限量的判定依據(jù)為《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41 種獸藥最大殘留限量》（GB 31650.1—2022）[9]，其中家禽的蛋的最大殘留限量為10 μg·kg-1。對于有殘留限量規(guī)定的獸藥，指定檢驗方法的定量限能否達到限量的要求，是國家標(biāo)準(zhǔn)不斷更新的關(guān)注點，也是保證食品安全的關(guān)鍵。GB 31658.17 的定量限為10 μg·kg-1，GB/T 21317的測定低限位為50 μg·kg-1，GB 31656.11 第二法的定量限為10 μg·kg-1，均滿足GB 31650 食品中獸藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的100 μg·kg-1的最低殘留量要求。GB 31659.2 檢測標(biāo)準(zhǔn)的定量限為2 μg·kg-1，滿足GB 31650.1 標(biāo)準(zhǔn)中對家禽的靶組織蛋中的最大殘留限量為10 μg·kg-1的要求。

3 4 種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的前處理過程對比分析

4 個檢測標(biāo)準(zhǔn)的前處理步驟主要為樣品加Mellvaine-Na2EDTA 提取液，渦旋，超聲提取，離心，提取液過固相萃取小柱凈化，洗脫，氮吹，復(fù)溶液復(fù)溶，過膜上機。各檢測標(biāo)準(zhǔn)的具體參數(shù)[3-6]如表1 所示。

表1 4 個檢測標(biāo)準(zhǔn)前處理參數(shù)對比表

綜上分析可知，4 個檢測標(biāo)準(zhǔn)的提取步驟中，除GB 31658.17 與GB 31656.11 第二法不考慮該標(biāo)準(zhǔn)適用的樣品基質(zhì)外，GB/T 21317 的提取步驟分兩種方法，一種適用于動物肝臟、腎臟、肌肉組織、水產(chǎn)品樣品的提取，一種適用于牛奶樣品的提??；GB 31659.2 檢測標(biāo)準(zhǔn)的兩種提取方法分別適用于禽蛋、牛奶和奶粉的提取?？紤]GB/T 21317 與GB 31659.2 兩個標(biāo)準(zhǔn)的兩種提取方法大致相同，均采用第一法（樣品基質(zhì)環(huán)境復(fù)雜）與其余兩個檢測標(biāo)準(zhǔn)相比較。①4 個檢驗標(biāo)準(zhǔn)的樣品量不同，提取步驟的最終體積各不相同，但實際提取液與過柱備用液之間存在稀釋倍數(shù)，如GB 31656.11 第二法的提取步驟為樣品量2 g，總提取液20 mL，取10 mL 提取液過柱凈化，存在2 倍稀釋關(guān)系。故除GB 31659.2 的樣品量為2 g 外，其余3 個檢驗方法的最終上機質(zhì)量均為1 g。②4 個檢驗標(biāo)準(zhǔn)的提取液均為Mellvaine-Na2EDTA 溶液，GB 31658.17的二次提取利用磷酸鹽緩沖溶液提取，提取液的pH略微不同，提取液的濃度及配制方法大同小異。提取方式、離心條件方面的差異為超聲時間、溫度條件，離心溫度、轉(zhuǎn)速等具體參數(shù)的不同，超聲的溫度與時長主要與目標(biāo)組分的化學(xué)性質(zhì)、提取率有關(guān)。③4 個檢測標(biāo)準(zhǔn)的離心條件多采用低溫、高轉(zhuǎn)速離心，既避免了油脂乳化的影響，又達到高效分離。④凈化步驟均采用固相萃取小柱凈化的方式，活化柱材后，采用不同的洗脫液洗脫，除GB 31659.2 標(biāo)準(zhǔn)采用甲醇作為洗脫液，其余3 個標(biāo)準(zhǔn)均采用甲醇-乙酸乙酯作為洗脫液，洗脫液比例與洗脫液體積不同。洗脫液氮吹后復(fù)溶，4 種復(fù)溶液均為高比例水相溶液，水相添加甲酸可以增加電離，有機相則為甲醇、乙腈或兩種溶液不同比例的混合。

4 儀器設(shè)備與定量方法的比較分析

4 個檢驗標(biāo)準(zhǔn)的儀器均為帶電噴霧離子源的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，該儀器既有液相色譜的強分離能力，又具備質(zhì)譜的高靈敏度、分辨率的特性，能對分子結(jié)構(gòu)相近的四環(huán)素類藥物進行痕量分析。

4.1 液相色譜條件

液相色譜的主要技術(shù)參數(shù)為色譜柱的類型、流動相的配比與梯度洗脫程序、流速、柱溫等。具體參數(shù)[3-6]如表2 所示。

表2 不同檢測標(biāo)準(zhǔn)的液相條件表

對比分析可知，由于GB/T 21317 為2007 年的標(biāo)準(zhǔn)，存在當(dāng)時色譜柱材料技術(shù)的局限，現(xiàn)在C18柱為最常用的色譜柱，且粒徑越來越小，粒徑越小分離效果越好。色譜柱的柱長與分離效果、分離時長有關(guān)，GB 31658.17 標(biāo)準(zhǔn)中50 mm 的短柱就能達到四環(huán)素類藥物的有效分離。流動相方面，除GB/T 21317 外，其余的標(biāo)準(zhǔn)均選用0.1%甲酸溶液作為流動相的水相，甲酸與三氟乙酸均為揮發(fā)性酸，但是三氟乙酸的離子強度大于甲酸，容易造成分析物的解析，峰形改變，在液質(zhì)聯(lián)用時產(chǎn)生離子抑制效果，故低濃度的甲酸溶液為液相質(zhì)譜儀的常用水相流動相。有機相多選用甲醇或乙腈，甲醇的極性強于乙腈，實驗室方法開發(fā)時，乙腈如果能使目標(biāo)物達到有效分離，就不會混合甲醇使用。流速對分離效果的影響為流速越小，分離效果越好，分離時間越長。柱溫升高能提高分離效果，但是過高的柱溫能引起分析物性質(zhì)變化。

4.2 質(zhì)譜條件的對比

4 個檢測標(biāo)準(zhǔn)的離子源均為ESI 離子源、正離子掃描、MRM 檢測方式，由于不同檢測標(biāo)準(zhǔn)所用的液相質(zhì)譜儀生產(chǎn)廠家、設(shè)備型號不同，在離子源溫度、脫溶劑溫度、毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞電壓等方面的參數(shù)只能作為參考使用，無對比性。定性、定量離子因儀器調(diào)諧參數(shù)不同，響應(yīng)強度略有差異，導(dǎo)致同一目標(biāo)分析物在不同檢測標(biāo)準(zhǔn)中的定性、定量離子有差異，如多西環(huán)素在GB 31658.17 標(biāo)準(zhǔn)中子離子為410.2、428.2，在GB/T 21317 和GB 31656.11 第二法標(biāo)準(zhǔn)中為154、428，在GB 31659.2 標(biāo)準(zhǔn)中為321.0、154.0。

4.3 定量方法的對比

四環(huán)素類藥物殘留的測定均采用外標(biāo)法定量，除GB/T 21317 外，其余3 種方法均采用配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來定量，基質(zhì)標(biāo)曲能夠改善試劑標(biāo)曲不能解決的基質(zhì)效應(yīng)，增加回收率的準(zhǔn)確度。

5 結(jié)論與討論

動物性食品營養(yǎng)成分復(fù)雜，脂肪、蛋白質(zhì)含量高，前處理提取、凈化中干擾因素多，基質(zhì)效應(yīng)明顯。同時，獸藥殘留物具有同一類型獸藥殘留標(biāo)志物性質(zhì)相近，分子結(jié)構(gòu)相似，同分異構(gòu)體多，分離、定性、定量困難；不同類型獸藥殘留標(biāo)志物的化學(xué)性質(zhì)差異大，大部分獸藥殘留標(biāo)志物性質(zhì)不穩(wěn)定，在動物體內(nèi)極易代謝，產(chǎn)生代謝殘留標(biāo)志物的特點。難利用單一的前處理方法進行提取、定性、定量測定，多殘留同時檢測是目前學(xué)者研究的重點與熱點。通過比較分析4 個四環(huán)素類藥物殘留量的檢測標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)，除了GB 31658.17 可以同時檢測動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量，其余的檢測方法均只能檢測四環(huán)素類藥物。而日常監(jiān)督抽檢的動物性食品中獸藥殘留的檢測項目多，如磺胺類、喹諾酮類、β-受體激動劑類、四環(huán)素類、硝基呋喃類、氯霉素類等。現(xiàn)行有效的獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)大部分都是一類目標(biāo)分析物一個檢測標(biāo)準(zhǔn)，多殘留同時檢測的標(biāo)準(zhǔn)并不多，GB 31658.17 標(biāo)準(zhǔn)在利用短色譜柱，優(yōu)化流動相配比與梯度洗脫程序、柱溫的條件下，使磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類多目標(biāo)分析物達到10 μg·kg-1的定量限，為更多相似性質(zhì)的獸藥殘留標(biāo)志物的多殘留檢測優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)檢測方法提供了參考。

檢測標(biāo)準(zhǔn)涵蓋的樣品種類不全面也是影響日常檢驗工作效率的重要因素。日常監(jiān)督抽檢涵蓋樣品種類多，若不同樣品在檢驗相同目標(biāo)物時執(zhí)行不同的檢測標(biāo)準(zhǔn)，前處理操作不能進行批處理，大大影響了檢測效率。檢測方法使用不當(dāng)，也很容易出現(xiàn)超范圍檢驗、精密度、準(zhǔn)確度不達標(biāo)的問題。在《食品安全監(jiān)督抽檢實施細則》（2023 年版）中，鴨肉、其他禽肉四環(huán)素類藥物的測定，就和其他畜禽肉及副產(chǎn)品的檢測方法不同，比較分析4 個檢測標(biāo)準(zhǔn)的前處理步驟大致相同，目標(biāo)分析物相同，可以優(yōu)化提取、分離、凈化條件來統(tǒng)一不同樣品種類的前處理步驟，提高檢驗的批處理能力。