間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體治療椎間盤(pán)退變的機(jī)制研究進(jìn)展

楊超強(qiáng) 張虎林 汪小敏 王亮 王宜燦

【摘 要】 椎間盤(pán)退變是一種以髓核細(xì)胞凋亡減少、細(xì)胞外基質(zhì)降解加速為主要病理特征，常伴隨慢性腰痛或下肢神經(jīng)根性疼痛等臨床表現(xiàn)的脊柱疾病。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展及椎間盤(pán)退變機(jī)制的不斷研究，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體作為一種用于細(xì)胞間通訊的活性生物物質(zhì)，已被證實(shí)在椎間盤(pán)再生中具有治療潛力。其可抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖和再生，提高體外細(xì)胞外基質(zhì)的生成，具有逆轉(zhuǎn)或者中止椎間盤(pán)退變的潛能。綜述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體的生物學(xué)特性和功能及其在椎間盤(pán)退變治療中的作用及機(jī)制，以期為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

【關(guān)鍵詞】 椎間盤(pán)退變；間充質(zhì)干細(xì)胞；外泌體；下腰痛；機(jī)制；研究進(jìn)展；綜述

下腰痛（low back pain，LBP）是一種非常普遍的脊柱疾病，也是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致殘疾的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，特定時(shí)間內(nèi)，一般人群中LBP的平均患病率約為18%，1年患病率約為38%［1］。隨著我國(guó)老年人口的增多和現(xiàn)代生活方式的變化，LBP發(fā)病率呈低齡化趨勢(shì)。椎間盤(pán)退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是LBP廣泛認(rèn)可的因素之一。導(dǎo)致IDD的原因尚不清楚，但有學(xué)者認(rèn)為，年齡、異常機(jī)械應(yīng)力、創(chuàng)傷、營(yíng)養(yǎng)缺乏和遺傳等因素可能涉及其中［2］。IDD由于代謝失衡，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的變化、髓核細(xì)胞的丟失、過(guò)度氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)惡化，軟骨終板內(nèi)的微孔鈣化，使氣體和營(yíng)養(yǎng)物交換遭受損害［3］。目前，保守及手術(shù)治療效果欠佳，不能延緩或逆轉(zhuǎn)其退變進(jìn)程，因此需要新的治療方案直接解決IDD的原因，保留或恢復(fù)椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)和機(jī)械功能。

由于目前治療IDD的局限性，越來(lái)越多的研究致力于退行性椎間盤(pán)再生，主要集中于生物活性分子注射、細(xì)胞治療、組織工程和基因治療等領(lǐng)域，其中干細(xì)胞治療被廣泛關(guān)注［4-5］。干細(xì)胞分泌的外泌體在再生醫(yī)學(xué)中發(fā)揮了重要作用，通過(guò)維持內(nèi)源性干細(xì)胞、抑制凋亡和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等方面治療IDD［6］。外泌體也可以分化為髓核樣細(xì)胞，并補(bǔ)充機(jī)體減少的髓核細(xì)胞，延緩IDD進(jìn)展。本文綜述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos）在IDD治療方面的研究進(jìn)展，并為臨床工作提供指導(dǎo)。

1 MSC-Exos的生物學(xué)特性及功能

隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，外泌體作為細(xì)胞間通訊的活性生物物質(zhì)，其促進(jìn)組織再生的能力取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。MSC-Exos是研究最廣泛的外泌體來(lái)源之一，其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞來(lái)源豐富，易于得到，親本細(xì)胞來(lái)源局限小，生物安全性高［7］。MSC-Exos是一種直徑為50～200 nm的膜性扁平狀雙層納米級(jí)膜狀囊泡，源自多泡內(nèi)核小體，可通過(guò)離心、超濾、尺寸排除色譜等方法分離提取［8］。MSC-Exos鑒定的重點(diǎn)是形狀、大小和標(biāo)記蛋白，可通過(guò)多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)。MSC-Exos可直接從血漿、精液、尿液等體液獲得，并可以有效地運(yùn)輸?shù)鞍缀蚏NA等生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞間通訊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用［9］。

MSC-Exos是細(xì)胞分泌出的一種小囊泡，包含核酸、蛋白質(zhì)、脂類等多種成分［10］。其中，脂類對(duì)外泌體的穩(wěn)定性和運(yùn)輸過(guò)程中成分的保護(hù)起重要作用。MSC-Exos中包含多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能參與MSC-Exos的形成和細(xì)胞間通訊。此外，MSC-Exos中還含有大量的核酸，包括mRNA、miRNA等，這些核酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄影響細(xì)胞功能。MSC-Exos作為一種細(xì)胞間通訊的信使，能夠被靶細(xì)胞通過(guò)多種方式攝取，從而影響靶細(xì)胞的功能，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。

2 MSC-Exos對(duì)椎間盤(pán)變性的調(diào)控機(jī)制

MSC-Exos作為促進(jìn)椎間盤(pán)修復(fù)的潛在細(xì)胞外囊泡，其潛在機(jī)制可能是負(fù)責(zé)維持內(nèi)源性干細(xì)胞，通過(guò)促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖和維持ECM穩(wěn)態(tài)，向受損組織輸送免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡、減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等，進(jìn)而發(fā)揮延緩IDD的作用。

2.1 參與ECM的產(chǎn)生與降解 在IDD過(guò)程中，ECM的合成代謝紊亂，表現(xiàn)為髓核細(xì)胞和纖維內(nèi)環(huán)細(xì)胞合成的Ⅱ型膠原蛋白減少，Ⅰ型膠原蛋白合成增加。此外，大量的細(xì)胞內(nèi)炎癥因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在椎間盤(pán)細(xì)胞外釋放，導(dǎo)致ECM中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）與血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶（ADAMTS）的高表達(dá)，這兩種酶作為髓核細(xì)胞變性的標(biāo)志蛋白，均能破壞ECM。MSC-Exos在促進(jìn)椎間盤(pán)再生的治療效果中發(fā)揮著重要作用。MSC-Exos可以增強(qiáng)神經(jīng)元前體細(xì)胞（NPCs）中ECM重建表達(dá)，抑制MMPs的表達(dá)，促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖和維持ECM穩(wěn)態(tài)。LU等［11］發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos干預(yù)后，MMP-1和MMP-3的表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致退變髓核細(xì)胞中ECM的表達(dá)顯著增加。QI等［12］發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos可以通過(guò)抑制p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）磷酸化減少ECM降解。IDD與ECM中的硫酸軟骨素密切相關(guān)，而硫酸軟骨素合酶是髓核細(xì)胞中ECM合成的關(guān)鍵酶之一。蔣長(zhǎng)青等［13］發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos中富含的miRNA-199/miRNA-16/miRNA-195可與IL/TNF的NF-κB通路結(jié)合，減少I(mǎi)L/TNF的合成，促進(jìn)硫酸軟骨素合酶表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ECM合成。周榮耀等［14］發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos可以通過(guò)增加基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1的表達(dá)減少ECM的降解。綜上所述，筆者進(jìn)一步深入研究認(rèn)為，作為椎間盤(pán)的主要成分，MMPs和ADAMTS是降解膠原蛋白和蛋白聚糖的主要酶，它們通過(guò)聯(lián)合作用降低ECM含量并導(dǎo)致IDD。因此，維持ECM的合成/降解平衡對(duì)于延緩IDD極為重要，這意味著NPCs中膠原蛋白、蛋白聚糖、MMPs和ADAMTS的表達(dá)保持在正常水平至關(guān)重要。

2.2 促進(jìn)抗炎反應(yīng) 根據(jù)研究，炎性小體通過(guò)增加IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，誘導(dǎo)MMPs和ADAMTS的產(chǎn)生，參與IDD的病理過(guò)程。而外泌體能顯著抑制凋亡NPCs的炎癥反應(yīng)和炎癥體的形成，可誘導(dǎo)存活細(xì)胞微環(huán)境的恢復(fù)，減少對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的干擾［15］。MSC-Exos可降低H2O2誘導(dǎo)的一氧化氮合酶和IL-6等炎癥因子的表達(dá)，表明外泌體可減輕炎癥反應(yīng)［16］。MSC-Exos已被證明通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB通路下調(diào)炎癥反應(yīng)，通過(guò)傳遞靶向混合系激酶3的miR-142-3p減少I(mǎi)L-1β誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子分泌和MAPK信號(hào)通路激活［17］。XIA等［18］研究退行性髓核和正常髓核，發(fā)現(xiàn)退行性椎間盤(pán)中差異表達(dá)的150個(gè)蛋白與炎癥反應(yīng)增強(qiáng)密切相關(guān)，由此表明，干細(xì)胞衍生的外泌體可以通過(guò)調(diào)控其相關(guān)蛋白內(nèi)容物減輕椎間盤(pán)的炎癥反應(yīng)，減少ECM的降解。WANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類動(dòng)物腦疝模型中的髓核細(xì)胞產(chǎn)生含有miR-223的外泌體，該外泌體已被證明通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB通路下調(diào)炎癥反應(yīng)。YUAN等［20］研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos攜帶AntagomiR-4450，可以治療小鼠的椎間盤(pán)退化。該研究證實(shí)，抑制miR-4450可上調(diào)鋅指蛋白（ZNF121），從而減輕炎癥、凋亡和椎間盤(pán)細(xì)胞損傷。以上研究均表明，外泌體可能通過(guò)參與抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮延緩或逆轉(zhuǎn)IDD的作用。綜上所述，筆者認(rèn)為，炎癥作為IDD的標(biāo)志之一，一直伴隨著促炎細(xì)胞因子的釋放，被認(rèn)為是導(dǎo)致椎間盤(pán)源性疼痛的關(guān)鍵因素。炎癥細(xì)胞因子的相互作用和異常表達(dá)可引起炎癥并加速I(mǎi)DD。此外，炎性細(xì)胞因子還可以加速細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、激活ECM降解蛋白的表達(dá)并抑制ECM結(jié)構(gòu)分子的表達(dá)，以增強(qiáng)退化過(guò)程。相信隨著MSC-Exos的深入研究，MSC-Exos通過(guò)參與抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮延緩或逆轉(zhuǎn)IDD的作用將十分凸顯。

2.3 抑制髓核細(xì)胞凋亡 IDD主要因?yàn)檠装Y反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等不利因素導(dǎo)致的NPCs凋亡減少進(jìn)而引起ECM降解。CHENG等［21］的一項(xiàng)研究用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體治療TNF-α誘導(dǎo)的凋亡NPCs，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率明顯低于其他組。GUO等［22］通過(guò)觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）及C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）在退變椎間盤(pán)內(nèi)NPCs的表達(dá)及其與NPCs凋亡的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)MSC-Exos誘導(dǎo)后的NPCs可以明顯抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)通路和凋亡標(biāo)志物的表達(dá)；表明MSC-Exos可以通過(guò)降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子CHOP的水平，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在大鼠模型中，通過(guò)椎間盤(pán)內(nèi)注射MSC-Exos發(fā)現(xiàn)，由MSC-Exos衍生而來(lái)的miR-21可以抑制磷酸酶和張力素同源物，激活PI3K-AKT通路，從而緩解髓核細(xì)胞凋亡和椎間盤(pán)變性［23］。ZHU等［24］研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos傳輸?shù)膍iR-532-5p可以靶向促進(jìn)RASSF5基因敲除以減少NPCs凋亡。研究表明，AGEs在髓核組織中積累，可以通過(guò)激活UPR誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡，而MSC-Exos可以通過(guò)激活A(yù)KT和ERK信號(hào)通路減輕AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以降低髓核細(xì)胞的凋亡率［25］。筆者認(rèn)為，正常的凋亡可以維持內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定性，這是由基因控制的自主程序性細(xì)胞死亡，而高凋亡率和衰老導(dǎo)致NPCs減少，意味著過(guò)度凋亡可降低椎間盤(pán)組織中NPCs的密度，破壞椎間盤(pán)的結(jié)構(gòu)和功能，并導(dǎo)致IDD。研究證實(shí)，MSC-Exos通過(guò)外源性和內(nèi)源性途徑均參與抑制NPCs凋亡過(guò)程，因此，減少NPCs凋亡將延緩甚至逆轉(zhuǎn)IDD進(jìn)程。

2.4 通過(guò)miRNA調(diào)控椎間盤(pán)組織修復(fù) 外泌體可以改變椎間盤(pán)中許多miRNA的自我表達(dá)水平，特別是一些重要的miRNA分子，作為外泌體處理組織損傷和修復(fù)的有效調(diào)節(jié)因子，它們可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。當(dāng)NPCs受到影響時(shí)，不僅外泌體自身攜帶的miRNA可以抑制細(xì)胞凋亡，還可以通過(guò)外泌體運(yùn)載特異性miRNA使其成為具有特定效應(yīng)的載體。ZHANG等［26］研究脂多糖誘導(dǎo)的NPCs凋亡，發(fā)現(xiàn)MSC-Exos衍生物miR?410可以直接與NPCs中的炎性小體（NLRP3）mRNA結(jié)合，從而降低NLRP3表達(dá)，抑制半胱氨酸蛋白酶（Caspase?1）和細(xì)胞焦亡蛋白（Gasdermin D）的表達(dá)，以發(fā)揮明顯的抑制NPCs凋亡作用。龔東亮等［27］觀察外泌體的形態(tài)，比較分析血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白在IDD中的表達(dá)陽(yáng)性率，以及miR-21、HO-1和Bach1在大白兔椎間盤(pán)組織中的表達(dá)，并通過(guò)造模處理、分泌物提取、免疫組化染色、Rt-PCR檢測(cè)、HE染色，及流式細(xì)胞術(shù)觀察大白兔椎間盤(pán)組織的形態(tài)學(xué)變化，觀察大白兔退行性髓核細(xì)胞的凋亡能力。結(jié)果表明，MSC-Exos分泌調(diào)節(jié)miR-21，抑制Bach1，從而促進(jìn)HO-1機(jī)制修復(fù)椎間盤(pán)疾病的能力，進(jìn)而促進(jìn)退變組織細(xì)胞凋亡。徐辰［28］使用高通量檢測(cè)和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可以顯著改善髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，這意味著轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子如miRNA等與外泌體促進(jìn)IDD中ECM合成密切相關(guān)。利用高通量miRNA分析MSC-Exos，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一批具有CHSY抑制作用的NF-κB靶向miRNA，并通過(guò)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。總之，筆者進(jìn)一步深入研究認(rèn)為，MSC-Exos可能通過(guò)其所含miRNAs參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞功能，以實(shí)現(xiàn)椎間盤(pán)的修復(fù)和轉(zhuǎn)化，miRNAs的表達(dá)譜與髓核細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)，以及ECM重塑等密切相關(guān)，這意味著它在調(diào)節(jié)組織再生方面具有良好的應(yīng)用前景。

3 MSC-Exos治療椎間盤(pán)的體內(nèi)研究

大量研究表明，MSC-Exos在體內(nèi)治療IDD有效，并取得了不錯(cuò)的結(jié)果。XIE等［29］通過(guò)叔丁基過(guò)氧化氫（TBHP）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型和IDD大鼠模型研究MSC-Exos對(duì)終板軟骨細(xì)胞（EPCs）的作用發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos可抑制EPCs的細(xì)胞凋亡和鈣化。ZHOU等［30］研究體內(nèi)缺氧微環(huán)境下MSC-Exos是否對(duì)保護(hù)IDD表現(xiàn)出更有益的作用；采用尾部IDD大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos

可能通過(guò)TLR4途徑調(diào)節(jié)人髓細(xì)胞核細(xì)胞基質(zhì)的增殖和合成。筆者認(rèn)為，MSC-Exos可能通過(guò)改善體內(nèi)和體外合成代謝和分解代謝之間的穩(wěn)態(tài)失衡緩解IDD，為IDD提供了新的治療靶點(diǎn)。XIA等［18］采用兔IDD模型研究外泌體對(duì)IDD的治療效果，結(jié)果表明，MSC-Exos通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)和NLRP3炎癥小體活化，在病理性髓核細(xì)胞中起抗炎作用。由此可以推斷，NLRP3炎癥小體是IDD治療的有效靶點(diǎn)，注射外泌體可能是一種有前途的治療策略。LUO等［31］通過(guò)體內(nèi)注射軟骨終板干細(xì)胞修飾的水凝膠到大鼠軟骨終板附近后，軟骨終板干細(xì)胞衍生的外泌體通過(guò)Sphk2/AKT途徑平衡自噬和衰老，抑制IDD。筆者認(rèn)為，本研究為IDD治療提供了一種新穎有效的非侵入性手術(shù)治療策略，使用可注射的ECM凝膠并持續(xù)釋放功能性外泌體以延緩IDD進(jìn)程?？傊?，這些研究表明，MSC-Exos通過(guò)增加ECM的產(chǎn)生，減少NPCs的凋亡，提高相關(guān)細(xì)胞存活率，平衡細(xì)胞自噬和衰老，調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。這些結(jié)果證實(shí)了體外研究的結(jié)果，為IDD提供了一種新的再生治療方法。

4 小結(jié)與展望

椎間盤(pán)是體內(nèi)最大的無(wú)血管組織，生理環(huán)境復(fù)雜，高壓、高通透性、低pH、低營(yíng)養(yǎng)、低氧的微環(huán)境不利于髓核細(xì)胞的增殖。在退行性椎間盤(pán)中，復(fù)雜的炎癥環(huán)境、細(xì)胞數(shù)量減少和纖維化可能影響體內(nèi)和體外結(jié)果。此外，IDD是一個(gè)涉及多種因素的病理過(guò)程，其確切機(jī)制尚未確定。因此，針對(duì)特定原因選擇合適的外泌體非常重要。多項(xiàng)研究表明，外泌體參與并減輕IDD的多種病理生理過(guò)程，MSC-Exos調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞的功能，主要通過(guò)細(xì)胞間通訊及其內(nèi)容物的表觀遺傳修飾，從而使活性髓核細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)。此外，外泌體還參與促進(jìn)ECM合成、抑制ECM降解及細(xì)胞凋亡、抗炎反應(yīng)等作用。同時(shí)，外泌體應(yīng)用于IDD治療仍存在許多問(wèn)題，例如，外泌體提取分離、靶向轉(zhuǎn)移、藥物劑量、療效評(píng)價(jià)，以及其相關(guān)產(chǎn)品的細(xì)胞源、類型、制備工藝等方面差異較大，而治療機(jī)制和體內(nèi)活性等相較傳統(tǒng)藥物更加復(fù)雜。因此，需要進(jìn)一步深入研究外泌體的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，優(yōu)化培養(yǎng)和移植條件，并進(jìn)行更多的臨床前試驗(yàn)驗(yàn)證外泌體的安全性。隨著對(duì)椎間盤(pán)及外泌體研究的深入，相信IDD治療中外泌體的研究應(yīng)用前景會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大。

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收稿日期：2023-01-27；修回日期：2023-03-08