小鼠中央內(nèi)側(cè)丘腦-前額葉皮層通路在丙泊酚麻醉中的作用

陳倚秋,高敬巖,付 豹

0 引 言

丙泊酚作為臨床常見(jiàn)的全身麻醉藥物,其如何可逆性引起意識(shí)消失,目前仍不完全清楚。中央內(nèi)側(cè)丘腦(central medial thalamus, CMT)作為中線核團(tuán)板內(nèi)群中的其中之一核團(tuán),可接受皮質(zhì)大腦皮質(zhì)信息輸入,同時(shí)也可向皮質(zhì)投射形成皮質(zhì)-丘腦-皮質(zhì)通路,對(duì)非快動(dòng)眼睡眠(non rapid eye movement sleep,NREM)、睡眠恢復(fù)和覺(jué)醒具有重要作用［1］。本研究前期顯示CMT參與丙泊酚麻醉蘇醒過(guò)程,而具體通路尚不清楚［2-3］。內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortex, mPFC)作為執(zhí)行高級(jí)功能的前額葉皮層(prefrontal cortex, PFC)的一部分,在意識(shí)形成和維持中具有重要作用。七氟烷麻醉中,mPFC注射卡巴酚可減少進(jìn)入清醒狀態(tài)的潛伏期,增加進(jìn)入清醒狀態(tài)的時(shí)間,扭轉(zhuǎn)麻醉相關(guān)特征,從而達(dá)到喚醒作用［4-5］;除此之外,mPFC的失活可促進(jìn)七氟烷麻醉誘導(dǎo)并延長(zhǎng)麻醉時(shí)間［2,6］。此外,作為意識(shí)形成的高級(jí)中樞,mPFC其與許多與睡眠-覺(jué)醒相關(guān)核團(tuán)有廣泛的聯(lián)系［7］。CMT與mPFC之間也存在聯(lián)系,因此CMT-mPFC通路可能參與丙泊酚麻醉過(guò)程［8］。因此,本研究旨在運(yùn)用鈣信號(hào)、化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)分析CMT-mPFC通路在全身麻醉中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料健康成年雄性C57BL/6JJ(8-12周齡,20-25 g)小鼠,共40只,購(gòu)買自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004。常規(guī)飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn),12 h白天/夜晚輪換人工光照,自由進(jìn)食進(jìn)水及活動(dòng)。丙泊酚(樂(lè)維靜,國(guó)藥準(zhǔn)字H20030115),氯氮平-N-氧化物(CNO, MedChemExpress),異氟醚(瑞沃德生命科技有限公司),鈣信號(hào)病毒(rAAV-hSyn-GCaMp6s-WPRE-hGH-polyA,Ca信號(hào)病毒,武漢樞密科學(xué)技術(shù)有限公司),化學(xué)遺傳激活病毒(rAAV-Efl-DIO-hM3D(Gq)-EGFP-WPRE,M3,武漢樞密科學(xué)技術(shù)有限公司),化學(xué)遺傳抑制病毒(rAAV-Efl-DIO-hM4D(Gi)-EGFP-WPREs,M4,武漢樞密科學(xué)技術(shù)有限公司),特異性化學(xué)遺傳空病毒(rAAv-Efl-DIO-EGFP-WPRE-pA,武漢樞密科學(xué)技術(shù)有限公司),逆行標(biāo)記病毒(AAV2/Retro-rAAV-hSyn-CRE-mCherry-hGH,武漢樞密科學(xué)技術(shù)有限公司),光纖陶瓷插芯(Fiber Core:200 um,NA:0.37,Fiber Length:2.8 mm,杭州紐頓科技有限公司)。

1.2鈣信號(hào)模型隨機(jī)數(shù)字選取8只小鼠,以1.4%異氟醚麻醉后持續(xù)維持,待呼吸穩(wěn)定且翻正反射消失(loss of right reflex,LORR)后將其固定于立體定位儀上。剔除頭部毛發(fā)后碘伏消毒,沿著顱骨中線暴露頭皮。根據(jù)Bregma和Lambda點(diǎn)進(jìn)行前后、左右調(diào)平,保持顱骨水平。依據(jù)小鼠腦圖譜,以Bregma點(diǎn)為參照點(diǎn)定位CMT的注射位點(diǎn)(AP:-1.2 mm,ML:0.0 mm,DV:-3.6 mm)和mPFC的注射位點(diǎn)(AP:+1.7 mm,ML:0.3 mm,DV:-2.6 mm)。使用顱骨鉆暴露硬腦膜后用針尖戳破硬腦膜,使用棉簽清理顱骨孔周圍。在CMT處注射病毒,以20 nL/min速度抽取鈣信號(hào)病毒,以20 nL/min速度向目標(biāo)腦區(qū)注射量為200 nL病毒,注射針原位停留10 min;注射病毒后將光纖陶瓷插芯緩慢插入mPFC區(qū)并固定。手術(shù)后小鼠獨(dú)籠飼養(yǎng),3周病毒轉(zhuǎn)染后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄。

1.3化學(xué)遺傳學(xué)模型根據(jù)注射病毒不同按隨機(jī)數(shù)字表法分成:化學(xué)遺傳激活組(M3組)、化學(xué)遺傳抑制組(M4組)、化學(xué)遺傳空病毒組(對(duì)照組),每組8只。按上述方法麻醉和固定小鼠,暴露頭皮并進(jìn)行調(diào)平。置入腦電記錄電極,采用牙科水泥將電極固定在顱骨表面。手術(shù)后小鼠獨(dú)籠飼養(yǎng),3周病毒轉(zhuǎn)染后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄。M3組:在mPFC處注射病毒,以20 nL/min速度抽取M3病毒,以20 nL/min速度注射200 nL病毒到目標(biāo)腦區(qū),注射針原位停留10 min;在CMT處注射M3病毒,以20 nL/min速度抽取病毒注射到目標(biāo)腦區(qū),以20 nL/min速度注射200 nL病毒到目標(biāo)腦區(qū),注射針原位停留10 min,置入腦電記錄電極,采用牙科水泥將電極固定在顱骨表面。M4組:在mPFC處注射M4病毒,以20 nL/min速度抽取病毒,以20 nL/min速度注射200 nL病毒到目標(biāo)腦區(qū),注射針原位停留10 min;在CMT處注射病毒M4病毒,以20 nL/min速度抽取病毒注射到目標(biāo)腦區(qū),以2 0 nL/min速度注射200nL病毒到目標(biāo)腦區(qū),注射針原位停留10 min,置入腦電記錄電極,采用牙科水泥將電極固定在顱骨表面。對(duì)照組:在mPFC處注射病毒,以20 nL/min速度抽取逆行病毒,以20 nL/min速度注射200 nL病毒注射到目標(biāo)腦區(qū),注射針原位停留10 min;在CMT處注射對(duì)照病毒,以20 nL/min速度抽取病毒注射到目標(biāo)腦區(qū),以20 nL/min速度注射200 nL病毒到目標(biāo)腦區(qū),注射針原位停留10 min。手術(shù)后小鼠獨(dú)籠飼養(yǎng),3周病毒轉(zhuǎn)染后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄。置入腦電記錄電極,采用牙科水泥將電極固定在顱骨表面。

1.4光纖鈣信號(hào)實(shí)驗(yàn)在避光條件下,測(cè)量原始的光強(qiáng)待基線穩(wěn)定后,將小鼠在透明誘導(dǎo)箱內(nèi)適應(yīng)10 min后,連接跳線與小鼠頭部的陶瓷插芯,記錄小鼠的光纖信號(hào)。清醒狀態(tài)下記錄5 min,然后以20 mg/kg劑量尾靜脈單次注射丙泊酚,標(biāo)記小鼠翻正反射消失(loss of right reflex,LORR)和翻正反射恢復(fù)(recovery of right reflex,RORR)時(shí)間點(diǎn),待小鼠RORR后繼續(xù)記錄5 min。LORR定義為將小鼠置于仰臥位,30 s內(nèi)不能從仰臥位變?yōu)楦┡P位。RORR定義為小鼠在仰臥位時(shí),5 s內(nèi)能夠恢復(fù)正常體位(即四腳同時(shí)著地)。選取LORR和RORR兩個(gè)事件前后100 s時(shí)間段:即LORR前100 s即(-100 s)、LORR后100 s(-100-0 s)、RORR前100 s即(-100 s)、RORR后100 s(-100-0 s)四個(gè)部分分析Ca2+信號(hào)。

1.5化學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)

1.5.1 行為學(xué)記錄將3組化學(xué)遺傳模型小鼠在實(shí)驗(yàn)前90 min小鼠腹腔注射氯氮平N-氧化物(CNO)1 mg/kg或等滲鹽水1 mg/kg(作為自身對(duì)照),90 min藥物起效高峰開(kāi)始實(shí)驗(yàn)記錄。用腦電連接線連接小鼠頭部腦電記錄板與腦電記錄記錄系統(tǒng)連續(xù)記錄腦電信號(hào),觀察并記錄小鼠RORR時(shí)間。RORR時(shí)間以停止麻醉注射時(shí)間為起點(diǎn),大鼠翻正反射恢復(fù)的時(shí)間為終點(diǎn)計(jì)算而得。

1.5.2腦電記錄實(shí)驗(yàn)前30 min時(shí)3組化學(xué)遺傳模型小鼠腹腔注射CNO (1 mg/kg)或等滲鹽水(1 mg/kg)(作為自身對(duì)照),90 min藥物起效高峰后將小鼠放入誘導(dǎo)箱內(nèi)適應(yīng)10 min后,以20 mg/kg劑量尾靜脈單次注射丙泊酚,使小鼠出現(xiàn)LORR,并且連續(xù)記錄mPFC腦電活動(dòng),觀察注射CNO或等滲鹽水對(duì)小鼠mPFC腦電活動(dòng)［δ波(1～4 Hz)、θ波(4-8 Hz)、α波(8～12 Hz)、β波(12～25 Hz)、γ波(25～60 Hz)］的影響。待小鼠RORR出現(xiàn)則停止腦電記錄。

1.5.3免疫熒光及免疫組化驗(yàn)證待以上實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均進(jìn)行組織學(xué)驗(yàn)證,確定病毒位置是否注射正確。1.4%異氟醚麻醉后,立刻在劍突下取適當(dāng)?shù)那锌?充分暴露小鼠心臟,4%的多聚甲醛灌流固定腦組織,灌流結(jié)束后斷頭咬除顱骨,取出腦組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定24 h,再將其浸泡在30%葡萄糖溶液中。腦組織沉底后,根據(jù)解剖標(biāo)志確定CMT位置,利用振蕩切片機(jī)進(jìn)行冠狀位組織切片,厚度為30 μm。將切片置于熒光顯微鏡下觀察病毒注射位置是否正確,將病毒位置準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,位置不正確的數(shù)據(jù)舍棄。

1.6分析指標(biāo)鈣信號(hào)實(shí)驗(yàn)分析指標(biāo)為Ca+信號(hào)指標(biāo),選取小鼠單次丙泊酚(20 mg/kg)尾靜脈注射后LORR和RORR兩個(gè)事件前后100 s時(shí)間段中四個(gè)部分:清醒期,即LORR前100 s(-100 s);麻醉期,LORR后100s(-100-0 s);麻醉期,RORR前100 s(-100 s);蘇醒期,RORR后100s(-100-0 s),分析Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度變化?；瘜W(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)分析指標(biāo)包括行為學(xué)指標(biāo)、化學(xué)遺傳腦電指標(biāo)。行為學(xué)指標(biāo):計(jì)算RORR時(shí)間(以停止麻醉注射時(shí)間為起點(diǎn),小鼠翻正反射恢復(fù)的時(shí)間為終點(diǎn)計(jì)算而得)?；瘜W(xué)遺傳腦電指標(biāo):記錄時(shí)長(zhǎng)以小鼠在誘導(dǎo)箱內(nèi)適應(yīng)時(shí)間為起點(diǎn),小鼠翻正反射恢復(fù)后5 min為終點(diǎn)。腦電分析包括五個(gè)頻段,即:δ波(1-4 Hz)、θ波(4-8 Hz)、α波(8-12 Hz)、β波(12-25 Hz)、γ波(25-60 Hz)。

2 結(jié) 果

2.1 丙泊酚麻醉對(duì)CMT-mPFC通路鈣信號(hào)的影響在丙泊酚誘導(dǎo)至LORR過(guò)程中,與蘇醒期比較,丙泊酚麻醉期Ca+信號(hào)明顯升高(P<0.01);丙泊酚麻醉至RORR期間,與丙泊酚麻醉期比較,蘇醒期Ca+信號(hào)明顯上升(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

a、b、c:分別為L(zhǎng)ORR時(shí)的線圖、熱圖及鈣信號(hào)變化;d、e、f、:分別為RORR后的線圖、熱圖及鈣信號(hào)變化

2.2化學(xué)遺傳調(diào)控CMT-mPFC通路在丙泊酚中的作用

2.2.1 激活CMT-mPFC通路在丙泊酚中的作用M3組注射CNO后,RORR時(shí)間較對(duì)照組注射CNO后明顯縮短(P<0.001),腦電圖的δ波頻段較對(duì)照組注射CNO后的功率降低(P<0.05)。M3組注射等滲鹽水后,RORR時(shí)間較注射CNO后明顯延長(zhǎng)(P<0.05 ),腦電圖的δ波、θ波頻段的功率較注射CNO后升高(P<0.01),腦電圖的γ波功率較注射CNO后降低(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

2.2.2抑制CMT-mPFC通路在丙泊酚中的作用M4組注射CNO后腦電圖的δ波頻段較對(duì)照組注射CNO后的功率增加(P<0.01)。M4組注射等滲鹽水后,RORR時(shí)間較注射CNO后明顯縮短(P<0.05 ),腦電圖δ波頻段的功率較注射CNO后降低(P<0.05),腦電圖β波、γ波頻段的功率較注射CNO后升高(P<0.01)。見(jiàn)表1、表2?；瘜W(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將小鼠灌注取腦,熒光顯微鏡下可觀察到實(shí)驗(yàn)小鼠注射的化學(xué)遺傳病毒位置在CMT腦區(qū),證明位置正確。見(jiàn)圖2。

表 1 各組注射CNO、等滲鹽水的LORR時(shí)間比較

表 2 各組注射CNO、等滲鹽水前后腦電的比較

a:CMT注射化學(xué)遺傳病毒;b:mPFC投射至CMT處逆行病毒;c:化學(xué)遺傳病毒與逆行病毒共染

3 討 論

CMT作為中線丘腦中一個(gè)重要的核團(tuán),研究發(fā)現(xiàn),CMT的損傷與覺(jué)醒、認(rèn)知和睡眠障礙有關(guān)［1］。在丙泊酚麻醉大鼠的CMT中注射去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)時(shí)候發(fā)現(xiàn),增加皮層腦電θ波頻率,從而加速大鼠皮層腦電的覺(jué)醒［9］。除此之外,其參與維持覺(jué)醒及全身麻醉,當(dāng)激活CMT神經(jīng)元時(shí),可促進(jìn)非快速眼動(dòng)睡眠(non-rapid eye movements, NREM)向清醒狀態(tài)轉(zhuǎn)變［10-11］。

mPFC作為大腦皮層重要組成部分,研究發(fā)現(xiàn)在全身麻醉或深度睡眠時(shí),mPFC的活動(dòng)減少;且前額葉皮質(zhì)失活可延遲七氟醚麻醉的蘇醒［6,12］。作為mPFC的亞結(jié)構(gòu)邊緣前皮層(prelimbic cortex,PL)和邊緣下皮層(infralimbic cortex ,IL)可接受從中線丘腦(midline thalamus,MT)區(qū)域接收功能輸入［13］。而丙泊酚誘導(dǎo)的意識(shí)下降可造成額葉網(wǎng)絡(luò)中的皮質(zhì)皮質(zhì)和丘腦皮層連通性降低［14］。最近一項(xiàng)研究表明,丘腦與內(nèi)側(cè)前額葉的功能連接在在丙泊酚麻醉期間減少最多［15］。既往研究發(fā)現(xiàn)CMT與mPFC之間存在投射關(guān)系［8］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CMT-mPFC通路中神經(jīng)元參與丙泊酚麻醉過(guò)程。本研究首先采用鈣信號(hào)方法來(lái)檢測(cè)在丙泊酚麻醉期間該通路中神經(jīng)元是否會(huì)有變化。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, CMT-mPFC通路中神經(jīng)元在丙泊酚麻醉時(shí)出現(xiàn)鈣信號(hào)活性的降低,而在之后蘇醒階段中,鈣信號(hào)的活性上升。因此認(rèn)為CMT-mPFC通路中神經(jīng)元活性在丙泊酚麻醉過(guò)程中有變化。

本研究采用化學(xué)遺傳方法進(jìn)一步調(diào)控CMT-mPFC通路中的神經(jīng)元,為研究CMT-mPFC通路中神經(jīng)元在丙泊酚麻醉中對(duì)小鼠的行為學(xué)和皮層腦電的影響?？砂l(fā)現(xiàn)盡管從組織學(xué)層面證明CMT-mPFC存在投射關(guān)系,但無(wú)論是激活還是抑制CMT-mPFC通路中神經(jīng)元,對(duì)小鼠行為學(xué)的影響并不是很大,這可能是因?yàn)镃MT作為丘腦非特異性核團(tuán)之一,其可以向紋狀體提供最重的丘腦輸入,但是對(duì)皮質(zhì)的投射相對(duì)較弱的原因［16-20］。這一點(diǎn)與本研究熒光染色圖所表述的相一致;除此之外,腦中眾多核團(tuán)在麻醉中也具有促蘇醒的作用,這也可能麻醉調(diào)節(jié)也受到其他核團(tuán)的調(diào)控［21］。因而盡管CMT-mPFC通路會(huì)對(duì)麻醉有所影響,但可能不是發(fā)揮主要作用的通路。

而小鼠除了行為學(xué)變化外,激活或抑制CMT-mPFC通路神經(jīng)元時(shí)可皮層腦電的變化;當(dāng)激活CMT-mPFC通路神經(jīng)元時(shí),可降低θ波的功率,增加γ波的功率。然而,抑制CMT-mPFC通路神經(jīng)元時(shí),可使皮層腦電中的δ功率顯著增加,β波和γ波功率降低。這些數(shù)據(jù)表明無(wú)論是激活還是抑制CMT-mPFC通路神經(jīng)元,都可以對(duì)于丙泊酚麻醉時(shí)皮層腦電產(chǎn)生影響。這可能是因?yàn)镃MT在睡眠和睡眠恢復(fù)期間分別控制額葉和全腦皮層活動(dòng),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)睡眠慢波和從NREM睡眠中覺(jué)醒的雙重控制;然而本研究也發(fā)現(xiàn)在化學(xué)遺傳抑制CMT-mPFC通路后,腦電變化并不是很明顯;除此之外,在病毒位置驗(yàn)證圖上,mPFC向下傳遞的神經(jīng)元并不是很多,因而認(rèn)為CMT-mPFC通路神經(jīng)元在對(duì)于丙泊酚麻醉并不是必要的。

而本實(shí)驗(yàn)也存在一些局限性。首先,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只是記錄了單次給予丙泊酚后,觀察小鼠的RORR的變化,忽略了小鼠在LORR階段腦電行為學(xué)以及鈣信號(hào)的變化。并且在實(shí)驗(yàn)中對(duì)于小鼠行為學(xué)的檢測(cè)并沒(méi)有結(jié)合肌電圖進(jìn)一步的判斷,這會(huì)使行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可能存在一些主觀性。綜上所述,本研究結(jié)果顯示CMT-mPFC通路參與丙泊酚麻醉恢復(fù)的調(diào)節(jié),激活CMT-mPFC通路可促進(jìn)麻醉的恢復(fù),對(duì)抑制CMT-mPFC通路可延遲麻醉恢復(fù),但是它的進(jìn)一步的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。