缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1a通過上調(diào)Isthmin1促進(jìn)結(jié)腸癌增殖的作用機(jī)制

劉云云,賈佩琦,于佩弘,周 欣,邵淑琳,蘇東明

0 引 言

結(jié)腸癌(colon cancer, COAD)是世界范圍內(nèi)一種常見的胃腸道癌癥,發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢(shì)。據(jù)估計(jì),2020年全球新發(fā)病例190萬,死亡病例近93.5萬［1］。中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示,我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率、病死率在全部惡性腫瘤中分別位居第3及第5位,其中新發(fā)病例37.6萬,死亡病例19.1萬。多數(shù)患者在確診時(shí)已屬于中晚期。肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因［2］。

Isthmin1蛋白(Isthmin 1 protein, ISM1)是一種分泌蛋白,最早在非洲爪蟾的腦峽部被發(fā)現(xiàn),在人類也有表達(dá)。ISM1在肺、腦、乳腺 、結(jié)腸等器官中富集［3］。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道,ISM1可能參與細(xì)胞外基質(zhì)的組織、細(xì)胞相互作用和血管生成［4］。然而,它對(duì)于結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制和功能仍未被闡明。本研究首次觀察了ISM1在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況,探討其與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系、其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,以及調(diào)控ISM1表達(dá)的機(jī)制,以期篩選確定ISM1作為結(jié)腸癌病情評(píng)價(jià)的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460和人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、HT29、SW480、SW620均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù),1640 RPMI、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和小牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,蛋白酶體抑制劑和蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,HIF1A抗體和Tublin抗體均購(gòu)自proteintech公司,ISM1抗體購(gòu)自LifeSpan公司,Western blot二抗購(gòu)自Thermo Fisher公司,慢病毒包裝質(zhì)粒購(gòu)自吉?jiǎng)P公司。10例石蠟包埋結(jié)腸腺癌組織及癌旁正常組織取自南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院。

1.2方法

1.2.1 ISM1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)前期使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcga-data.nci.nih.gov),獲取521例結(jié)腸癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床數(shù)據(jù),對(duì)ISM1在結(jié)腸癌中的表達(dá)以及結(jié)腸癌患者整體生存率的影響進(jìn)行分析。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色所有組織標(biāo)本均采用4%濃度的甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,4 μm切片。使用免疫組化染色試劑盒(PV-6000,北京中杉金橋)對(duì)結(jié)腸組織樣本進(jìn)行IHC染色。切片脫蠟、水化、修復(fù)抗原,洗滌后加入10%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,孵育10 min,一抗孵育30 min,二抗孵育30 min,DAB染色。

1.2.3石蠟切片免疫熒光所有組織標(biāo)本均采用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,4 μm切片?？酒?、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉同石蠟切片免疫組化,在37 ℃溫度環(huán)境下一抗孵育2 h,PBS清洗,37 ℃溫度避光二抗孵育1 h,PBS清洗,按1∶1000比例用PBS稀釋DAPI,染核2 min,PBS清洗,抗熒光猝滅封片劑后置于載玻片上封固,用熒光顯微鏡下拍照。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HcoEpic、NCM460以及人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、HT29、SW480及SW620,使用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并置于含5% CO2的37 ℃細(xì)胞孵育箱中。每2 天更換1次培養(yǎng)液,并按1∶2比例每2天傳代1次。

取皿中生長(zhǎng)良好的人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞,胰酶消化后轉(zhuǎn)入12孔板,保證每孔細(xì)胞密度在 50% 左右。待細(xì)胞貼壁后,慢病毒與培養(yǎng)基1∶1混合,加入培養(yǎng)皿中。72 h后,觀察熒光轉(zhuǎn)染效率,換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基對(duì)HCT116細(xì)胞進(jìn)行篩選。篩選后的陽(yáng)性細(xì)胞即可擴(kuò)大培養(yǎng),用于后期實(shí)驗(yàn)。Western blot檢測(cè)感染效率。

1.2.5蛋白提取及Western blot檢測(cè)用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞15 min,提取總蛋白。BCA定量蛋白濃度后,加入6x蛋白上樣緩沖液于100 ℃水浴煮沸 10 min。通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離后,將蛋白濕轉(zhuǎn)1.5 h至PVDF膜上;然后在室溫下用5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h;分別加入一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后在室溫下二抗孵育1 h;TBST洗滌后加入超敏ECL曝光液,用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.6細(xì)胞增殖活性SRB實(shí)驗(yàn)分析將穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞HCT116-NC、HCT116-OE制成細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后,在96孔板中每孔加3000個(gè)細(xì)胞,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在0、24、48、72、96 h收板,并用1%TCA進(jìn)行細(xì)胞固定。固定4 h后,每孔加入50 μL SRB染液,室溫靜置染色15 min后進(jìn)行洗脫,每孔加入100 μL 10 mmol/L Tris堿液(pH=10.5),震蕩溶解10 min,用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值,記錄結(jié)果。

1.2.7平板克隆形成實(shí)驗(yàn)用胰酶消化已感染的HCT116-NC、HCT116-OE穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,經(jīng)過計(jì)數(shù)后,以500個(gè)/孔的密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中,加入2 mL培養(yǎng)基,每隔2 d換1次液,連續(xù)培養(yǎng)14 d后,用4%多聚甲醛固定15 min,棄甲醛,PBS沖洗3遍,加入1 mL結(jié)晶紫染色10 min,PBS沖洗干凈后,拍照并計(jì)數(shù)集落數(shù)量。

1.2.8結(jié)腸癌中ISM1表達(dá)量與結(jié)腸癌患者臨床特征的相關(guān)性采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取521例結(jié)腸癌患者的相關(guān)臨床數(shù)據(jù),采用生存分析探究結(jié)腸癌中ISM1表達(dá)量與結(jié)腸癌患者臨床特征的相關(guān)性。

1.2.9ISM1轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)獲取ISM1的啟動(dòng)子序列,使用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)JASPAR(https://jaspar.genereg.net/)對(duì)ISM1的啟動(dòng)子序列與缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)a結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.10細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)處理前1 d用完全培養(yǎng)基使HCT116細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中。24 h后待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí),去血清,放入乏氧袋中,再放入一片配套規(guī)格的安寧包和一個(gè)氧氣指示劑。封口放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,從乏氧袋中取出,提取蛋白檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用Graphpad prism7軟件及R語言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)兩組間比較采用t檢驗(yàn);結(jié)腸癌中ISM1表達(dá)量與結(jié)腸癌患者臨床特征的相關(guān)性采用在線生存分析工具Kaplan-Meier plotter(https://kmplot.com/analysis)分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ISM1在腸癌組織中的表達(dá)與定位數(shù)據(jù)庫(kù)分析通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的泛癌數(shù)據(jù)集,比較了TCGA中所有33種癌癥類型的腫瘤和鄰近正常組織之間ISM1 mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISM1在結(jié)腸癌、食道癌、子宮內(nèi)膜癌等癌組織中的表達(dá)顯著高于其相應(yīng)的正常組織。在此基礎(chǔ)上,對(duì)結(jié)腸癌組織中的非配對(duì)表達(dá)分析表明,ISM1在腫瘤組織(0.778±0.738,n=480)中的表達(dá)顯著高于正常組織(0.441±0.293,n=41),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。對(duì)結(jié)腸癌組織中的配對(duì)差異分析顯示,ISM1在腫瘤組織(0.826±0.702)中的表達(dá)顯著高于其對(duì)應(yīng)的正常組織(0.441±0.293),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在TCGA隊(duì)列中,One-way ANOVA的結(jié)果顯示,在結(jié)腸癌不同病理學(xué)分期中,ISM1表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。進(jìn)一步比較不同臨床病理特征患者中ISM1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)ISM1在晚期結(jié)腸癌中表達(dá)較高(P<0.05)。見圖1。以上結(jié)果表明,ISM1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá),且與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良相關(guān),提示ISM1表達(dá)上調(diào)可能是造成結(jié)腸癌生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的原因之一。

*P<0.05、**P<0.01

2.2ISM1在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)和分布為了驗(yàn)證上述生物信息學(xué)的分析結(jié)果,對(duì)10例石蠟包埋結(jié)腸腺癌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn), ISM1在癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于癌旁組織,且ISM1主要在細(xì)胞質(zhì)和間質(zhì)中高表達(dá),這與其作為分泌蛋白的作用一致,見圖2。利用結(jié)腸癌冰凍切片進(jìn)行熒光染色,標(biāo)記ISM1的綠色熒光信號(hào)主要在細(xì)胞質(zhì)和間質(zhì)中,與免疫組化結(jié)果一致,見圖3。Western blot方法分別檢測(cè)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系HcoEpic和NCM460,以及3個(gè)結(jié)腸腺癌細(xì)胞系中ISM1的表達(dá),結(jié)果表明, ISM1在3個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)均高于2個(gè)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系,且在惡性程度最高的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620中表達(dá)最高(P<0.05)。見圖4。

圖 2 免疫組化染色觀察ISM1在人結(jié)腸癌組織的表達(dá)與定位

圖 3 ISM1在結(jié)腸癌組織中的免疫熒光染色定位

1-2:人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系; 3-5:人結(jié)腸癌細(xì)胞系

2.3ISM1促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖分析選取結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29,利用慢病毒載體構(gòu)建ISM1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)感染慢病毒后,HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系中ISM1的表達(dá)相較于對(duì)照組明顯升高(P<0. 01),見圖5,證明該ISM1過表達(dá)慢病毒具有良好的感染效率。對(duì)過表達(dá)ISM1后的HT29細(xì)胞分別進(jìn)行SRB細(xì)胞增殖測(cè)定和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),從測(cè)量的第3天至第5天,與相應(yīng)對(duì)照組相比,ISM1過表達(dá)的HT29細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)(P<0.05),見圖6。通過平板克隆法進(jìn)一步分析ISM1過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。與對(duì)照組相比,ISM1過表達(dá)能顯著增強(qiáng)HT29細(xì)胞的克隆形成能力(P<0.05),見圖7。

2.4結(jié)腸癌中ISM1表達(dá)量與結(jié)腸癌患者臨床特征的相關(guān)性生存分析顯示,ISM1的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的整體生存期和疾病特異性生存期存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),見圖8,提示ISM1表達(dá)的上調(diào)可能是造成結(jié)腸癌患者總體生存期較短的原因之一。

1:對(duì)照組;2:過表達(dá)組

*P<0.05

a:對(duì)照組; b:過表達(dá)組

a:總生存率;b:疾病特異性生存率

2.5缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1a對(duì)ISM1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用免疫組織化學(xué)分析結(jié)果見圖9。結(jié)果顯示,缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1a在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織。使用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)JASPAR對(duì)ISM1轉(zhuǎn)錄子的基因序列進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)ISM1轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)上游2000 bp中含有3個(gè)HIF-1a結(jié)合位點(diǎn),提示HIF-1a可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ISM1的表達(dá),見表1。為了驗(yàn)證這一推測(cè),將結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116在缺氧袋中培養(yǎng),見圖10。顯示厭氧培養(yǎng)顯著上調(diào)ISM1的表達(dá),提示ISM1在腫瘤內(nèi)部缺氧的情況下可能受到HIF-1a的調(diào)控,導(dǎo)致ISM1表達(dá)增加,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

圖 9 免疫組化染色分析HIF-1a在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)和定位

表 1 HIF-1a可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ISM1的表達(dá)

1-4:分別為缺氧0、12、24和48 h

3 討 論

COAD是全球第三大因癌死亡原因。近年來,雖然外科手術(shù)和輔助性治療手段取得了較大進(jìn)展,但結(jié)腸癌患者的總生存率卻無明顯改善。因此,深入理解引起結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞與分子機(jī)制,對(duì)于其防治工作尤為重要［5］。

ISM1是一種分泌蛋白,也是胚胎和胎兒出生后發(fā)育的的重要因子［6］。ISM1 在哺乳動(dòng)物的皮膚、內(nèi)臟等組織器官中均有表達(dá)［3］。在本課題通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn),ISM1在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等惡性腫瘤組織中也有表達(dá)。而且,與相應(yīng)的癌旁正常組織相比,ISM1在不同癌腫中的表達(dá)也存在上調(diào)或下調(diào)的趨勢(shì),提示ISM1在不同腫瘤中的生物學(xué)作用也不相同。有文獻(xiàn)報(bào)道 ISM1的異常表達(dá)可以影響多種癌癥的生物學(xué)行為。例如,lncRNAH19通過上調(diào)ISM1表達(dá)促進(jìn)胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［7］。hsa_circ_0091570/miR1307則通過ISM1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［8］。Zheng等［9］曾報(bào)道在結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-1307-3p通過抑制ISM1的表達(dá)參與細(xì)胞增殖和凋亡的過程。然而,ISM1在COAD中的臨床意義及其他相關(guān)作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步闡明。

為研究ISM1對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響,本研究首先使用生物信息學(xué)和免疫組織化學(xué)的方法分析了腫瘤組織與細(xì)胞中ISM1的表達(dá)情況。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,ISM1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯升高。在結(jié)腸癌細(xì)胞系中,隨癌細(xì)胞的惡性程度增強(qiáng),ISM1的表達(dá)量也相應(yīng)上調(diào);其表達(dá)量與結(jié)腸癌患者的整體生存期和疾病特異性生存期存在著明顯負(fù)相關(guān)性。這些結(jié)果表明ISM1可能作為一個(gè)促癌因子參與了結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。這一推論在我們后續(xù)生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。我們利用結(jié)腸癌細(xì)胞系過表達(dá)ISM1之后,使用該細(xì)胞系進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)來探索ISM1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響［10］,發(fā)現(xiàn)ISM1表達(dá)上調(diào)可以明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力。

由于生長(zhǎng)迅速,癌癥組織的腫瘤細(xì)胞往往處于缺氧狀態(tài)［11］。缺氧會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性表型,對(duì)腫瘤的增殖遷移至關(guān)重要。HIF-1是1992年由Semenza和Wang首先發(fā)現(xiàn)。HIF-1普遍存在于人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),常氧下(21%O2)也有表達(dá),但合成的HIF-1蛋白很快即被細(xì)胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解,只有在缺氧條件下HIF-1才可穩(wěn)定表達(dá)［12］。HIF-1是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白,具有相當(dāng)廣泛的靶基因譜,其中包括與缺氧適應(yīng)、炎癥發(fā)展及腫瘤生長(zhǎng)等相關(guān)的100多種靶基因。當(dāng)其與靶基因結(jié)合后,通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使機(jī)體產(chǎn)生一系列病理反應(yīng),如低氧性肺動(dòng)脈高壓、腫瘤加速生長(zhǎng)等［13］。在前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn),缺氧培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞系中ISM1的表達(dá)顯著上調(diào)。在本研究中,我們還首次在結(jié)腸癌組織中通過生物信息學(xué)方法揭示了缺氧刺激ism1基因表達(dá)的潛在機(jī)制。發(fā)現(xiàn)ism1基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)上游存在多個(gè)HIF1α的結(jié)合位點(diǎn)。過表達(dá)HIF1α通過直接與ism1基因的保守調(diào)控元件結(jié)合,轉(zhuǎn)錄激活ism1基因的表達(dá)。

綜上所述,本研究顯示ISM1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯增高,與結(jié)腸癌患者的生存率存在著明顯負(fù)相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn),ISM1在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。癌細(xì)胞中的HIF1α通過上調(diào)ISM1的轉(zhuǎn)錄水平,促進(jìn)其表達(dá)。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步闡明ISM1對(duì)結(jié)腸癌的細(xì)胞生物學(xué)行為影響及其作用機(jī)制,為探索其在結(jié)腸癌的診斷和防治的作用奠定了基礎(chǔ)。