CSDC2蛋白免疫優(yōu)勢(shì)肽段分析及其多克隆抗體的制備

朱荷青,瑪哈巴·肉孜,李瑩瑩,張潔,許赫,李甜甜,韓吉龍,彭夏雨,楊敏*

(1 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子 832000;2 新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站,烏魯木齊 830000)

絨山羊?qū)儆诘湫偷碾p毛動(dòng)物,分為覆蓋體表的長(zhǎng)毛和長(zhǎng)毛下致密柔軟的羊絨,一簇羊絨由1至3個(gè)初級(jí)毛囊(Primary Hair Follicle,PHF)產(chǎn)生的長(zhǎng)毛和6至15個(gè)次級(jí)毛囊(Secondary Hair Follicle,SHF)生成的絨毛組成[1-2],而次級(jí)毛囊會(huì)經(jīng)歷從生長(zhǎng)期(anagen)至退行期(catagen)再到休止期(telogen)的周期性再生過(guò)程[3]。羊絨產(chǎn)業(yè)在我國(guó)畜牧業(yè)中占有重要地位,如何有效增加絨的產(chǎn)量一直是我國(guó)絨山羊種質(zhì)創(chuàng)新領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4],近年來(lái)從分子水平解析次級(jí)毛囊周期性生長(zhǎng)的機(jī)制變得十分重要。毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及數(shù)個(gè)信號(hào)通路、基因和ncRNA的相互作用[5-6],如Wnt信號(hào)通路(Wnt signaling pathway)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGFs(Fibroblast growing factors, FGFs)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF(Transforming growth factor, TGF)、表皮生長(zhǎng)因子EGF(Epidermal growth factor, EGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP(Bone morphogenetic protein, BMP)等[7-10],對(duì)調(diào)控因子的篩選和基因互作的研究一直是毛囊發(fā)育生物學(xué)研究的重點(diǎn)。

本課題組前期通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)含有C2的冷休克結(jié)構(gòu)域(cold shock domain containing C2, CSDC2)在毛囊的生長(zhǎng)期高表達(dá),在休止期低表達(dá),經(jīng)小鼠皮膚組織驗(yàn)證,使用siRNA干擾CSDC2能夠令毛囊發(fā)育關(guān)鍵基因Foxn1和Notch1的表達(dá)量降低[11],因此推測(cè)CSDC2參與絨山羊次級(jí)毛囊從生長(zhǎng)旺盛期到休止期的調(diào)控過(guò)程,但該假設(shè)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。CSDC2是一種廣泛存在于原核和真核生物中的高度保守的RNA結(jié)合蛋白(RNA Binding Protein,RBP),RBPs與癌細(xì)胞的增殖和分化有關(guān),研究表明CSDC2的啟動(dòng)子內(nèi)存在一個(gè)編碼miR-373的位點(diǎn),miR-373 能與CSDC2的啟動(dòng)子序列互補(bǔ)結(jié)合[12-15],所以本研究擬采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation, ChIP)尋找CSDC2的下游調(diào)控基因,探索該基因參與毛囊周期性調(diào)控的機(jī)制。而ChIP最重要的一步即特異性抗體的選擇,因此制備有效的特異性抗體尤為重要?；诖吮狙芯渴褂蒙欧治鍪侄魏Y選出CSDC2的免疫優(yōu)勢(shì)肽段并制備多克隆抗體,同時(shí)利用免疫印跡檢測(cè)抗體的特異性,為進(jìn)一步利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)探索該轉(zhuǎn)錄因子在毛囊周期性生長(zhǎng)中的分子機(jī)制提供條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試劑

實(shí)驗(yàn)級(jí)日本大耳白兔,雌性,6～8周齡,體重1 kg。新疆絨山羊,雄性,3周歲,飼養(yǎng)于石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)站。完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、TMB 顯色液購(gòu)自Sigma;脫脂奶粉、HRP-羊抗兔 IgG、PVDF膜、1×TBST、高效RIPA裂解液、PAGE彩膠快速配成試劑盒、ECL顯色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 CSDC2蛋白的生物信息學(xué)分析

從UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)獲取山羊的CSDC2全長(zhǎng)氨基酸序列(A0A452FJD6),采用在線二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和Predictprotein(https://predictprotein.org/)共同預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu);使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)CSDC2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu);使用Expasy中的ProtParam 蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析CSDC2 蛋白的基本理化性質(zhì)和親水系數(shù);使用在線工具ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)繪制CSDC2蛋白的親疏水性圖譜;利用DNAstar的Protean程序分析CSDC2蛋白的抗原指數(shù)、表面可及性、柔韌性;使用TMHHM 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析預(yù)測(cè)CSDC2的跨膜結(jié)構(gòu);使用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測(cè)CSDC2蛋白的信號(hào)肽;使用NetPhos 3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)在線預(yù)測(cè)CSDC2蛋白的磷酸化位點(diǎn)。

1.3 CSDC2蛋白的抗原表位篩選

應(yīng)用在線分析軟件SVMTriP(http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/prediction.php)對(duì)CSDC2的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè),同時(shí)綜合生信分析結(jié)果篩選出該蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)肽段。

1.4 動(dòng)物免疫、抗血清 ELISA 檢測(cè)及純化

將篩選的N-端氨基酸序列肽段(HSPKSPVWPTFPFHREGSR, aa 15-33)交送武漢愛基百客生物科技有限公司進(jìn)行多肽合成和鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián),于第1、12、26、40、54 d免疫1只SPF級(jí)日本大耳白兔,白兔編號(hào)E1,于實(shí)驗(yàn)前采集白兔血清作為陰性對(duì)照。首次免疫佐劑采用完全弗氏佐劑,第 2～5 次免疫采用不完全弗氏佐劑,在免疫前將佐劑與抗原等量混勻并充分乳化,首次免疫劑量為0.7 mg,第 2～5 次免疫劑量為0.35 mg,于初次免疫后第66 d頸動(dòng)脈采血,4 ℃,1 500 g 離心 20 min,收集上層血清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將無(wú)偶聯(lián) KLH多肽抗原與包被液按1∶8 000稀釋后,每孔100 μL加入96孔板中,4 ℃放置過(guò)夜。PBST-5%脫脂奶粉室溫封閉 0.5 h后洗滌3次;每孔加入第 66 d白兔免疫血清(按 1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000 、1∶200 000稀釋),37 ℃孵育1 h;PBST 洗滌 3 次,加入 1∶8 000稀釋HRP-羊抗兔 IgG,37 ℃孵育1 h;每孔加入100 μL TMB顯色液,室溫暗處放置15 min,加入 50 μL終止液,拍照記錄?？寡逵肏SPKSPVWPTFPFHREGSR-C 作抗原親和純化得到濃縮后的抗體,標(biāo)記為E1。

1.5 抗體特異性的檢測(cè)

采集處于絨山羊生長(zhǎng)期的皮膚組織(7月),在羊體右側(cè)肩胛骨后沿背中線與腹中線的上1/3處剪去絨和毛,裸露的皮膚用75%酒精消毒,使用無(wú)菌醫(yī)用手術(shù)剪剪取1 cm2皮膚組織,迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

將皮膚組織樣本使用RIPA裂解液(含 1 μL PMSF)于冰上提取總蛋白,每 10 min 搖勻 1 次,共 3 次;放入 4 ℃離心機(jī) 12 000 g離心10 min,取上清。SDS-PAGE電泳濃縮膠濃度5%,電壓80 V;分離膠濃度12%,恒定電壓150 V。使用0.45 μm 孔徑的 PVDF 膜恒流 200 mA濕轉(zhuǎn)30 min,含 5%(W/V)脫脂牛奶 TBST室溫封閉4 h。以制備的兔抗CSDC2蛋白多克隆抗體(稀釋比1∶1 000)為一抗4 ℃過(guò)夜孵育,HRP-羊抗兔 IgG (稀釋比1∶8 000)作為二抗37 ℃孵育1 h,ECL顯色后拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 CSDC2蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

CSDC2蛋白由153個(gè)氨基酸構(gòu)成,相對(duì)分子質(zhì)量為16 757.86,等電點(diǎn)(PI)為7.01,氨基酸序列如圖1。CSDC2蛋白的N末端是Met,在體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h,在酵母中大于20 h,在大腸桿菌中大于10 h。

圖1 CSDC2 蛋白的氨基酸序列

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析軟件SOPMA和Predictprotein預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2所示,可以看出無(wú)規(guī)則卷曲在該蛋白質(zhì)中占比最高,α-螺旋和β-折疊相對(duì)較少。使用SOPMA(圖2A)預(yù)測(cè)α-螺旋13(8.5%)、β-折疊14(9.15%)、無(wú)規(guī)則卷曲92(60.13%)、延伸鏈34(22.22%)。使用Predictprotein(圖2B)預(yù)測(cè)α-螺旋6(3.9%)、β-折疊39(25.5%)、無(wú)規(guī)則卷曲108(70.5%)。取兩種方法中預(yù)測(cè)一致的重疊區(qū),無(wú)規(guī)則卷曲主要分布于N-端氨基酸序列的第1～58、146～153位。三級(jí)結(jié)構(gòu)SWISS-MODEL預(yù)測(cè)結(jié)果見圖2C。

A:SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果,h為α-螺旋,t為β-折疊,c為無(wú)規(guī)則卷曲,e為延伸鏈;B:Predictprotein預(yù)測(cè)結(jié)果;C:CSDC2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。圖2 CSDC2的蛋白結(jié)構(gòu)

2.2 CSDC2蛋白的理化性質(zhì)

利用ProtParam分析得出CSDC2蛋白的脂溶指數(shù)為61.63,平均親水系數(shù)為 -0.493,親/疏水性圖譜如圖3A所示,第33位(精氨酸,Arg)為CSDC2蛋白中最親水的氨基酸位點(diǎn),得分為 -2.044,第131位(谷氨酸,Glu)為該蛋白中最疏水的位點(diǎn),得分為1.478,說(shuō)明CSDC2蛋白屬于親水性蛋白。CSDC2蛋白的抗原指數(shù)、表面可及性、柔韌性分析結(jié)果見圖3B,該蛋白的柔性區(qū)域主要集中于氨基酸序列的12-53 aa,在5-9 aa、12-22 aa、29-34 aa、36-57 aa、65-68 aa、76-82 aa、86-93 aa、100-104 aa、109-113 aa、121-126 aa、141-150 aa散在分布?？乖笖?shù)評(píng)分較高的區(qū)域?yàn)榈?-9、14-21、27-57、61-67、72-82、86-95、99-115、120-130、140-148位氨基酸,柔性較高的區(qū)域與抗原指數(shù)得分高的區(qū)域基本一致。表面可及性得分較高的區(qū)域?yàn)?-7 aa、14-18 aa、27-31 aa、42-57 aa、76-81 aa、121-126 aa、140-145 aa。使用TMHHM 2.0預(yù)測(cè)CSDC2跨膜結(jié)構(gòu)如圖3C所示,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域并完全位于膜內(nèi)。

A:ProtParam的疏水性分析結(jié)果;B:Protean的理化性質(zhì)分析結(jié)果,藍(lán)色條為柔韌性較高的區(qū)域,粉色峰為抗原指數(shù),黃色峰為表面可及性;C:CSDC2的跨膜結(jié)構(gòu)分析。圖3 CSDC2的親疏水性、抗原指數(shù)、表面可及性、柔韌性及跨膜結(jié)構(gòu)

2.3 信號(hào)肽及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

信號(hào)肽及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)見圖4。

A:SignalP 5.0的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果;B:NetPhos 3.1的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果。圖4 CSDC2的信號(hào)肽及磷酸化位點(diǎn)

SignalP 5.0在線軟件預(yù)測(cè)顯示CSDC2無(wú)信號(hào)肽,應(yīng)用NetPhos 3.1在線軟件預(yù)測(cè)CSDC2蛋白的磷酸化位點(diǎn),設(shè)置閾值高于0.5的為潛在磷酸化位點(diǎn),該蛋白在第3、16、19、32、39、41、47、58、64、79位絲氨酸處,第2、6、24、51、54、56、60、86、114、141位蘇氨酸處,第105、115位酪氨酸處發(fā)生磷酸化,結(jié)果見圖4。

2.4 CSDC2蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)

使用SVMTriP在線分析軟件預(yù)測(cè)CSDC2的抗原表位,表位長(zhǎng)度設(shè)置為20 aa,結(jié)果見表1。綜合二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果、基本理化性質(zhì)及抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果,選擇蛋白-N端15-33 aa(HSPKSPVWPTFPFHREGSR)合成多肽HSPKSPVWPTFPFHREGSR-C。

表1 SVMTriP預(yù)測(cè)CSDC2抗原表位得分表

2.5 抗血清ELISA檢測(cè)、純化

濃縮后抗體濃度為2.70 mg·mL-1,間接ELISA檢測(cè)結(jié)果見圖5,每行包被100 μg·μL-1的五免血清,抗體濃度正常,效價(jià)良好。

圖5 抗血清ELISA檢測(cè)

2.6 抗體特異性檢測(cè)結(jié)果

為確定抗體是否可以用于ChIP實(shí)驗(yàn),使用從絨山羊皮膚組織中提取的總蛋白,以純化后的抗體作為一抗檢測(cè)抗體的特異性,Western blot結(jié)果見圖6。CSDC2蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為17 kD,在15 ～ 20 kD處有條帶。

M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: CSDC2蛋白的ECL顯色。圖6 絨山羊皮膚組織蛋白的western blot鑒定

3 討論

特異性抗體在人類和動(dòng)物的功能基因研究中被廣泛應(yīng)用并具有重要作用,但獲得特異性強(qiáng)、高效價(jià)的抗體一直較為困難,而多克隆抗體以方法簡(jiǎn)單、成本低成為抗體制備的首選[16-17]。CSDC2由一個(gè)含有RNP1和RNP2基序的CSD以及兩個(gè)能夠結(jié)合雙鏈RNA的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于CSDC2的功能研究仍較少,有研究表明CSDC2在錐體神經(jīng)元的終末分化中起到促進(jìn)作用,同時(shí)CSDC2是造成小鼠子宮UIII細(xì)胞蛻膜的主要調(diào)節(jié)因子,在卵巢激素的作用下參與胚胎與子宮內(nèi)膜的信號(hào)交流[18-19],說(shuō)明CSDC2在細(xì)胞增殖分化過(guò)程中具有重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn),CSDC2作為重要的轉(zhuǎn)錄因子在絨山羊皮膚組織中隨絨毛生長(zhǎng)呈周期性表達(dá),且發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)期高表達(dá),休止期地表達(dá),說(shuō)明CSDC2在絨山羊絨毛周期性調(diào)控中其重要作用,本研究推測(cè)CSDC2通過(guò)調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)靶基因的表達(dá)在絨山羊毛囊周期性生長(zhǎng)中參與調(diào)控。

為制備絨山羊CSDC2特異性抗體,本研究通過(guò)在線分析軟件分別對(duì)CSDC2蛋白的結(jié)構(gòu)、親/疏水性、抗原指數(shù)、表面可及性、柔韌性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、抗原決定簇和抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示CSDC2 蛋白編碼157個(gè)氨基酸且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽,同時(shí)CSDC2蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為51.65,大于閾值40,說(shuō)明CSDC2屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì),而該蛋白的平均親水系數(shù)為 -0.493,表明CSDC2蛋白是一個(gè)位于細(xì)胞核內(nèi),在細(xì)胞質(zhì)中作用的不穩(wěn)定親水蛋白。CSDC2具有22處磷酸化位點(diǎn),根據(jù)抗原表位的得分并結(jié)合抗理化性質(zhì)的分析,CSDC2蛋白在第15-33位氨基酸顯示出良好的柔韌性、抗原性、表面可及性和親水性,在二級(jí)結(jié)構(gòu)上該段氨基酸位于無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域內(nèi),推測(cè)是可能的 B 細(xì)胞線性肽段位置,因此本研究將該段氨基酸選為免疫試驗(yàn)兔的優(yōu)勢(shì)肽段。本研究得到的抗血清的效價(jià)較好,同時(shí)通過(guò)Western blot檢測(cè)抗體的特異性,選取CSDC2高表達(dá)的絨山羊皮膚組織提取總蛋白后進(jìn)行抗體孵育,結(jié)果顯示條帶大約在17 kD處,即說(shuō)明本研究制備的多克隆抗體具有一定準(zhǔn)確性和生物學(xué)效價(jià),可以與CSDC2蛋白特異性結(jié)合。

CSDC2作為轉(zhuǎn)錄因子中的重要一員,關(guān)于其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究幾乎為空白,其特異性調(diào)控絨山羊絨毛周期性生長(zhǎng)過(guò)程中的靶基因仍不明確。目前研究轉(zhuǎn)錄因子分子機(jī)制的研究方法包括ChIP-Seq,EMSA等,作為尋找轉(zhuǎn)錄因子的靶基因的有效手段,ChIP通過(guò)特異性抗體捕獲蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物,是目前研究蛋白質(zhì)和DNA互作的主流技術(shù)[20-21]。隨著家畜功能基因和后基因組學(xué)的研究不斷深入,商業(yè)化抗體的種類逐漸增多,但多數(shù)抗體僅可用于人類或模式動(dòng)物如小鼠的研究,國(guó)內(nèi)外在家畜的目的蛋白商業(yè)化特異性抗體制備方面依然不夠豐富[22],因此如何設(shè)計(jì)制作符合要求的特異性抗體從而驗(yàn)證目的基因和蛋白在家畜重要表型性狀中的作用機(jī)制是十分重要的。本研究選擇合適的多肽片段免疫試驗(yàn)兔并最終得到為后續(xù)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)所用的多克隆抗體,為CSDC2基因功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

由此可知,本研究得出絨山羊CSDC2的免疫優(yōu)勢(shì)肽段為15～33 aa(HSPKSPVWPTFPFHREGSR)并免疫試驗(yàn)兔制備了多克隆抗體,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明該抗體具有較好生物學(xué)效價(jià),為后續(xù)深入研究CSDC2在絨山羊絨毛周期性生長(zhǎng)調(diào)控的作用奠定了理論基礎(chǔ)。