新疆伊犁地區(qū)蘋果黑星病病原菌鑒定·生物學(xué)特性及毒力測定研究

王華 唐曉雪 任毓忠

摘要 為明確伊犁地區(qū)蘋果黑星病病原菌的種類和生物學(xué)特性，結(jié)合病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和分子生物學(xué)進行鑒定，確定引起新疆伊犁地區(qū)蘋果黑星病的病原為Venturia inaequali。通過不同溫度、pH及培養(yǎng)基等對蘋果黑星病菌生物學(xué)特性研究表明，病菌生長的最佳培養(yǎng)溫度在20 ℃左右，最適生長pH為7和8，在OA培養(yǎng)基上的生長速度最快，在OMA培養(yǎng)基上生長最緩慢。室內(nèi)毒力測定表明，供試4種原藥中的3種對蘋果黑星病菌菌絲的EC50從小到大依次是吡唑醚菌酯<啶酰菌胺<嘧霉胺。

關(guān)鍵詞 伊犁地區(qū)；蘋果黑星?。徊≡?；鑒定；生物學(xué)；毒力

中圖分類號 S436.611.1? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）10-0114-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.10.025

Abstract In order to clarify the species and biological characteristics of the pathogenic bacteria of apple scab in Yili area， combined with the morphological characteristics， culture characters and molecular biology identification of the pathogenic bacteria， it was determined that the pathogen causing apple scab in Yili area of Xinjiang was Venturia inaequali. The research on the biological characteristics of apple scab at different temperatures， pH and medium showed that the optimal culture temperature for the growth of the bacteria was about 20 ℃， the optimal growth pH was 7 and 8， and the growth rate on the OA medium was the highest. The growth rate on OMA medium was the slowest. Laboratory toxicity test showed that the EC50 of 3 of the 4 active drugs against the mycelia of P. aureus was pyrazole ester

Key words Yili Region;Apple scab;Pathogenic bacteria;Indentification;Biology;Virulence

蘋果黑星病是由真菌Venturia inaequali引起的病害，是我國重要的外來檢疫性病害［1］。該病害在新疆伊犁地區(qū)普遍發(fā)生，遍及特克斯縣、伊寧縣、新源縣、伊寧市、尼勒克縣等蘋果種植區(qū)，在嘎啦、紅富士、紅星、秦冠、紅津輕等品種上危害嚴重，病葉率達80%以上，病果率可達30%左右，嚴重制約了伊犁地區(qū)特色林果業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［2］。國內(nèi)學(xué)者對蘋果黑星病的研究集中于田間發(fā)生危害調(diào)查、癥狀識別及田間化學(xué)防治方面，新疆對蘋果黑星病的研究主要集中在大田藥劑防治方面。蘋果黑星病病原菌的研究在國內(nèi)主要集中于西北農(nóng)林科技大學(xué)，而新疆的蘋果黑星病病原菌尚未見報道［3-19］。為保護伊犁地區(qū)蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，搞清伊犁地區(qū)蘋果黑星病病原菌的種類及生物學(xué)特性，筆者從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面對蘋果黑星病菌進行了鑒定，并對蘋果黑星病菌的生物學(xué)特性及毒力測定進行研究，以期為病害的發(fā)生規(guī)律、綜合防治以及抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蘋果黑星病的病原鑒定

1.1.1 病樣的采集和癥狀描述。

在蘋果黑星病發(fā)病盛期，采集田間發(fā)病癥狀明顯的蘋果黑星病果實和葉片，用密封袋分裝后帶回實驗室內(nèi)，并對典型病樣進行拍照和癥狀描述。

1.1.2 病原菌的分離、純化和代表性菌株的選擇。

將田間采集的蘋果黑星病病樣用75%乙醇表面消毒后晾干，病菌分離分別采用組織塊分離法和劃線分離法。組織塊分離法：在超凈工作臺內(nèi)用滅菌解剖刀在病健交界處直接切取5 mm×5 mm的病樣，在0.1%升汞中浸泡20 s后無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干，然后放置在PSA培養(yǎng)基上；劃線分離法：在火焰滅菌后的載玻片上滴加無菌水，然后用滅菌的解剖刀將葉片或果實表面病斑上的病菌輕輕刮入滅菌水中，用滅菌的接種環(huán)蘸取孢子懸浮液在PSA平板上劃線。最后將分離后的平板置于恒溫20 ℃暗培養(yǎng)14 d。待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)采集地點、菌落特點等特征選取代表性菌株進行單孢純化并于PSA培養(yǎng)基上4 ℃保存待用。

1.1.3 病原菌的鑒定。

1.1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定。

形態(tài)學(xué)鑒定主要參考Nelson & Toussoun & Marasas的分類系統(tǒng)，依據(jù)病菌分生孢子的形態(tài)和著生方式，分生孢子梗的特征，厚垣孢子的有無，菌落的顏色特征及其生長速度進行鑒定。將供試菌株移接至PSA培養(yǎng)基上。在PSA培養(yǎng)基上恒溫20 ℃暗培養(yǎng)14 d后觀察其菌落形態(tài)，分別測量50個分生孢子和50個厚垣孢子大??；觀察分生孢子梗和分生孢子的著生狀態(tài)并拍照。

1.1.3.2 分子生物學(xué)鑒定。

將供試菌株在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，用無菌解剖刀將其菌絲刮至2 mL離心管中。使用Bio Flux 真菌DNA提取試劑盒提取供試菌株的基因組DNA。使用真菌ITS區(qū)的通用引物

（ITS1 5′-3′TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4 5′-3′TCCTCCGCTTATTGATATGC，擴增片段520 bp，退火溫度58 ℃［20］）對供試菌株DNA進行PCR擴增。反應(yīng)程序均為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃再次延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物有限公司測序。測序結(jié)果至BLAST比對和分析，下載相似性高且同時含有rDNA-ITS和TEF-1α基因的黑星孢屬（Venturia）參考菌株的序列。按照rDNA-ITS和TEF-1α的順序依次拼接，并以蘋果果實黑點病的病原粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum Link ex Fries）為外群，使用MEGA 5.0 軟件中鄰接法（Neighbor-joining Method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 蘋果黑星病菌生物學(xué)特性的測定

1.2.1 溫度對病菌生長的影響。

將供試菌株在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，在無菌條件下從菌落的邊緣用滅菌打孔器打成5 mm的菌餅，供如下生物學(xué)特性測定使用。分別將菌餅移接至PSA培養(yǎng)基上，置于5、10、15、20、25、30和35 ℃的恒溫箱中進行黑暗培養(yǎng)。14 d后測量菌落直徑并拍照。每種處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.2 pH對病菌生長的影響。

用 HCl和 NaOH將PSA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至 4、5、6、7、8、9、10、11，將菌餅移接至不同pH的PSA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。14 d后測量菌落直徑并拍照，每種處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.3 培養(yǎng)基對病菌生長的影響。

將菌餅分別移接至馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、索萊寶麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（MEA）、燕麥瓊脂（oatmeal agar，OA）、玉米粉瓊脂（corn meal agar，CMA）培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。14 d后測量菌落直徑并拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析。

用 Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用 SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行多重比較和方差分析。

1.3 幾種殺菌劑對蘋果黑星菌的毒力測定

1.3.1 供試菌株。

選用新疆伊犁地區(qū)蘋果黑星菌代表性菌株進行毒力測定試驗。

1.3.2 供試藥劑。

供試4種原藥藥劑名稱、生產(chǎn)廠家以及質(zhì)量濃度見表1。

1.3.3 試驗方法。

采用菌絲生長速率法測定各藥劑對病原菌生長的抑制情況。使用N，N-二甲基甲酰胺將原藥溶解配制成高濃度母液，在超凈工作臺內(nèi)使用0.22 μm細菌過濾器將母液過濾至10 mL離心管中待用。按照5種已設(shè)定好的濃度，分別將不同量的母液加入融化冷卻至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，使得藥劑與培養(yǎng)基混勻后制成相對質(zhì)量濃度梯度（表1）的含藥培養(yǎng)基。以不加入藥劑的PDA培養(yǎng)基為空白對照，每組處理3個重復(fù)。

將蘋果黑星菌培養(yǎng)14 d后，用5 mm滅菌打孔器打取菌餅若干，供毒力測定使用。將菌餅移接至含藥培養(yǎng)基以及對照培養(yǎng)基中央，每種藥劑設(shè)置5個梯度，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，14 d后測量菌落直徑并拍照。

計算出菌絲生長抑制率，即抑制率 =（對照菌落增長直徑 － 處理菌落增長直徑）/對照菌落增長直徑 × 100%。

使用SPSS 19.0軟件基于Probit回歸法對所得數(shù)據(jù)進行毒力回歸方程分析得到半數(shù)有效濃度（EC50）［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果黑星病癥狀

蘋果黑星病在新疆伊犁地區(qū)一般從5月中旬開始發(fā)病，7—8月病害達到高峰期，病菌主要感染葉片和果實，也能危害葉柄、花和幼嫩的枝條等部位，主干和主枝不被感染。葉片感病，病斑大多出現(xiàn)在葉面上，葉緣和葉邊很少出現(xiàn)，病斑初為淡灰綠色的圓形褪綠斑，后顏色逐漸加深，變成褐色或灰褐色、黑色，病斑在葉片正面微微隆起，邊緣明顯，葉片背面病斑邊界不明顯，顏色淡褐色或灰黑色，較正面顏色淺，表面生淺褐色絨狀霉層，病葉易卷曲；隨著病斑的擴展，后期病葉上多個病斑融合，病斑中央組織易破裂穿孔，嚴重時整個葉片卷曲干枯死亡。果實發(fā)病從幼果期至成熟期均可受害，果實上的病斑多為圓形，少橢圓形或卵圓形，初期淡黃綠色或灰褐色，后逐漸變?yōu)楹稚蚝谏?，病斑處果面凹陷明顯，表面生絨狀霉層；后期病斑從中心向四周開始硬化和龜裂，形成中央黑色周圍灰黑色的病斑，且多個病斑合并形成大的不規(guī)則形的壞死斑，病斑大多只在果面擴展，向果肉內(nèi)縱向擴展不明顯（圖1）。但病果較健康果實生長緩慢，單果重量明顯較小，病斑對果實品質(zhì)的影響嚴重。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定。

蘋果黑星菌的菌絲黑色，有隔，在PSA培養(yǎng)基上菌落墨綠色至黑色，氣生菌絲明顯，表面短絨毛狀（圖2a）。分生孢子梗叢生，直立或稍彎曲，圓柱狀，不分枝，深橄欖色、淡褐色或黑色，基部膨大，1～2個隔膜，分生孢子梗上有環(huán)痕，大小為（22.4～65.3）μm×（6～8）μm，分生孢子梗直徑明顯粗于菌絲體，環(huán)痕式延伸；分生孢子上著生1～2個分生孢子，分生孢子0～1隔膜，偶有2個以上隔膜，分隔處略隘縮，基部細胞明顯大于頂部細胞，倒梨形或倒棍棒狀，淡褐色至褐色或橄褐色，孢基平截，表面光滑或具小疣突，16.92～35.63（25.63） μm×5.10～12.73（7.64） μm；培養(yǎng)21 d后，菌絲上形成黑色或淡黑色的厚垣孢子，厚垣孢子頂生或間生在菌絲上，單生或多個串生，球形、卵圓形、長圓形，大小為6.80～29.32（15.20）μm×5.79～22.83（12.69）μm（圖2b、c、d）。依據(jù)病原的形態(tài)特征，與已報道的蘋果黑星病菌（Venturia inaequalis）較一致，將引起伊犁地區(qū)蘋果黑星病的病原初步確定為Venturia inaequalis［21-23］。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定。

采用真菌通用引物ITS1/ITS4對供試菌株DNA進行PCR擴增，在NCBI進行Blast對比，擴增產(chǎn)物片段大小為526 bp，與來自印度、中國和荷蘭的Venturia inaequalis（登錄號MZ820002.1、 MN958673.1和KF156040.1）相似性達99.42%～100%。

對供試菌株進行ITS/TEF-1α聯(lián)合序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。供試菌株均與Venturia inaequalis聚在同一個分支上，與引起蘋果黑星病和梨黑星病的其他病原物（Venturia?nashicola和Venturia pirina）都處于不同的分支上，且與引起蘋果果實黑點病的病原粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠。

2.3 蘋果黑星病菌生物學(xué)特性

2.3.1 溫度對病菌生長的影響。

蘋果黑星病菌在10～25 ℃均可生長，但溫度對蘋果黑星病菌生長的影響極其顯著，5 ℃以下和30 ℃以上不能生長。病菌在20～25 ℃生長速度較快，尤其是20 ℃生長速度最快，25 ℃生長速度次之，20 ℃以下隨溫度降低生長速度逐步變緩慢，高溫不利于病菌的生長。這與已報道的一致，在病菌分離中也發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)溫度高于25 ℃時，很難有分離的菌落產(chǎn)生，當培養(yǎng)溫度調(diào)整到20 ℃時，不管是組織塊分離法還是劃線分離，5～7 d后均有目標菌落出現(xiàn)，因此，在蘋果黑星病的分離培養(yǎng)中，培養(yǎng)溫度必須控制在25 ℃以內(nèi)，尤以（20±2）℃為最佳培養(yǎng)溫度。這也與新疆蘋果黑星病的發(fā)生現(xiàn)狀相吻合，新疆目前只在夏季溫度較低的北疆部分地區(qū)（伊犁、塔城和阿勒泰）有蘋果黑星病的發(fā)生和危害，夏季溫度相對較高的阿克蘇地區(qū)目前無該病害的發(fā)生和危害，這與病菌對溫度的適應(yīng)性關(guān)系密切（圖4、5）。

2.3.2 pH對病菌生長的影響。

由圖6可知，蘋果黑星病菌菌絲生長對pH不太敏感，在pH 4～11時均可生長。最適生長pH為7和8，14 d菌落的直徑分別為4.16和4.08 cm；pH為7時菌落生長最快，菌落在培養(yǎng)基pH 11時生長速度最慢，僅為1.49 cm，其他pH條件下，菌落的生長速度居中。

2.3.3 培養(yǎng)基對病菌生長的影響。

由圖7可知，蘋果黑星病菌在供試5種培養(yǎng)基上均可生長。OA培養(yǎng)基上的生長速度最快，14 d的菌落直徑達3.91 cm，在PDA和PSA培養(yǎng)基上的生長速度次之，菌落直徑分別為3.78和3.73 cm；在OMA和MEA培養(yǎng)基上的生長速度較慢，14 d的菌落直徑僅為2.01和2.45 cm，表明蘋果黑星病菌對培養(yǎng)基有較強的選擇性。

2.4 幾種殺菌劑對蘋果黑星菌的毒力測定

通過毒力測定試驗發(fā)現(xiàn)供試4種藥劑對蘋果黑星病菌菌絲均有一定的抑制性。由表2可知，多菌靈對病原菌菌絲的抑制效果最好，藥劑濃度為0.1 mg/L時，菌絲抑制率仍達100%，而吡唑嘧菌酯、98%啶酰菌胺、嘧霉胺則表現(xiàn)為隨著藥劑濃度的增加，菌絲抑制率升高，其中98%啶酰菌胺的濃度為6.4 mg/L時，菌絲抑制率達100%。

根據(jù)以上4種藥劑的試驗數(shù)據(jù)進行回歸統(tǒng)計分析，回歸直線與觀測值的擬合程度即R2均大于0.60，說明毒力回歸方程與觀測值擬合程度較好，可作為理論依據(jù)進行參考。供試4種藥劑中的3種對蘋果黑星病菌菌絲的EC50由小到大依次為吡唑醚菌酯<啶酰菌胺<嘧霉胺。其中吡唑醚菌酯的EC50為0.225 9 mg/L，其次為啶酰菌胺，EC50為0.468 2 mg/L。而防效最差的藥劑為嘧霉胺，EC50高達0.952 8 mg/L（表3）。

3 結(jié)論

根據(jù)病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定引起新疆伊犁地區(qū)蘋果黑星病的病原為Venturia inaequali。通過不同溫度、pH及培養(yǎng)基等對蘋果黑星病菌生物學(xué)特性研究表明，病菌對溫度的適應(yīng)性差異較大，（20±2）℃是病菌生長的最佳培養(yǎng)溫度，高溫不利于病菌的生長；蘋果黑星病菌對pH的適應(yīng)范圍較寬，最適生長pH為7和8；蘋果黑星病菌對培養(yǎng)基有較強的選擇性，OA培養(yǎng)基上的生長速度最快，在OMA培養(yǎng)基上生長最緩慢，且菌絲較稀疏。以上結(jié)果和胡小平等［22-23］的蘋果黑星病菌生長適溫為15～20 ℃，最適pH 5.0～6.5及在燕麥培養(yǎng)基上菌落生長較差有一定差異，可能是地域不同所導(dǎo)致。

4種殺菌劑原藥對蘋果黑星病原菌的毒力測定結(jié)果表明，4種藥劑在不同濃度下對該病原菌均有不同程度的抑制作用，毒力強弱也不同。整體趨勢表現(xiàn)為隨著藥劑濃度的增加，菌絲抑制率升高。4種原藥對蘋果黑星病菌室內(nèi)毒力測定表明，供試4種藥劑中的3種對蘋果黑星病菌菌絲的EC50由小到大依次是吡唑醚菌酯<啶酰菌胺<嘧霉胺。

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