單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

陳平亞 何翠華 張亮亮 吳少榮 王綏家 趙光遠(yuǎn)

摘要 ［目的］建立一種單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）檢測(cè)方法，并對(duì)其檢測(cè)敏感性、特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。［方法］針對(duì)單增李斯特菌的actA基因序列，設(shè)計(jì)6條LAMP特異性引物，通過(guò)對(duì)LAMP反應(yīng)體系中的反應(yīng)溫度、內(nèi)外引物濃度比、鎂離子濃度等各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)反應(yīng)體系。以單增李斯特菌株CMCC54006株為陽(yáng)性對(duì)照，其他菌株為陰性對(duì)照，驗(yàn)證LAMP檢測(cè)方法的特異性。將純培養(yǎng)的單增李斯特菌菌液提取DNA后10倍梯度稀釋為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)，以測(cè)定該檢測(cè)方法靈敏度。［結(jié)果］建立了特異性檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP檢測(cè)方法，優(yōu)化后確定了檢測(cè)體系中FIP/BIP與F3/B3 的終濃度比為1.6∶0.2，鎂離子濃度為6 mmol/L，dNTPs濃度為1.6 mmol/L，反應(yīng)溫度為65 ℃。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，僅單增李斯特菌反應(yīng)管中的反應(yīng)液呈綠色，表明建立的檢測(cè)方法具有較高特異性。以單增李斯特菌DNA為模板進(jìn)行的LAMP檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMP檢測(cè)方法靈敏度為64 copies/mL。［結(jié)論］建立單增李斯特菌的LAMP檢測(cè)方法，高效特異，靈敏度高，可直接觀(guān)察檢測(cè)結(jié)果，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 單增李斯特菌；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；actA基因

中圖分類(lèi)號(hào) TS207.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2023）10-0074-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.10.016

Abstract ［Objective］ The objective of this study is to establish a rapid and specific method to detect? Listeria monocytogenes using loopmediated? isothermal amplification.［Method］ Six specific LAMP primers were designed to target the actA gene of L.monocytogenes.Singlefactor experiments were conducted to optimize the parameters of the reaction system .The specificity of LAMP was tested by using? non L.monocytogenes.The sensitivities of? LAMP were compared by using tenfold serially diluted DNA as templates.Furthermore，the samples? which may be infected by L.monocytogenes were detected by LAMP method.［Result］The LAMP assay for rapidly and specifically detecting L.monocytogenes was established.The reacting temperature was determined as 65 ℃ ，the concentration of Mg2+ was 6 mmol/L? and? the concentration of dNTPs was 1.6 mmol/L.The concentration ratio of inner and outer primers was 1.6∶0.2.The result of specificity test showed that only the reaction liquids with the DNA of? L.monocytogenes? change green.Sensitivity experiments indicated that the detection limit could reach 64 copies/mL.［Conclusion］ The LAMP assay had advantages of sensitivity and specificity，the reaction results could be directly observed by naked eyes and? suitable to be widely used in grassroots units.

Key words Listeria monocytogenes;LAMP;actA gene

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，單增李斯特菌）是一種常見(jiàn)的兼性厭氧的革蘭陽(yáng)性食源性致病菌，能在土壤、地表水及冰箱中生存，能通過(guò)糞口傳播［1］。單增李斯特菌能夠穿越動(dòng)物血腦屏障、血胎屏障［2］，引起敗血癥、腦膜炎等，為避免食品安全事件，需要建立快速、靈敏、特異性的單增李斯特菌檢測(cè)方法。

目前，單增李斯特菌的國(guó)標(biāo)鑒定方法是平板分離培養(yǎng)，樣品中單增李斯特菌的檢測(cè)經(jīng)過(guò)2次增菌、選擇性培養(yǎng)基分離以及生化鑒定，全過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)。目前分子生物學(xué)檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用，如熒光定量PCR技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)、CRISPR 技術(shù)等［3］。LAMP技術(shù)是在Bst酶的作用下，在恒溫條件下反應(yīng)45 min即可完成核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果可通過(guò)染料顏色、濁度等判斷反應(yīng)結(jié)果，耗時(shí)少且對(duì)試驗(yàn)儀器的要求低［4］。該研究以單增李斯特菌的保守基因actA作為靶基因來(lái)建立LAMP的檢測(cè)方法，用于單增李斯特菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

LAMP可以在恒溫條件下特異、快速地?cái)U(kuò)增核酸，不需要昂貴的溫控設(shè)備、檢測(cè)成本低且結(jié)果可視，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等病原體的快速檢測(cè)［5］。針對(duì)特異性目標(biāo)基因中6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6條引物，利用Bst DNA聚合酶擴(kuò)增。在DNA合成過(guò)程中，從脫氧核糖核酸三磷酸（dNTPs）底物中析出的焦磷酸離子與體系中的鎂離子反應(yīng)，產(chǎn)生白色焦磷酸鎂沉淀，其難溶于水，且可通過(guò)肉眼直接觀(guān)察［6］，因此可以把渾濁度作為反應(yīng)的指標(biāo)，也可向PCR管中添加染料輔助觀(guān)察擴(kuò)增結(jié)果，該試驗(yàn)通過(guò)加入0.2 μL SYBR Green I （10×）染料，加入反應(yīng)管蓋中37 ℃烘干4 h，待 LAMP 反應(yīng)結(jié)束后，顯色染料與反應(yīng)液混勻，根據(jù)顯色結(jié)果對(duì)樣本的陰陽(yáng)性進(jìn)行判斷。

對(duì)單增李斯特菌CMCC54006菌株actA基因序列（DQ309883.2）進(jìn)行測(cè)序，將actA基因與其他菌株的同源序列進(jìn)行比對(duì)分析后，利用Primer ExplorerV5 軟件在線(xiàn)設(shè)計(jì)LAMP引物。筆者以actA毒力基因?yàn)閱卧隼钏固鼐谢蚪晒釲AMP檢測(cè)方法，建立快速精準(zhǔn)檢測(cè)單增李斯特菌的技術(shù)，有助于及時(shí)檢測(cè)單增李斯特菌，以確保食品安全。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試標(biāo)準(zhǔn)菌株包括單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、大腸埃希氏菌（Escherichia colt）、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。

試驗(yàn)主要試劑：培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋公司; MgSO4、SYBR Green I 染料購(gòu)自Sigma公司; dNTP、Bst DNA聚合酶購(gòu)自上海研拓生物科技有限公司; DNA marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司; 6 × DNA LoadingBuffer購(gòu)自天根生物技術(shù)公司; 瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司。

試驗(yàn)主要儀器：DYY-10C型電泳儀，購(gòu)自北京市六一儀器廠(chǎng);凝膠成像，儀購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 LAMP特異性引物、探針設(shè)計(jì)。LAMP特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)單增李斯特菌的actA基因，利用LAMP在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Explorer V5設(shè)計(jì)特異性引物。F3：CGAAAGCGCCTCAGTTTA；B3：CGTGGGTGTACATGTAATCG；FIP：GTCTCGAACAAGGCGTGAGTTTCATCAAGGCACAAGCG；BIP：CCGAAGAGCACGGTTTCGTCGATGAGCGGTTGATGTC；LoopF：CGTGATGTTGTAACCTTGCG；LoopB：GCGAGCGATCCTTGTTTG。

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化。

25 μL反應(yīng)體系包括： 外引物F3和B3，內(nèi)引物 FIP和BIP，MgCl2，緩沖溶液（ Buffer）， dNTPs，DNA模板，BstDNA聚合酶。在65 ℃恒溫水浴鍋中恒溫1 h，然后80 ℃滅活5 min終止反應(yīng)。優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系各參數(shù)，包括內(nèi)外引物濃度（μmol/L）比（0.8∶0.2、1.0∶0.2、1.2∶0.2、1.4∶0.2、1.6∶0.2、1.8∶0.2、2.0∶0.2）、鎂離子終濃度（1、2、3、4、5、6、7、8 mmol/L ）、dNTP濃度（0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L）、BstDNA聚合酶濃度（0.16、0.20、0.24、0.28、0.32 U/μL）以及反應(yīng)所需的最適溫度，擇優(yōu)建立LAMP反應(yīng)體系。

1.2.3 LAMP反應(yīng)的特異性。以單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）、威氏李斯特菌（Listeria welshimeri）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）等病原體作為對(duì)照菌株，并用去離子水作為空白對(duì)照，驗(yàn)證LAMP法檢測(cè)單增李斯特菌的特異性。

1.2.4 LAMP反應(yīng)的靈敏度試驗(yàn)。

采用稀釋平板法計(jì)算得到初始菌液濃度為6.4×106 CFU/mL的菌懸液，再用0.9%生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)苽錆舛葹?.4～6.4×106 CFU/mL的菌液，分別提取單增李斯特菌DNA，按上述LAMP體系進(jìn)行檢測(cè)。以各稀釋濃度的DNA為模板，以ddH2O為空白對(duì)照，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。以確定靈敏度。取5 μL LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀(guān)察試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 模擬樣品LAMP檢測(cè)方法的應(yīng)用

以市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的新鮮豬肉作為原始模擬樣本，稱(chēng)取25 g采用國(guó)標(biāo)GB 4789.30—2016方法進(jìn)行單增李斯特菌的分離培養(yǎng)鑒定，單增李斯特菌檢測(cè)陰性的豬肉樣本被認(rèn)為無(wú)單增李斯特菌污染，可用于制備模擬樣本。挑取參考株CMCC54006單菌落接種到5 mL BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r/min增菌直至OD600達(dá)到0.6，吸取100 μＬ增菌液到900 μL PBS緩沖液中進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋?zhuān)玫?.4×104 CFU/mL的菌液。

在市場(chǎng)中采集362份速凍肉類(lèi)及肉加工制品，取25 g樣品加入225? mL無(wú)菌生理鹽水均質(zhì)，制成肉糜類(lèi)樣品均質(zhì)液，將濃度為6.4×108 CFU/mL菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)苽錆舛葹?.4×104 CFU/mL的菌液，取不同濃度的初始菌液1 mL分別加入9? mL速凍肉糜類(lèi)樣品均質(zhì)液中，37? ℃培養(yǎng)10 h后，取1? mL菌液提取細(xì)菌基因組 DNA，分別采用該研究建立的LAMP反應(yīng)方法和國(guó)標(biāo)GB 4789.30—2016方法進(jìn)行檢測(cè)，用PALCAM平板和單增李斯特菌顯色平板劃線(xiàn)培養(yǎng)，再進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。比較2種方法的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算總體符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)溫度優(yōu)化。LAMP反應(yīng)設(shè)置61～66 ℃ 6個(gè)連續(xù)反應(yīng)溫度，從圖1可見(jiàn)，6個(gè)反應(yīng)溫度下均有擴(kuò)增條帶，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中條帶的清晰度及整齊度，確定最佳反應(yīng)溫度為65 ℃。

2.1.2 鎂離子濃度優(yōu)化。當(dāng)鎂離子濃度在1～8 mmol/L時(shí)，Mg2+含量過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響LAMP反應(yīng)，Mg2+濃度為6 mmol/L 時(shí)，LAMP反應(yīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中條帶最亮，確定該鎂離子濃度為反應(yīng)體系的最佳濃度（圖2）。

2.1.3 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化。LAMP反應(yīng)中，不同的內(nèi)外引物濃度比為1.8∶0.2、2.0∶0.2時(shí)，條帶較暗；當(dāng)內(nèi)外濃度比為0.8∶0.2、1.0∶ 0.2、1.2∶0.2、1.4∶0.2時(shí)，對(duì) LAMP反應(yīng)結(jié)果的影響不顯著，內(nèi)外引物比為1.6∶0.2時(shí)條帶最亮。因此，選擇其作為該擴(kuò)增體系的內(nèi)外引物濃度比（圖3）。

2.1.4 dNTPs濃度優(yōu)化。不同的dNTPs添加量對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)影響明顯，dNTPs濃度為0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L時(shí)，LAMP反應(yīng)條帶較暗，dNTPs濃度為1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L時(shí)，條帶較亮且無(wú)顯著差異，因此選擇LAMP反應(yīng)的dNTPs濃度為1.6 mmol/L（圖4）。

2.1.5 Bst DNA聚合酶濃度優(yōu)化。不同的Bst DNA聚合酶添加量對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)影響明顯，酶濃度為0.32 U/μL時(shí)，LAMP反應(yīng)條帶較亮，因此選擇LAMP反應(yīng)的Bst DNA聚合酶濃度為0.32 U/μL（圖5）。

2.2 LAMP檢測(cè)方法特異性分析

分別以單增李斯特菌及其他菌株的DNA為模板，按照建立的LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，觀(guān)察各反應(yīng)管中顏色，其中單增李斯特菌DNA有條帶，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管中呈綠色，其他菌株及空白對(duì)照無(wú)條帶且反應(yīng)液為橙黃色，表明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物具有較強(qiáng)的特異性（圖6）。

2.3 LAMP檢測(cè)方法靈敏度分析

將濃度為6.4～6.4×106 copies/μL單增李斯特菌菌液基因組DNA，同時(shí)按PCR方法和建立的 LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，LAMP法檢測(cè)單增李斯特菌的下限為64 copies/μL（圖7），該研究建立的LAMP方法敏感性較高。

2.4 LAMP檢測(cè)方法的應(yīng)用

對(duì)362份速凍肉類(lèi)及加工制品模擬樣本進(jìn)行LAMP方法和國(guó)標(biāo)方法GB 4789.30—2016檢測(cè)。LAMP方法檢測(cè)結(jié)果顯示，除了單增李斯特菌基因組DNA陽(yáng)性對(duì)照外，33份樣品檢測(cè)到單增李斯特菌，結(jié)果見(jiàn)表1。與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果符合率為 100%，顯示該 LAMP 方法具有良好的可靠性。

3 討論

該研究基于actA基因序列設(shè)計(jì)了檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP檢測(cè)方法擴(kuò)增引物，以其為靶序列設(shè)計(jì)LAMP擴(kuò)增引物，并驗(yàn)證其靈敏性和特異性。若擴(kuò)增結(jié)果通過(guò)電泳進(jìn)行判斷，會(huì)因氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性，且電泳判斷結(jié)果費(fèi)時(shí)費(fèi)力。該試驗(yàn)中反應(yīng)前于PCR管內(nèi)加入染料，反應(yīng)結(jié)束后無(wú)需開(kāi)蓋即可觀(guān)察結(jié)果，避免污染，不需要PCR儀等昂貴儀器，僅用水浴鍋即可檢測(cè)，成本低，效率高，適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，具有較強(qiáng)的應(yīng)用前景。

該研究建立的可視化LAMP方法靈敏度可以達(dá)到64 copies/μL。賀生芳等［7］針對(duì)單增李斯特菌iap基因設(shè)計(jì)LAMP引物和探針，建立了最低檢測(cè)限為2.21 CFU/mL 的檢測(cè)體系。賈甜甜［8］針對(duì)單增李斯特菌hly基因建立最低檢測(cè)限為94.70 CFU/mL的LAMP檢測(cè)體系。姜霞等［9］針對(duì)編碼溶血素的hly基因設(shè)計(jì)引物和探針，對(duì)單增李斯特菌純菌液的檢測(cè)靈敏度為88.00 CFU/mL，人工污染肉中單增李斯特菌的檢測(cè)靈敏度為880.00 CFU/mL。顧思宇等［10］針對(duì)Lm編碼內(nèi)化素蛋白基因建立了檢測(cè)下限為38 CFU/mL的LAMP檢測(cè)方法，但該方法未做到可視化檢測(cè)。在不同的LAMP反應(yīng)體系中，靈敏度有少許差異，原因可能是在不同引物長(zhǎng)度、引物溶解溫度、引物間距離、GC含量、引物末端穩(wěn)定性與二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致引物和模板的結(jié)合率受到了不同程度的影響，也可能與反應(yīng)中酶活性、化學(xué)試劑及操作有關(guān)［11］。

利用該可視化LAMP方法對(duì)單增李斯特菌和其他食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，只有單增李斯特菌出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，證實(shí)該可視化LAMP方法具有很好的特異性。當(dāng)LAMP擴(kuò)增進(jìn)行時(shí)，白色焦磷酸鎂沉淀與反應(yīng)液中的雙鏈DNA含量成正比，因此可通過(guò)濁度儀檢測(cè)焦磷酸鎂的沉淀量來(lái)判定是否發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)［12］。也可在反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素，其能在Mg2+ 離子與焦磷酸根離子結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光［5］。該試驗(yàn)通過(guò)在LAMP反應(yīng)體系中添加SYBR Green I染料，建立可視化LAMP反應(yīng)，減小開(kāi)蓋時(shí)造成的氣溶膠擴(kuò)散，避免檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性。

4 結(jié)論

該研究根據(jù)單增李斯特菌 actA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了可視化LAMP檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法靈敏度高，最低檢測(cè)限為64 copies/μL；特異性強(qiáng)，與金黃色葡萄球菌等其他食源性致病菌無(wú)交叉反應(yīng)。LAMP檢測(cè)時(shí)間短只需要45 min，現(xiàn)場(chǎng)操作步驟簡(jiǎn)單，只需一臺(tái)金屬浴，檢測(cè)試劑成本較低。對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果一致，可在食品安全檢測(cè)中應(yīng)用于對(duì)單增李斯特菌的快速檢測(cè)。

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