煙草鐮刀菌根腐病抗性鑒定方法研究

李雪君 郭敬 孫計(jì)平 孫煥 李芳芳 平文麗 李建華 俎煥新 李旭輝 侯詠 耿勝娜

摘? 要：為獲得不同煙草品種鐮刀菌根腐病抗性的鑒定方法，采用鐮刀菌粗毒素幼芽接種、孢子懸浮液培養(yǎng)、帶菌菌谷接種、離體葉片菌餅接種、草酸局部注射等5種方法對(duì)4個(gè)品種（小黃金1025、中煙100、長(zhǎng)脖黃、664-01）的鐮刀菌抗病性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，鐮刀菌毒素液脅迫法可以鑒定品種的抗感程度，適宜體系毒素濃度為8%，處理時(shí)間6 d；鐮刀菌孢子懸浮液接種法可以鑒定品種的抗感程度，適宜體系孢子液濃度為107個(gè)/mL，處理時(shí)間4 d；帶菌菌谷接種也可以鑒定品種的抗感程度，適宜體系菌谷比例為20%，處理時(shí)間9 d；離體葉片用菌餅和草酸液處理，能區(qū)分品種的抗感性，但不能區(qū)分品種的抗感程度。研究結(jié)果認(rèn)為孢子懸浮液接種法和帶菌菌谷接種與其他3種方法相比可以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)品種對(duì)鐮刀菌根腐病的抗感性。

關(guān)鍵詞：煙草；鐮刀菌根腐?。欢舅?；孢子液；菌餅；抗病性

中圖分類號(hào)：S435.72? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-5119（2023）02-0043-09

Abstract： To obtain suitable identifying methods of tobacco root rot resistance in different tobacco varieties（Xiaohuangjin1025， Zhongyan100， Changbohuang， 664-01）， the inoculation crude toxin of tobacco seedlings， spore suspension culture， inoculation of grain culture with fungi， inoculation mycelial cake of detached leaf and local injection of oxalic acid were investigated. The results showed that crude toxin stress could identify the resistance degree of tobacco varieties， and the suitable system was treated within 6 d at 8% toxin concentration. The inoculation spore suspension could identify the degree of resistance of different varieties and the suitable system was treated within 4 d and with 107 spores per mL. The inoculation of grain culture with fungi could also identify the degree of resistance of tobacco varieties， and the suitable system was treated within 9 d at the toxin concentration of 20% pathogenic fungus grain culture. The treatment of detached leaf with mycelial cake oxalic acid could distinguish the resistance of varieties， but could not differentiate the degree of resistance. The results showed that the spore suspension inoculation method and the fungal wheat culture inoculation method could accurately evaluate the resistance of varieties to Fusarium root rot compared with the other three methods.

Keywords： tobacco; Fusarium root rot; toxin; spore liquid; mycelial cake; disease resistance

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，播種面積在200萬hm2以上[1]。煙草病害對(duì)煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2-3]。近年來，隨著煙葉生產(chǎn)耕作模式的變化，大片連方種植使輪作倒茬十分困難，導(dǎo)致根莖類病害逐年加重[4-5]，其中煙草鐮刀菌（Fusarium）根腐病[2，6-7]發(fā)展極為迅速，在河南[6，8]、山東[9]、福建[10]、安徽[11]等地均有發(fā)生，特別是在黃淮煙區(qū)，鐮刀菌根腐病已經(jīng)上升為主要病害，重茬煙田發(fā)病率高達(dá)30%[12-13]，嚴(yán)重地塊甚至絕收。引起鐮刀菌根腐病的菌源有多種，如尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、茄病鐮刀菌（F. solani）、木賊鐮刀菌（F. equiseti）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）等[14]，不同地方報(bào)道的主要病原菌有所差異，河南[14]、湖北[15]、云南[16]煙區(qū)的主要致病菌均為尖孢鐮刀菌，在河南煙區(qū)該致病菌占81.25%[14]。由于真菌對(duì)殺菌劑抗性的不斷增強(qiáng)和環(huán)境因子的影響[17-18]，化學(xué)防治、生物防治收效甚微，選育和應(yīng)用抗病品種是控制煙草鐮刀菌根腐病的首選措施。在抗病品種的培育過程中，鐮刀菌根腐抗病種質(zhì)、后代材料的篩選需要準(zhǔn)確有效的抗性鑒定方法。

目前，對(duì)品種鐮刀菌根腐病抗性的鑒定方法主要有菌谷接種法、孢子懸浮液蘸根法、毒素法[19-20]等，但是尚未有鑒定方法的系統(tǒng)比較，缺乏全國統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，也沒有明確的抗病感病對(duì)照。不同鑒定方法采取不同的抗感對(duì)照[11，15，19]，很難確定材料的真實(shí)抗性水平。從統(tǒng)一抗感對(duì)照入手，比較不同的接種鑒定方法，對(duì)育種材料的篩選和鑒定有著非常重要的意義。

本文以優(yōu)勢(shì)菌種尖孢鐮刀菌為研究菌種，利用5種接種方法對(duì)尖孢鐮刀菌接種鑒定并進(jìn)行對(duì)比，對(duì)4個(gè)初步篩選的抗感材料進(jìn)行接種鑒定，旨在探索出一套快速、簡(jiǎn)便鑒定鐮刀菌根腐病抗性的方法，為鐮刀菌根腐病抗性煙草品種的選育及抗感對(duì)照的選取提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

供試煙草品種包括中煙100、長(zhǎng)脖黃、小黃金1025、664-01，均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草所種質(zhì)資源庫提供。

1.2? 病原菌的分離與鑒定

1.2.1? 病原菌的分離? 根據(jù)組織分離法，選取有鐮刀菌根腐癥狀的病株，剪取煙苗根部病健交接處3 mm左右的組織塊，使用70%酒精消毒30 s，3% NaClO溶液消毒30 s，無菌水沖洗3次，按壓在含青霉素和硫酸鏈霉素的PDA平板上，在25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2? 形態(tài)學(xué)鑒定? 觀察菌落形態(tài)及色素產(chǎn)生情況，并使用光學(xué)顯微鏡觀察孢子形態(tài)。

1.2.3? 分子生物學(xué)鑒定? 采用CTAB法提取鐮刀菌基因組DNA，使用真菌ITS-rDNA通用引物ITS1/ITS4：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登陸NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，選擇匹配值前100序列中的不同菌株序列作為參考序列。多序列比對(duì)使用Clustal W，采用默認(rèn)值，基于泊松模型、均勻模式、成對(duì)缺失的鄰接法（Neighbor-Joining）和1000次botstrap重復(fù)，利用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，小于50的引導(dǎo)值被隱藏。

1.2.4? 致病性測(cè)定? 參考邱睿等[19]的方法，將帶菌麥粒培養(yǎng)物接種到小黃金1025，于接種后10、20 d觀察植株發(fā)病情況。接種10 d后按照1.2.1的方法分離病原菌，并按照1.2.2和1.2.3的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，鑒定結(jié)果一致則說明該病原菌為致病菌。

1.3? 接種病原菌的制備

1.3.1? 鐮刀菌粗毒素的制備? 尖孢鐮刀菌在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，在裝液量100/250 mL的PD培養(yǎng)液接種2塊，28 ℃、180 r/min搖培3 d后，使用8層紗布過濾，6500 r/min離心20 min，保留上清液作為毒素原液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.2? 孢子懸浮液的制備? 尖孢鐮刀菌培養(yǎng)液的制備同1.3.1，培養(yǎng)液經(jīng)8層紗布過濾后，使用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)孢子濃度分別為1×105、1×106、1×107個(gè)/mL。

1.3.3? 帶菌麥粒培養(yǎng)物的制備? 參照邱睿等[19]的方法，在活化7 d的尖孢鐮刀菌平板上打取直徑6 mm的菌餅，挑取2塊接入裝有含1/3煮熟麥粒培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，25 ℃光照培養(yǎng)7 d，每12 h搖晃培養(yǎng)瓶保證菌絲均勻生長(zhǎng)。

1.4? 煙草品種抗性鑒定

1.4.1? 萌發(fā)期毒素脅迫培養(yǎng)? 煙草種子經(jīng)70%酒精消毒30 s，1% NaClO溶液消毒30 s，無菌水沖洗5次后，在溫度28 ℃光周期為8 h/d的光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)3 d至露白。在鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中分別加入5 mL 4%、8%、12%、16%、20%的毒素液，對(duì)照加入5 mL無菌水，每皿放入20粒正常露白種子，每個(gè)處理重復(fù)3次，在28 ℃、光周期為8 h/d條件培養(yǎng)3～5 d后，測(cè)定種子死亡率及存活種子根長(zhǎng)抑制率。

種子死亡率=（3次毒素處理死亡平均值/每皿點(diǎn)種總數(shù)）×100%

根長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照品種根長(zhǎng)-毒素處理品種根長(zhǎng)）/對(duì)照品種根長(zhǎng)×100%

1.4.2? 鐮刀菌孢子懸浮液接種鑒定? 挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的5葉期煙苗，分別在裝入45 mL左右（以不沒過煙苗莖部為宜）105、106、107個(gè)/mL孢子懸浮液的50 mL離心管中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)處理10株煙苗，置于28 ℃、光周期8 h/d的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d后根據(jù)GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)。

1.4.3? 帶菌麥粒接種鑒定? 帶菌麥粒培養(yǎng)物與無菌基質(zhì)按10%、20%的比例混合，選取長(zhǎng)至4～5片真葉的苗栽種到混合基質(zhì)中，每個(gè)處理10株煙苗，將等比例未接菌的麥粒培養(yǎng)基與無菌基質(zhì)混合作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，光周期為8 h/d條件下培養(yǎng)9 d，觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。

1.4.4? 離體葉片接種鐮刀菌? 挑選大小均勻的葉片，使用無菌注射器針頭在葉片上制造傷口，將尖孢鐮刀菌菌餅按壓在傷口上，用濕潤的無菌脫脂棉包裹住葉柄，在28 ℃光周期為8/16 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后，觀察葉片是否出現(xiàn)病斑。

1.4.5? 草酸處理模擬鐮刀菌試驗(yàn)? 參考劉勝毅等[21]的草酸浸葉法適當(dāng)調(diào)整，使用40 mmol/L濃度的草酸溶液注射葉片，注射6 d后觀察并統(tǒng)計(jì)葉片壞死的結(jié)果。

1.5? 煙草品種抗性評(píng)價(jià)

病情調(diào)查與抗性評(píng)價(jià)參考黑脛病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 23222—2008規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。以株為單位分級(jí)調(diào)查。根據(jù)調(diào)查結(jié)果計(jì)算并統(tǒng)計(jì)煙株病情指數(shù)。病情指數(shù)＝∑（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)值）×100。按照GB/T 23224—2008的規(guī)定進(jìn)行抗性標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。高抗或免疫（I），病情指數(shù)為0；抗?。≧），病情指數(shù)為0.1～20.0；中抗（MR），病情指數(shù)為20.1～40.0；中感（MS），病情指數(shù)為40.1～60.0；感?。⊿），病情指數(shù)為60.1～80.0；高感（HS），病情指數(shù)為80.1～100.0。

1.6? 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用DPS軟件對(duì)不同鑒定方法之間的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2? 結(jié)? 果

2.1? 鐮刀菌種類鑒定

2.1.1? 形態(tài)學(xué)鑒定? 菌落在PDA培養(yǎng)基上呈淡紫色（圖1），小型分生孢子橢圓形，單孢或偶有1～2個(gè)隔膜，大型分生孢子鐮刀狀，3～5個(gè)隔膜。

2.1.2? 分子生物學(xué)鑒定? 用真菌ITS-rDNA通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到的DNA片段大小約為550 bp。由生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果（Seq data）經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST分析比對(duì)，利用MEGA-X軟件構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，Seq data與尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum在同一發(fā)育分支，且序列相似性高達(dá)100%（圖2），因此確定此菌種為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌。

2.1.3? 致病性測(cè)定? 小黃金1025接種尖孢鐮刀菌10 d后，與對(duì)照相比長(zhǎng)勢(shì)明顯變?nèi)酰孔凕S發(fā)黑，須根變少，葉片由下至上變黃、枯萎；接種20 d后，煙株枯死（圖3）。對(duì)病原菌分離純化后，使用電子顯微鏡觀察孢子形態(tài)，符合圖1中尖孢鐮刀菌特征；送上海生工生物工程有限公司測(cè)序后比對(duì)結(jié)果與2.1.2相符，說明供試菌株具有致病性。

2.2? 煙草品種抗性鑒定

2.2.1? 鐮刀菌毒素液脅迫? 對(duì)萌發(fā)煙草種子采用不同濃度尖孢鐮刀菌毒素處理發(fā)現(xiàn)（表1、圖4），4種供試煙草品種對(duì)鐮刀菌根腐病的抗性有明顯差異，隨著毒素處理濃度的提高，4個(gè)品種表現(xiàn)出相應(yīng)程度的發(fā)病現(xiàn)象，煙草幼芽主根變黃變黑，葉片萎蔫變黃，死亡率隨之升高。

4%毒素接種后2 d，除小黃金1025發(fā)病外，其余3個(gè)品種均未發(fā)?。唤臃N至6 d時(shí)，小黃金1025死亡率為44.93%，中煙100死亡率為14.56%，長(zhǎng)脖黃和664-01死亡率為8.01%和7.12%，抗感材料死亡率差異不明顯。初步認(rèn)為4%毒素處理用于抗性鑒定不是最佳選擇。毒素處理6 d后，12%、16%、20%的3個(gè)處理種子死亡率均≥60%，抗感材料因毒素濃度過大而死亡率過高，故12%、16%、20%也不適用于抗性鑒定。

8%尖孢鐮刀菌毒素脅迫6 d后，小黃金1025和中煙100幼芽死亡率分別為63.68%和49.67%，容易感??；長(zhǎng)脖黃和664-01，死亡率分別為13.45%和11.88%，抗性較好，因此認(rèn)為煙草品種受8%毒素處理后的抗病感病程度有顯著差異，比較適合鐮刀菌抗性鑒定。對(duì)發(fā)病較輕的長(zhǎng)脖黃和664-01的胚根長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量后發(fā)現(xiàn)（圖5），使用8%尖孢鐮刀菌毒素脅迫處理長(zhǎng)脖黃，種子萌發(fā)后胚根生長(zhǎng)受到明顯抑制，抑制率為62.89%；664-01根長(zhǎng)抑制率為18.96%，胚根生長(zhǎng)受毒素影響較小。

2.2.2? 鐮刀菌孢子懸浮液接種鑒定? 尖孢鐮刀菌孢子懸浮液處理煙苗發(fā)現(xiàn)，供試品種對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性有明顯差異（表2、圖6）。而且隨著孢子懸浮液濃度的提高，煙苗發(fā)病程度越來越高，表現(xiàn)為葉片萎蔫、枯萎，根部變黃、變褐、腐爛等。

用濃度為105、106個(gè)/mL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液處理煙苗4 d后，抗感品種的病情指數(shù)均<60，不適合抗性鑒定。濃度為1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液處理3 d后，煙苗發(fā)病程度差異顯著。小黃金1025和中煙100感尖孢鐮刀菌，病情指數(shù)分別為62.96、66.67，長(zhǎng)脖黃對(duì)尖孢鐮刀菌中抗，664-01表現(xiàn)為抗病。

2.2.3? 帶菌菌谷接種鑒定? 對(duì)4個(gè)品種進(jìn)行帶菌麥粒接種，分別設(shè)置10%、20%兩個(gè)比例。在10%濃度處理下，與對(duì)照相比，4個(gè)品種均無明顯發(fā)病情況（表3、圖7）；在20%濃度處理下，小黃金1025和中煙100根部出現(xiàn)腐爛（圖8），依據(jù)GB/T 23224—2008 《煙草品種抗病性鑒定》標(biāo)準(zhǔn)，煙草品種的抗性測(cè)定結(jié)果表明，小黃金1025、中煙100表現(xiàn)感??；長(zhǎng)脖黃表現(xiàn)為中抗；664-01表現(xiàn)為抗（表3、圖7）。

2.2.4? 離體葉片鐮刀菌菌餅接種? 如圖9所示，在煙草離體葉片接種尖孢鐮刀菌菌餅9 d后，因?yàn)橛芯灥母采w，所有材料均有淡黃色枯斑，小黃金1025枯斑出現(xiàn)明顯擴(kuò)散，中煙100病斑也有擴(kuò)散痕跡，長(zhǎng)脖黃和664-01沒有病斑擴(kuò)散。說明長(zhǎng)脖黃和664-01對(duì)該病菌有抵抗性，小黃金1025和中煙100對(duì)尖孢鐮刀菌易感。

2.2.5? 離體葉片草酸注射? 通過向葉片注射40 mmol/L的草酸，根據(jù)病斑大小（圖10）可以得出，小黃金1025葉片壞死最嚴(yán)重，其次是中煙100，可以初步認(rèn)為是感病品種；長(zhǎng)脖黃的葉片受損壞死最少，664-01次之，表現(xiàn)出較好的抗性。初步認(rèn)為利用草酸模擬，可以從一定程度上區(qū)分不同品種對(duì)鐮刀菌的抗感性。

2.2.6? 尖孢鐮刀菌5種接種方法比較? 從表4可以看出，第1種處理方法毒素脅迫所需時(shí)間最短，省去了培養(yǎng)苗的時(shí)間，一共16 d，其余幾種方法都是用5葉期的幼苗，培養(yǎng)苗的時(shí)間一致，試驗(yàn)處理所需時(shí)間差異不大，但培養(yǎng)苗的時(shí)間是毒素脅迫的4倍，明顯長(zhǎng)于第1種方法。

從處理后抗性鑒定的效果上來看，以上5種方法均能區(qū)分出品種的抗、感性，前3種方法能區(qū)分出抗感程度，后2種方法不能區(qū)分出抗感程度。前3種處理方法較復(fù)雜，后2種處理方法直接處理離體葉片，處理方法比較簡(jiǎn)單，尤其是最后一種，省去了病菌的培養(yǎng)，處理最為簡(jiǎn)單。

3? 討? 論

煙草品系的抗性鑒定與評(píng)價(jià)是抗病育種最為關(guān)鍵的一環(huán)。接種體系簡(jiǎn)單高效、接種結(jié)果穩(wěn)定可靠對(duì)煙草抗病材料的鑒定與篩選非常重要。

本研究對(duì)鐮刀菌毒素脅迫和孢子懸浮液接種鑒定這兩種方法進(jìn)行了不同濃度和處理時(shí)間的研究。鐮刀菌毒素脅迫試驗(yàn)中，同一品種經(jīng)不同濃度尖孢鐮刀菌毒素液處理后受損程度不同，隨毒素濃度提高，受損加重；不同品種對(duì)相同濃度毒素液敏感程度也不同，這與趙杰等[21]的研究結(jié)果一致，初步說明用鐮刀菌毒素進(jìn)行抗性鑒定的方法是可行的。從發(fā)病情況來看，采用8%的濃度處理6 d能區(qū)分出供試抗感品種。從種子胚根生長(zhǎng)狀態(tài)看，2個(gè)抗病品種的抗病機(jī)理不相同，在同樣發(fā)病較輕的情況下，長(zhǎng)脖黃胚根受毒素抑制較大，664-01胚根受抑制比較小，幾乎不影響其生長(zhǎng)。因此，這2個(gè)抗性材料的抗病機(jī)理上應(yīng)該存在一定差異，有待進(jìn)一步研究。

孢子懸浮液接種試驗(yàn)中，1×105、1×106個(gè)/mL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液處理煙苗不能明顯區(qū)分抗感品種，1×107個(gè)/mL孢子懸浮液處理3 d后可以顯著區(qū)分，小黃金1025和中煙100為感病品種，長(zhǎng)脖黃和664-01為抗病品種，這與劉利佳[20]通過大型分生孢子接種的結(jié)果一致。批量制備孢子懸浮液過程同大型分生孢子相比，耗時(shí)短并且操作簡(jiǎn)單，在生產(chǎn)上高效便捷。

本研究接種菌谷的鑒定結(jié)果與邱睿等[19]的報(bào)道不完全一致，小黃金1025為感病品種，這個(gè)基本一致；中煙100本研究鑒定結(jié)果為感病，文獻(xiàn)[19]中為中抗，根據(jù)圖片來看，推測(cè)原因可能是接種時(shí)期和接菌量不一致導(dǎo)致的，邱睿等的研究中接種時(shí)苗齡較大，接菌量比較小，所以發(fā)病程度偏輕。

離體葉片接種法在煙草黑脛病和青枯病鑒定方面已有報(bào)道[22-23]，還未見于鐮刀菌根腐病的研究中。本研究通過離體葉片接種菌餅發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)脖黃和664-01對(duì)尖孢鐮刀菌具有抗性，小黃金1025和中煙100表現(xiàn)為易感。

核盤菌、灰霉菌屬于子囊菌門，都可以分泌草酸，在致病過程中起到重要作用，寄主抗草酸能力越強(qiáng)，抗病能力也越高[24-25]。尖孢鐮刀菌有性態(tài)時(shí)期也屬于子囊菌門，但是草酸對(duì)鐮刀菌的致病機(jī)理還鮮有報(bào)道。本研究采用草酸注射法發(fā)現(xiàn)，感病品種小黃金1025和中煙100出現(xiàn)病斑擴(kuò)散，抗病品種則沒有出現(xiàn)病斑。說明用該種方法，可以快捷地鑒定出品種多鐮刀菌的抗感能力。至于抗感程度和抗病機(jī)理，目前尚在研究中。

在本研究中多種方法接種鑒定認(rèn)為，長(zhǎng)脖黃為“中抗-抗”尖孢鐮刀菌，與資料中的鑒定結(jié)果“中感”差異較大，至于具體原因，尚不明確。不同品種在大田接種尖孢鐮刀菌接菌后的實(shí)際發(fā)病情況，本研究在嘗試后沒有得到抗感性鑒定結(jié)果，因?yàn)樵诖筇镏校牭毒『秃诿劜⊥腔旌习l(fā)生，大田土壤中黑脛病病菌很難分離出去。尖孢鐮刀菌在苗期接種鑒定，優(yōu)點(diǎn)是能確定生長(zhǎng)基質(zhì)或營養(yǎng)液的病菌純度，確保發(fā)病癥狀是該種病菌引起的。幾種鑒定方法是否與大田后期發(fā)病相一致，還需要進(jìn)一步研究。

本研究利用的鐮刀菌根腐病2個(gè)感病品種小黃金1025、中煙100和2個(gè)抗病品種長(zhǎng)脖黃、664-01，經(jīng)過多種方法多次鑒定，抗感性結(jié)果一致性較高，初步認(rèn)為可以作為煙草鐮刀菌根腐病抗性鑒定的抗感對(duì)照品種。值得重視的是，這4個(gè)品種，對(duì)煙草鐮刀菌根腐病的抗感性與黑脛病的抗感性差異較大，對(duì)黑脛病的抗感性分別是：小黃金1025感病[26]，中煙100抗病[27]，長(zhǎng)脖黃感病[28]，664-01抗病。因大田發(fā)病鐮刀菌根腐病和黑脛病經(jīng)?；旌习l(fā)生，建議大田鑒定鐮刀菌根腐病時(shí)，最好用中煙100作為感病對(duì)照，664-01作為抗病對(duì)照，可以減少黑脛病病菌對(duì)鐮刀菌鑒定結(jié)果的影響。

4? 結(jié)? 論

本研究采取5種方法對(duì)煙草品種進(jìn)行鐮刀菌根腐病抗性鑒定，得出的結(jié)果大致相同，小黃金1025和中煙100為感病品種，長(zhǎng)脖黃和664-01為抗病品種。為降低大田黑脛病對(duì)鐮刀菌根腐病的影響，本研究認(rèn)為可選擇中煙100作為感病對(duì)照、664-01作為抗病對(duì)照。

8%尖孢鐮刀菌毒素液處理煙草種子6 d可以鑒定煙草種子的抗感水平，該方法操作簡(jiǎn)單，不受季節(jié)影響，所需時(shí)間短，適合大批量材料的篩選。1×107個(gè)/mL孢子懸浮液培養(yǎng)煙苗3 d適合篩選煙草抗感品種，該方法準(zhǔn)確度較高，感病品種發(fā)病較快、較明顯，處理時(shí)間短。20%麥粒培養(yǎng)物培養(yǎng)10 d可以鑒定煙苗抗感水平，該方法能準(zhǔn)確、直觀地觀察出煙苗發(fā)病情況，但與孢子懸浮液接種法相比受溫濕度影響較大，所需時(shí)間長(zhǎng)，操作較繁瑣。葉片接菌餅法和草酸模擬注射法不能區(qū)分煙草品種抗感程度，可用來初步鑒定品種抗感性，兩種方法均不受季節(jié)限制，操作簡(jiǎn)單便捷。因此，從鑒定結(jié)果準(zhǔn)確直觀來比較，認(rèn)為孢子懸浮液接種法和帶菌菌谷接種法最適合用于煙草品種鐮刀菌根腐病抗性鑒定。

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