黃酮類化合物的抗菌效能及抑制口腔微生物的研究進展

曲珊琳 于 爍 方 圓 王 瑞

口腔作為上消化道的組成部分，為微生物的定居、生長和繁殖提供了適宜的環(huán)境條件，口腔微生物與宿主（飲食習(xí)慣、口腔衛(wèi)生）之間的相互作用，可影響口腔微生態(tài)的組成與穩(wěn)定。當(dāng)機體免疫功能受損或口腔微生態(tài)失衡時則可引起多種口腔疾病，如齲病、牙周病、口腔黏膜病等，且可能進一步影響全身健康[1]。目前抗生素的濫用所導(dǎo)致的多重耐藥菌的產(chǎn)生和傳播，也成為了一大潛在危險因素，因此替代療法成為一大研究熱點[2]。黃酮類化合物是人類營養(yǎng)和健康的重要化合物，已被證實具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗菌、抗病毒[5]、抗炎[6]、抗動脈粥樣硬化[7]等作用。部分黃酮類化合物可食用，具有較高的安全性，無細胞毒性，與抗生素相比可降低多重耐藥菌的產(chǎn)生，具有頗為重要的臨床意義。本文將從黃酮類化合物的抗菌概況、構(gòu)效關(guān)系、在抑制口腔微生物的應(yīng)用方面做一綜述。

一、黃酮類化合物抗菌概況與構(gòu)效－活性關(guān)系

黃酮類化合物具有常見的C6-C3-C6 結(jié)構(gòu)的母核（圖1），并通過C-C 或C-O-C 鍵以單、二、三、四或聚合形式存在[8]。通過改變B 環(huán)位置、C 環(huán)羥基化、氧化和飽和程度，可將黃酮類化合物進一步細分為查耳酮、黃烷酮、黃烷醇、黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷-3-醇（兒茶素）和花青素[9]。已有研究表明黃酮類化合物可影響對細菌的生長繁殖至關(guān)重要的因素，如降低細菌粘附、抑制生物膜的形成、改變細胞膜的通透性、抑制膜蛋白[10]、降低毒力因子的致病性[11]等，黃酮類化合物還可與部分抗生素發(fā)生協(xié)同作用，增強抗生素對耐藥菌群的抑制作用。

圖1 黃酮類化合物的母核

有學(xué)者認為，黃酮類化合物的抗菌活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[12]，構(gòu)效-活性關(guān)系分析對深入探究黃酮類化合物的抗菌機制具有重要意義（表1）。一般來說，羥基會增加黃酮類化合物的抗菌活性。Wu 等[13]測試了多種黃酮類化合物對于大腸桿菌的抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素表現(xiàn)出比木犀草素更強的抑制活性，原因在于與木犀草素相比，槲皮素在C環(huán)中C-3 處的羥基可降低胞膜的流動性從而發(fā)揮抗菌作用。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)槲皮素和芹菜素可與大腸桿菌的D-丙氨酸連接酶（Ddl）的底物ATP 競爭，但與芹菜素相比，槲皮素B 環(huán)C-3'和C 環(huán)C-3 處增加的兩個羥基可促進其抑制活性以及對Ddl 的親和力[14]（表2）。

表1 黃酮類化合物的分類與構(gòu)效關(guān)系

表2 槲皮素、木犀草素與芹菜素的構(gòu)效關(guān)系對比

而甲氧基的位置和數(shù)量也可影響黃酮類化合物的抗菌活性[15]（表1），兩種聚甲氧基黃酮（PMF），橘紅素（5，6，7，8，4'- 五甲氧基黃酮）和5，6，7，4'- 甲氧基黃酮，均顯示出比其他黃酮類化合物更低的抗菌活性，表明甲氧基的存在會降低黃酮類化合物的抗菌活性[13]，但值得關(guān)注的是，因A 環(huán)C-8 甲氧基的存在，橘紅素表現(xiàn)出比5，6，7，4'-甲氧基黃酮更強的抑制活性[16]。Yang 等[17]發(fā)現(xiàn)提取自槐花的黃酮類化合物蘆丁和槲皮素-3'-O- 甲基-3-O-α-L-鼠李糖苷（1→6）-β- 葡萄糖苷相比，后者B 環(huán)C-3' 位置的甲氧基可影響對Sm 來源的分選酶（Sortase, Srt）A 的抑制活性，蘆丁C-3'上的羥基和C-3 上的O-鼠李糖苷的共存是高度抑制SrtA 活性的必要條件（表3）。

表3 蘆丁與槲皮素-3'-O-甲基-3-O-α-L-鼠李糖苷（1→6）-β-葡糖苷的構(gòu)效關(guān)系對比

此外，疏水性取代基，如異戊烯基、烷基氨基鏈、烷基鏈等也可增強黃酮類化合物的抗菌活性[18]。Kalli 等[19]發(fā)現(xiàn)從豆科植物中提取的幾種異戊二烯基黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中異戊烯基對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）有著強烈抑制作用（MIC≤10 μg/mL，30 μM），且廣泛疏水性的存在更增強了其抗菌特性，但也有學(xué)者表示，戊烯基的抗菌活性也與其在環(huán)上的位置相關(guān)，在異補骨脂查耳酮的B 環(huán)上增加一個異戊烯基，抗菌活性明顯下降[20]。另有研究表示，黃酮類化合物分子的兩親性也對抗菌活性非常重要，需同時具有一定間隔的疏水性和親水性區(qū)域[21]。

二、黃酮類化合物抑制口腔微生物的研究進展

1.黃酮類化合物與齲病相關(guān)菌

齲病是口腔微生物群、飲食、牙列和口腔環(huán)境相互作用的結(jié)果，變異鏈球菌（Streptococcus mutans，Sm）對齲病的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[29]。葡糖基轉(zhuǎn)移酶（Gtfs）是由Sm與葡聚糖結(jié)合蛋白（GBPs）結(jié)合產(chǎn)生，主要分為3 種：GtfB、GtfC、GtfD，分別在細菌定植、細菌間的結(jié)合、菌斑形成、多糖產(chǎn)生與能量儲備[30]等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，來自柑橘類植物的柚皮素[31]在100 μg/mL 和200 μg/mL 濃度下作用24小時可顯著下調(diào)Sm的GtfB、GtfC的基因表達，甚至幾乎無法檢測到Gtfs基因。因GtfD基因與其他Gtfs基因同源性較低（50%）[32]，黃酮類化合物對GtfD的作用也有所不同，Hyun Koo 等[33]發(fā)現(xiàn)芹菜素可顯著降低GtfB和GtfC的表達，而上調(diào)GtfD的表達，提示抑制GtfB和GtfC的表達或可誘導(dǎo)GtfD的表達。Gtfs 通過糖苷鍵將葡萄糖部分連接，形成胞外多糖（EPS），與生物膜機械穩(wěn)定性密切相關(guān)[34]。Dongyeop等[35]發(fā)現(xiàn)蔓越莓來源的原花青素四聚體、九聚體以及楊梅素可導(dǎo)致EPS 數(shù)量減少、分布稀疏，且施加0.449 N/m2的剪切應(yīng)力時，生物膜脫落率約為90%，提示了黃酮類化合物作為Sm生物膜抑制劑的潛在應(yīng)用前景。Sm產(chǎn)酸導(dǎo)致細胞外pH 值降低，釉質(zhì)脫礦，為了應(yīng)對細胞外偏酸性環(huán)境對其自身的影響，Sm 通過增加質(zhì)子轉(zhuǎn)運F-ATP 酶的活性來緩解[36]。Guan 等[37]發(fā)現(xiàn)，蜂膠中黃酮類化合物槲皮素和山奈酚，可能通過形成不可逆復(fù)合物滅活細胞外蛋白，抑制F-ATP 酶的活性，降低Sm的耐酸性。Sm可通過錨定反應(yīng)來逃避宿主的免疫反應(yīng)，以提高Sm的毒力效應(yīng)和傳染性[38]，此過程由Srt 催化[39]，有研究表明，SrtA上的半胱氨酸殘基Cys205 的游離硫醇可與反式查耳酮之間發(fā)生不可逆的邁克爾加成反應(yīng)，導(dǎo)致SrtA活性降低[40]，以上研究結(jié)果均表明了黃酮類化合物作為新型Sm抗菌劑的潛在優(yōu)勢。

2.黃酮類化合物與牙周病致病相關(guān)菌

牙周炎是細菌引起的牙周組織炎癥性疾病，其發(fā)病過程主要分為以下兩個層面：牙菌斑及其產(chǎn)物造成的直接破壞、宿主免疫反應(yīng)造成的間接破壞[41]，其中牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis, Pg）是牙周病最具代表性的致病菌之一，黃酮類化合物對Pg表現(xiàn)出顯著的抑制作用，槲皮素可導(dǎo)致Pg細胞膜的完整性喪失[42]。綠茶中提取的茶兒茶素表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）[43]可顯著抑制Pg生物膜的形成，顯示EPS 結(jié)構(gòu)喪失，細胞壁和細胞膜皆有損傷。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是Pg細胞外膜的主要成分，可刺激牙周組織內(nèi)產(chǎn)生多種炎癥細胞因子。研究表明，蔓越莓來源的原花青素A和甘草查爾酮A 可協(xié)同減少LPS 誘導(dǎo)的炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的表達[44]，而有研究顯示原花青素對Pg的自身生長并無影響[45]。TLR2和TLR4是LPS 的主要受體，Luo 等[46]發(fā)現(xiàn)黃芩來源的黃芩苷可抑制做為TLR2和TLR4信號通路的下游通路的Iκβα、p38MAPK和JNK的磷酸化，顯著下調(diào)TLR 信號相關(guān)基因。槲皮素[47]也可抑制由TLR4介導(dǎo)的NF-κB活化，且此過程可被PPAR-γ拮抗劑逆轉(zhuǎn)，表明PPAR-γ是槲皮素潛在的靶點。牙齦蛋白酶是Pg發(fā)揮蛋白水解活性、降解牙周組織最主要的半胱氨酸蛋白酶[48]，研究發(fā)現(xiàn)，提取自淫羊藿的異戊二烯基黃酮可抑制牙齦蛋白酶（尤其是Kgp）的活性[49]，并抑制牙齦蛋白酶導(dǎo)致的人類Ⅰ型膠原、血清蛋白的降解，降低血管通透性[50]，促進牙周組織再生[51]?；|(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）是鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，參與切割細胞外基質(zhì)蛋白、組織重塑和降解細胞外基質(zhì)[52]，破壞牙周組織。研究表明，提取自紅茶的茶黃素可顯著抑制Pg刺激的人牙齦成纖維細胞（HGF）對MMP-1和MMP-2的分泌和mRNA 表達[53]。

3.其他

根據(jù)頜面外科住院患者術(shù)后感染的病原菌比例分析，銅綠假單胞菌占比最高（26.51%），其次是肺炎克雷伯菌（10.44%）和金黃色葡萄球菌（8.43%）[54]，上述三種菌與頜面外科術(shù)后感染的發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，槲皮素可抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)生的綠膿菌素和彈性蛋白酶的表達，導(dǎo)致細菌運動性降低，影響生物膜的形成[55]。茶多酚可協(xié)同多種抗生素（亞胺培南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟和頭孢他啶）抑制多重耐藥肺炎克雷伯菌，影響細胞膜的形成及細胞外黏液樣物質(zhì)的產(chǎn)生[56]。楊梅素、橙皮素和根皮素可抑制的強生物膜產(chǎn)生菌金黃色葡萄球菌RN4220 生物膜的形成（＞70%）[57]。桑根皮來源的桑根酮D 可通過下調(diào)金黃色葡萄球菌的脂肪酸生物合成酶編碼基因抑制細菌活性和生物膜形成[58]。糞腸球菌是一種機會致病菌，與頜面外科術(shù)后感染和頑固性根管感染相關(guān)，研究表明，EGCG可抑制糞腸球菌的生長與生物膜形成，以及糞腸球菌相關(guān)毒力因子基因如ace，cylA，gelEandsprE的表達[59]。幽門螺桿菌參與牙菌斑形成，與牙周炎、口臭、口腔黏膜病等具有一定相關(guān)性[60]，幽門螺桿菌的hp1043 基因可編碼HsrA蛋白，在細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細胞代謝、調(diào)節(jié)DNA 表達等方面發(fā)揮重要作用。González 等[61]發(fā)現(xiàn)芹菜素、白菊花素、山奈酚和橙皮素均可與HsrA的c 末端效應(yīng)域結(jié)合，形成螺旋-轉(zhuǎn)角- 螺旋（HTH）結(jié)構(gòu)，作用于DNA 結(jié)合基序的氨基酸殘基，抑制其結(jié)合DNA 的活性。

三、總結(jié)

黃酮類化合物可通過影響致病菌粘附、生物膜與細菌本身的結(jié)構(gòu)及相關(guān)的酶和毒力因子等，達到預(yù)防和治療口腔疾病的目的，研究技術(shù)的更新發(fā)展，如蛋白組學(xué)、基因組學(xué)等，為黃酮類化合物復(fù)雜作用機制的深入探究奠定基礎(chǔ)。但目前以下幾個方面尚待進一步研究：①部分黃酮類化合物的抗菌機理、用藥安全性及毒理作用；②對某些黃酮類化合物所具有的特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行修飾、加成，或可有助于其發(fā)揮抗菌效能，但要注意某些基團數(shù)量、位置及可能存在的拮抗作用；③黃酮類化合物是否能影響口腔微生物總體水平，對口腔致病微生物的抗菌作用是否具有靶向性；④不同黃酮類化合物之間的協(xié)同作用、與其他抗菌藥物的聯(lián)合用藥；⑤黃酮類化合物與新型臨床技術(shù)或新型臨床材料之間的聯(lián)合。綜上所述，黃酮類化合物在口腔疾病的防治中具有潛在的開發(fā)價值和臨床優(yōu)勢，為口腔新型藥物和新型治療手段的研發(fā)提供了新的契機。