益生菌鼠李糖乳桿菌通過下調(diào)促炎性Th17改善實驗性牙周炎

賈 璐 杜 鵑 羅振華 郭力嘉 徐駿疾 劉 怡

牙周炎（periodontitis，PD）是常見的由菌斑生物膜觸發(fā)的口腔慢性感染性疾病，不僅導(dǎo)致牙周支持組織的破壞和牙齒松動脫落，還與炎癥性腸病、糖尿病、心腦血管疾病等多種系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)[1，2]。宿主免疫反應(yīng)與牙周致病菌之間的相互作用被認為是牙周炎的主要發(fā)病機制。此外，全身性疾病或其他組織的局部感染也是牙周炎病理的促進因素[3]。

近來腸道菌群被認為是決定機體是否健康的核心調(diào)控機制，因為腸道微生物及其代謝物不僅影響腸道屏障功能、機體炎癥反應(yīng)，而且與宿主免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，比如CD4+T 細胞亞群平衡等[4]。課題組前期證實PD 致病菌-牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）和益生菌-LGG 能夠分別通過TLR4 和TLR2 信號通路介導(dǎo)促炎性Th17 細胞和免疫抑制性Treg 細胞之間的平衡，進而調(diào)控腸道免疫性炎癥的進展[5]。Meta 分析表明根面平整結(jié)合局部輔助應(yīng)用益生菌制劑（羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri、LGG）相較于單純進行根面平整，更有助于改善牙周炎患者的附著喪失、牙齦出血和牙周探診深度[6，7]。LGG 是正常腸道菌群之一，在腸道的定植力強，具有調(diào)節(jié)腸道菌群及增強感染防御的功能；也是目前研究最多的益生菌菌株，能夠在胃和十二指腸膽汁酸中存活并在體內(nèi)發(fā)揮抗炎特性，有益于提升機體免疫力[8]。

研究對實驗性牙周炎小鼠實施灌胃LGG 的措施，發(fā)現(xiàn)能顯著減輕牙周炎的牙槽骨吸收，同時能夠通過下調(diào)牙周局部和全身促炎性Th17 細胞百分比進而降低炎癥水平。

材料和方法

1. 材料和試劑：乳酸菌培養(yǎng)基（MRS 培養(yǎng)基，Thermo）；流式抗體Anti-mouse CD4 FITC、Antimouse IL-17A PE、Anti-mouse CD25 PE、Antimouse FoxP3 eFluor 450（eBioscience）；引物（生工）；絲線（金環(huán)）；注射器（BD）；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）；Cell Activation Cocktail（Biolegend）；核內(nèi)因子固定/滲透緩沖液（eBioscience）；胞內(nèi)因子固定/破膜緩沖液（Biolegend）；流式細胞儀LSRFortessa（BD）；酶標儀（Thermo）。

2. 培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌：本實驗采用LGG 菌株CICC 6141（首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院組織再生和免疫學實驗室微生物平臺保種）。參照前期發(fā)表文獻，采用MRS 培養(yǎng)基置于37℃及厭氧條件下培養(yǎng)48 h 至細菌對數(shù)生長期[5]。通過測量光密度（波長為600 nm）來標準化菌落形成單位（CFU）的數(shù)量。每次量化2×109個CFU 懸浮在200 μL 生理鹽水制成LGG 活菌液，以用于灌胃實驗。用1 mL 注射器配合灌胃針頭抽取定量200 μL LGG 活菌液，自小鼠食道至胃部推注，避免菌液從口中流出。

3.建立小鼠實驗性牙周炎模型：選用6～8 周雄性C57BL/6 小鼠作為本實驗動物，由北京斯貝福公司提供，飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院動物房。實驗方案得到首都醫(yī)科大學動物倫理委員會批準（KQYY-201712-002），所有動物均按照實驗動物倫理委員會的要求進行管理和操作。參照先前研究通過絲線結(jié)扎誘導(dǎo)小鼠實驗性牙周炎[9～11]。將5-0 絲線環(huán)繞懸吊在6～8 周小鼠上頜第二磨牙周圍，為期2周。每隔1 天檢查一次結(jié)扎情況，一旦絲線脫落，立即再次結(jié)扎。每只小鼠每隔1 天灌胃200 μL 生理鹽水或LGG 活菌液，共7 次。實驗分為2 組，牙周炎對照組（PD 組）和灌胃LGG 實驗組（PD+LGG 組），每組5 只小鼠。

4. 流式檢測下頜淋巴結(jié)及脾臟內(nèi)IL-17A+Th17和CD25+Foxp3+Treg：分離各組小鼠的下頜淋巴結(jié)及脾臟內(nèi)淋巴細胞。對于IL-17A+Th17 染色，細胞先用含有Brefeldin A 的Cell Activation Cocktail 在37℃下刺激5 h，然后用Anti-mouse CD4 FITC 抗體標記，依據(jù)使用說明用胞內(nèi)因子固定/破膜緩沖液使細胞打孔后，再用Anti-mouse IL-17A PE 抗體進行染色；對于CD25+Foxp3+Treg 染色，細胞先用Antimouse CD4 FITC 抗體和Anti-mouse CD25 PE 抗體進行表面標記，依據(jù)使用說明用核內(nèi)因子固定/滲透緩沖液使細胞打孔固定后，再用Anti-mouse FoxP3 eFluor 450 抗體進行染色。染色細胞在流式細胞儀上檢測，采用FlowJo 軟件分析數(shù)據(jù)，并對IL-17A+Th17細胞和CD25+Foxp3+Treg 細胞分別占CD4+T 細胞總數(shù)的百分比進行統(tǒng)計學分析。

5.RT-qPCR：收集各組PD 小鼠的牙齦組織，按照RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書步驟操作，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測cDNA 純度，加入反轉(zhuǎn)錄酶等反應(yīng)物，加入引物以及SYBR Green 上機運行qPCR。以Gapdh為內(nèi)參基因。

Gapdh引物：上游5’-TGAAGCAGGCATCTGAG GG-3’,下游3’-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-5’；Il-17a引物：上游5’-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3’,下游3’- CTTTCCCTCCGCATTGACAC-5’；Il-6引物：上游5’-GCTTTAACAGCAGGCCAGAC-3’,下游3’-GGAAGCACCAGGTGTCAAGT-5’；Tnf-α引物；上游5’-GGTGTCTGGGAAGCTGAGAG-3’,下游3’-CTCTGTCTGGTGCTGGTTGA-5’；Il-1β引物：上游5’-GCTGGCCCTTTGTGTAATGT-3’, 下游3’-AACCATTGCAGGGCTATGAC-5；Rorc引物：上游5’-CCCTTGGGCTGTGTTAATAGTG -3’， 下 游3’-AACTTCTCGTACAAGCCTGGG-5’；Foxp3引物：上游5’-CCCATCCCCAGGAGTCTTG-3’, 下 游3’-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-5’。

6.ELISA：收集各組小鼠的外周血血清樣本，按照制作商的說明書步驟操作，將其分別與抗IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-1β 的抗體對一起孵育，加入底物液和終止液，反應(yīng)體系置于酶標儀內(nèi)，將空白孔調(diào)零后，測定標本孔的吸收值。

7.統(tǒng)計學方法：所有統(tǒng)計學分析及圖表繪制均采用GraphPad Prism 8 進行，采用Mean±SEM 或者violin plot 形式呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。兩組之間的差異采用非配對的Student’s t-test 進行評估；P＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義；*表示圖中P 值結(jié)果（*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001）。

結(jié) 果

1.灌胃LGG 緩解實驗性PD：如圖1 所示，相比較于PD 組，PD+LGG 組的PD 小鼠牙槽骨吸收顯著緩解。分別測量上頜第二磨牙的腭側(cè)和頰側(cè)釉牙骨質(zhì)界（cemental-enamel junction, CEJ）到牙槽嵴頂（alveolar bone crest, ABC）的位置，PD 組腭側(cè)牙槽骨吸收均值為208.1 μm，PD+LGG 組腭側(cè)牙槽骨吸收均值為98.72 μm；PD 組頰側(cè)牙槽骨吸收均值為261.7 μm，PD+LGG 組頰側(cè)牙槽骨吸收均值為154.7 μm（圖1B，腭側(cè)**P＜0.01；圖1C，頰側(cè)**P＜0.01）。

圖1 灌胃LGG 減緩實驗性PD 的牙槽骨吸收

2.灌胃LGG 下調(diào)PD 小鼠下頜淋巴結(jié)及脾臟內(nèi)IL-17A+Th17：為進一步探究灌胃益生菌LGG 緩解PD 的可能機制，采用流式細胞術(shù)對牙周引流淋巴結(jié)及外周脾臟內(nèi)Th17 和Treg 的百分比進行檢測，結(jié)果如圖2 所示，PD+LGG 組比PD 組牙周炎小鼠的下頜下淋巴結(jié)（SLCs）中促炎性IL-17A+Th17 細胞占CD4+T 細胞的百分比顯著下降（圖2A，B，（PD+LGG組均值2.46%）versus（PD 組均值0.69%），***P＜0.001），但是SLCs 中的免疫抑制性CD25+Foxp3+Treg 細胞占CD4+T 細胞的百分比在兩組之間的差異不具有統(tǒng)計學意義（圖2C，D，P＞0.05）。

圖2 兩組PD 小鼠的下頜下淋巴結(jié)細胞（SLCs）內(nèi)IL-17A+Th17 和CD25+Foxp3+Treg 分別占CD4+T 細胞的百分比

同時，PD+LGG 組比PD 組PD 小鼠的脾臟淋巴細胞（SPLs）中促炎性IL-17A+Th17 細胞占CD4+T 細胞的百分比也明顯降低（圖3A，B，（PD+LGG 組均值1.42%）versus（PD 組均值0.67%），**P＜0.01），但SPLs 中的免疫抑制性CD25+Foxp3+Treg 細胞占CD4+T 細胞的百分比在兩組之間的差異不具有統(tǒng)計學意義（圖3C，D，P＞0.05）。

圖3 兩組PD 小鼠的脾臟淋巴細胞（SPLs）內(nèi)IL-17A+Th17 和CD25+Foxp3+Treg 分別占CD4+T 細胞的百分比

3.灌胃LGG 下調(diào)PD 小鼠的血清內(nèi)炎性因子水平：為評估灌胃LGG 對PD 小鼠的整體炎癥水平的影響，采用ELISA 檢測血清中炎性因子的蛋白表達，結(jié)果如圖4 所示，PD+LGG 組相比于PD 組PD小鼠的血清中IL-17A，IL-6，TNF-α，IL-1β 的表達水平顯著下降（圖4A，IL-17A，**P＜0.01；圖4B，IL-6，***P＜0.001；圖4C，TNF-α，**P＜0.01；圖4D，IL-1β，**P＜0.01），表明灌胃益生菌LGG 能夠下調(diào)PD小鼠的全身性炎癥水平，與此前流式細胞術(shù)檢測的SPLs 中促炎性Th17 細胞百分比明顯降低相吻合。

圖4 兩組PD 小鼠的血清內(nèi)炎性因子（IL-17A，IL-6，TNF-α，IL-1β）的蛋白水平

4. 灌胃LGG 下調(diào)PD 小鼠牙齦內(nèi)炎性因子基因：為評估灌胃LGG 對PD 小鼠的牙周局部炎癥水平的影響，采用RT-qPCR 檢測牙齦內(nèi)炎性因子的基因表達，結(jié)果如圖5 所示，PD+LGG 組相比于PD組PD 小鼠的牙齦勻漿內(nèi)IL-17A，IL-6，TNF-α，IL-1β 的表達水平顯著下降（圖5A，Il-17a，**P＜0.01；圖5B，Tnf-α，**P＜0.01；圖5C，Il-6，*P＜0.05；圖5D，Il-1β，*P＜0.05），同時Th17 的轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達也顯著下降，但Treg 的轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 在兩組之間未見統(tǒng)計學差異（圖5E，Rorc，*P＜0.05；圖5F，F(xiàn)oxp3，P＞0.05）。表明灌胃益生菌LGG 能夠下調(diào)PD 小鼠的牙周組織內(nèi)炎癥水平，與此前流式細胞術(shù)檢測的SLCs 中促炎性Th17 細胞百分比明顯降低相吻合。

圖5 兩組牙周炎小鼠的牙齦內(nèi)炎性因子（IL-17A，IL-6，TNF-α，IL-1β）和轉(zhuǎn)錄因子（RORγt，F(xiàn)oxP3）的基因水平

討 論

在本研究中，本課題組采用灌胃的方式將LGG施用于實驗性牙周炎小鼠體內(nèi)，以探究LGG 能否通過腸道免疫系統(tǒng)而影響牙周炎，發(fā)現(xiàn)PD+LGG 組相較于單純PD 組小鼠牙槽骨吸收顯著減緩，并且SLCs 內(nèi)促炎性IL-17A+Th17 細胞的百分比和牙齦組織內(nèi)炎性細胞因子的表達均明顯降低，表明灌胃LGG 減輕PD 局部的炎癥；同時PD+LGG 組小鼠的脾臟淋巴細胞（SPLs）內(nèi)Th17 和血清內(nèi)IL-17A，IL-6，TNF-α 和IL-1β 等因子也明顯減少，說明灌胃LGG 對PD 小鼠的全身性炎癥也具有緩解的作用。

微生物失調(diào)是指疾病相關(guān)微生物群落中物種相對豐富度或群落結(jié)構(gòu)不平衡的狀態(tài)，是多種免疫炎癥性疾病的觸發(fā)因素，包括PD[12]。然而PD 的進展很大程度上取決于微生物和宿主免疫反應(yīng)之間的相互作用，其中CD4+T 細胞及其亞群在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其促炎性CD4+IL-17+Th17 細胞和免疫抑制性CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞之間的免疫平衡被認為是核心機制[13]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)LGG 的全身性應(yīng)用（非口腔局部應(yīng)用）在改善實驗性PD 牙槽骨吸收的同時，下調(diào)SLCs 中的IL-17A+Th17 細胞百分比，但是對CD25+Foxp3+Treg 細胞的百分比未見統(tǒng)計學差異的影響，表明益生菌LGG 能夠經(jīng)由腸道整體的免疫系統(tǒng)實現(xiàn)對PD 局部炎癥的調(diào)控。此前Gatej SM 等人通過口內(nèi)接種P.gingivalis和具核梭桿菌（F.nucleatum）誘導(dǎo)小鼠實驗性PD 同時口腔或者全身應(yīng)用LGG 后發(fā)現(xiàn)無論是何種方式應(yīng)用LGG均能減緩牙槽骨的吸收[14]，這與本實驗結(jié)果相一致。GaoL 等人采用絲線結(jié)扎和接種P.gingivalis的方式構(gòu)建SD 大鼠PD 模型，發(fā)現(xiàn)PD 大鼠的牙齦組織內(nèi)Th17 細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt 和促炎性因子IL-17 的表達均顯著增高，證實PD 炎癥水平與局部Th17 成正相關(guān)[13]。這與本實驗的結(jié)果相一致，即益生菌LGG 下調(diào)Th17 細胞的百分比及其轉(zhuǎn)錄因子和特異性炎性因子而降低PD 的炎癥水平，但是一項隨機對照試驗在評估益生菌LGG SP1 對Ⅲ期B 級牙周炎患者刮治和根面平整的輔助臨床效果時，發(fā)現(xiàn)在1 年觀察期后，SP1 并沒有在附著喪失和牙周袋深度方面表現(xiàn)出具有統(tǒng)計學差異的優(yōu)勢[15]。這與本實驗利用PD 小鼠得到的結(jié)論不一致，分析原因可能在于III 期B 級的牙周炎患者牙周組織破壞程度已處于比較嚴重的階段而且觀察周期1 年可能不是最佳有效時間點，因為在另外一項為期30 天和90 天的臨床試驗中輔助應(yīng)用益生菌乳酸雙歧桿菌治療慢性PD 明顯有益于減緩牙周附著喪失和降低牙周袋深度[16]。

與此同時，本課題組發(fā)現(xiàn)灌胃LGG 也能夠降低PD 小鼠的全身性炎癥水平，體現(xiàn)在PD+LGG 組相較于PD 組SPLs 中Th17 占CD4+T 細胞的百分比明顯降低，且血清中IL-17A，IL-6，TNF-α 和IL-1β 的含量也隨之下降。以上表明LGG 作為腸道益生菌之一，具有抗炎活性，即使經(jīng)過胃腸道消化仍能發(fā)揮腸道免疫調(diào)控作用。此外，也有研究表明LGG 具有調(diào)控抗菌肽、細胞因子和趨化因子的分泌以改善腸道的免疫屏障功能[17]。但是本實驗對比兩組PD 小鼠的下頜下淋巴結(jié)和脾臟淋巴細胞中免疫抑制性CD25+Foxp3+Treg 細胞所占百分比，沒有發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學意義的差異，提示LGG 在介導(dǎo)腸道免疫和全身性炎癥的過程中主要以Th17 細胞為靶點，而非Treg細胞。此外，Th17 細胞在促進PD 牙槽骨破壞過程中發(fā)揮的作用已被充分研究和證實，一方面，Th17表面表達高水平的RANKL，RANKL 與破骨細胞前體細胞表面的RANK 結(jié)合，促進破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化，加速骨吸收[18，19]；另一方面，Th17細胞分泌的炎性因子IL-17 直接增強了破骨細胞形成支持細胞中RANKL 的表達[20]。關(guān)于Treg 細胞在牙周炎局部組織內(nèi)表達增強還是降低仍存爭議，其介導(dǎo)骨代謝免疫的內(nèi)在機制仍不甚清楚[21，22]。

綜上所述，本實驗揭示了LGG 經(jīng)由腸道免疫緩解牙周炎的機制很可能在于下調(diào)牙周局部和全身性促炎型Th17 細胞。鑒于PD 是多種慢性低度炎性疾病如糖尿病、肥胖、心腦血管疾病、代謝綜合征等的重要影響因素，因此有理由相信輔助應(yīng)用益生菌LGG 在有助于治療PD 的同時，對伴有系統(tǒng)性疾病的患者具有一定的整體免疫調(diào)節(jié)功能。