微桿菌XL1左聚糖酶的發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

徐海洋　趙紫琰　陳倩倩　吳丹　張巖　霍東明　徐淋香

摘要：為提高微桿菌XL1左聚糖酶的產(chǎn)量，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)微桿菌XL1的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)左聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)和水解產(chǎn)物進(jìn)行分析。優(yōu)化結(jié)果表明，微桿菌XL1的最佳產(chǎn)酶條件為左聚糖3.4 g/L，酵母粉3.8 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，CaCl2 0.1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgCl2 0.15 g/L，初始pH值6.0，接種量4%，25 ℃、180 r/min培養(yǎng)30 h。在此條件下，微桿菌XL1發(fā)酵液酶活力達(dá)到3.47 U/mL，相比優(yōu)化前提高了298%。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，左聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適反應(yīng)pH為5.5；在40～50 ℃、pH 5.0～7.0時(shí)酶活力較穩(wěn)定；Co2+ 、 Ca2+和Mn2+能顯著提高酶活力；Cu2+ 、 Ni2+ 、 Zn2+和EDTA對(duì)酶有較強(qiáng)的抑制作用；β-巰基乙醇和表面活性劑（Triton X100、Tween 80、SDS）對(duì)酶活力的影響較小。該左聚糖酶對(duì)左聚糖、菊粉和蔗糖均有水解活性，左聚糖和菊粉的最終水解產(chǎn)物為果糖。該左聚糖酶在生產(chǎn)高果糖漿上具有良好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：微桿菌；左聚糖酶；發(fā)酵優(yōu)化；響應(yīng)面；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.25文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2023）06-0007-08

Abstract： In order to improve the yield of Microbacterium sp. XL1 levanase， the fermentation conditions for enzyme production of Microbacterium sp. XL1 are optimized by single factor test and response surface test， and the enzymatic properties and hydrolysates of levanase are analyzed. The optimization results show that the optimal enzyme production conditions of Microbacterium? sp. XL1 are levan 3.4 g/L， yeast powder 3.8 g/L， FeSO4·7H2O 0.01 g/L， CaCl2 0.1 g/L， KH2PO4 1 g/L， MgCl2 0.15 g/L， initial pH value 6.0， inoculation amount 4%， culturing at 25 ℃ and 180 r/min for 30 h. Under these conditions， the enzyme activity of? Microbacterium sp. XL1 fermentation broth reaches 3.47 U/mL， which is 298% higher than that before optimization. Analysis of the enzymatic properties shows that the optimum reaction temperature of levanase is 55 ℃ and the optimum reaction pH is 5.5; enzyme activity is more stable at 40～50 ℃ and pH 5.0～7.0; Co2+， Ca2+ and Mn2+ can significantly? increase the enzyme activity; Cu2+， Ni2+， Zn2+ and EDTA have strong inhibition effect on the enzyme; β-mercaptoethanol and surfactants （Triton X100， Tween 80 and SDS） have little effect on? the enzyme activity.

果聚糖（fructan）是β-D-呋喃果糖的多聚體，是由非還原性末端的蔗糖與多個(gè)果糖殘基組成的水溶性多糖，主要存在于某些被子植物（約15%）和細(xì)菌中[1]。根據(jù)糖苷鍵連接方式的不同，主要分為兩種類(lèi)型：左聚糖和菊粉。左聚糖（levan）主鏈以β-2，6-糖苷鍵連接，主要來(lái)源于細(xì)菌和單子葉植物[2]；菊粉（inulin）主鏈以β-2，1-糖苷鍵連接，在菊芋的塊莖中含量豐富[3]。左聚糖和菊粉為可再生非糧生物質(zhì)資源，在生產(chǎn)高果糖漿、低聚果糖等食品領(lǐng)域具有廣闊的市場(chǎng)[4]。

左聚糖酶（levanase，EC 3.2.1.65），學(xué)名β-2，6-D-果聚糖酶，屬于糖苷水解酶32家族（glycosyl hydrolases family 32）。目前已從多種微生物中分離出左聚糖酶，如鏈霉菌（Streptomyces sp.）[5]、假單胞菌（Pseudomonas）[6]、葡萄糖醋桿菌（Gluconacetobacter）[7]、芽孢桿菌（Bacillus sp.）[8]、紅酵母菌（Rhodotorula sp.）[9]、唾液鏈球菌（S. salivarius）[10]等。研究表明，大多數(shù)左聚糖酶的最適溫度范圍在40～50 ℃，最適pH范圍在5.5～6.5[11]。根據(jù)左聚糖酶作用底物方式的不同，可分為外切型左聚糖酶和內(nèi)切型左聚糖酶兩大類(lèi)。外切型左聚糖酶大多能同時(shí)降解β-2，6-糖苷鍵連接的左聚糖和菊粉的β-2，1-糖苷鍵，從兩種底物中釋放游離果糖，在左聚糖和菊粉商業(yè)化生產(chǎn)超高果糖漿上具有很大潛力[12]。高果糖漿是一種功能性糖類(lèi)水溶液，具有甜味純正、滲透壓高、增強(qiáng)風(fēng)味、吸濕保濕性好等優(yōu)點(diǎn)，在酸奶、碳酸飲料、烘焙食品、冰淇淋和乳制品中被廣泛用作一種重要的甜味劑，同時(shí)在制藥企業(yè)也用于制作注射液和膠囊配方等[13-14]。內(nèi)切左聚糖酶特異性地將左聚糖水解為一系列聚合度在2～10的低聚果糖，低聚果糖是一種功能性多糖，具有眾多益生作用，如改善脂質(zhì)代謝，促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收，降低血脂和抗腫瘤等[15]。

本研究利用單因素法和響應(yīng)面法對(duì)微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和水解產(chǎn)物進(jìn)行了分析，旨在為應(yīng)用于高果糖漿制備所需要的酶來(lái)源提供新途徑，為該左聚糖酶的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 菌種

微桿菌XL1：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

左聚糖：本實(shí)驗(yàn)室分離的微桿菌利用蔗糖合成；菊粉（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；SDS（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母粉和胰蛋白胨（分析純）：英國(guó)Oxoid公司；其他試劑：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，自然pH。

種子培養(yǎng)基：FeSO4·7H2O 0.01 g/L，CaCl2 0.1 g/L，NaNO3 3 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgCl2 0.15 g/L，酵母粉 3 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：FeSO4·7H2O 0.01 g/L，CaCl2 0.1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgCl2 0.15 g/L，左聚糖 1 g/L，酵母粉 3 g/L，pH 7.0。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱、LPR-150生化培養(yǎng)箱 上海博珍儀器設(shè)備制造廠；1379生物安全柜 賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；DK-8D恒溫水浴鍋 常州諾基儀器有限公司；Micro 17R臺(tái)式離心機(jī)、1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

將微桿菌XL1接種到固體培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，活化菌株。再?gòu)墓腆w培養(yǎng)基中挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)16 h。將種子液以4%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)30 h。發(fā)酵液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 酶活力測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定粗酶液的酶活[16]。取150 μL 20 g/L左聚糖溶液（50 mmol/L、pH 5.5的乙酸鈉緩沖液配制），加入50 μL酶液混勻，55 ℃水浴10 min后迅速加入200 μL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5 min顯色，冷卻后吸取200 μL加入酶標(biāo)板中（在相同的條件下，以滅活的粗酶液作為空白對(duì)照）。測(cè)定540 nm處的吸光值，對(duì)照果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖的含量。

酶活力單位定義：在55 ℃、pH 5.5的條件下，每分鐘水解底物生成1 μmol還原糖所需要的酶量，即為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別改變碳源種類(lèi)（左聚糖、菊粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉）、碳源添加量（1，3，5，7，9 g/L）、氮源種類(lèi)（氯化銨、硝酸鈉、尿素、酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨）、氮源添加量（1，2，3，4，5 g/L）、溫度（22，25，28，30，35 ℃）、初始pH值（4.0，5.0，5.5，6.0，7.0，8.0）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、培養(yǎng)時(shí)間（12，18，24，30，36，42 h），考察這些因素對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。以碳源種類(lèi)為第一因素試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)酵培養(yǎng)基中的左聚糖改為1 g/L其他碳源，按照1.3.1中方法制備粗酶液，并按照1.3.2中方法測(cè)定酶活力，以所測(cè)酶活力的最大值為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。后續(xù)因素的試驗(yàn)均在前一因素試驗(yàn)的較優(yōu)結(jié)果上進(jìn)行。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選出對(duì)左聚糖酶產(chǎn)量影響較大的3個(gè)因素，采用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以初始pH值（A）、左聚糖添加量（B）、酵母粉添加量（C）為自變量，以左聚糖酶活力（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 12軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.5 左聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

酶的最適反應(yīng)溫度：將酶液與底物混勻，分別在20～70 ℃的水浴條件下反應(yīng)10 min后，測(cè)定酶活力，以所測(cè)酶活的最大值為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。酶的熱穩(wěn)定性：將酶液在40，50，60 ℃水浴鍋中孵育不同時(shí)間（最長(zhǎng)為3 h），每隔30 min取樣測(cè)酶活，以未加熱孵育處理酶的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

酶的最適反應(yīng)pH：將酶液和底物分別與不同pH值的緩沖液混勻，測(cè)定酶活力，根據(jù)相對(duì)酶活力的大小確定最適反應(yīng)pH。酶的pH穩(wěn)定性：將酶液與不同pH范圍內(nèi)的緩沖液混勻，于30 ℃下放置2 h后，測(cè)定殘余酶活力。不同pH的緩沖液分別為50 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 4.0～5.5），50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 5.5～7.5），50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5～9.0）。

金屬離子及其他化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響：在55 ℃、pH 5.5條件下，向酶反應(yīng)體系中加入不同金屬離子及其他化學(xué)試劑后，測(cè)定酶活力。金屬離子和EDTA的終濃度為5 mmol/L，PMSF的終濃度為1 mmol/L，β-巰基乙醇的終濃度為10 mmol/L，表面活性劑Triton X100、Tween 80和SDS的終濃度為0.1%。以添加同等體積的滅菌去離子水測(cè)定的左聚糖酶活為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活力。

酶反應(yīng)底物專(zhuān)一性測(cè)定：分別以濃度為2%的左聚糖、菊粉、蔗糖、木聚糖、普魯蘭、右旋糖酐為酶反應(yīng)底物，在55 ℃、pH 5.5條件下測(cè)定酶活力。

1.3.6 水解產(chǎn)物薄層層析（TLC）

分別以濃度為0.5%的左聚糖和菊粉為酶反應(yīng)底物，底物與酶的比例為1∶1，在55 ℃、pH 5.5條件下水解12 h，水解產(chǎn)物點(diǎn)樣至硅膠板，層析杠中展開(kāi)后吹干，噴顯色劑。吹干后將硅膠板置于80 ℃烘箱中加熱10 min顯色。所用展開(kāi)劑正丁醇、乙酸、水按照體積比5∶4∶1混合，顯色劑為二苯胺2 g、苯胺2 mL、85%磷酸10 mL、丙酮100 mL混合。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)均平行測(cè)定3次，采用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，根據(jù)3組平行樣的平均方差來(lái)繪制誤差線。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源、氮源及其濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

本試驗(yàn)研究了6種不同碳源對(duì)微桿菌XL1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，見(jiàn)圖1中A。以左聚糖為碳源時(shí)，其酶活力遠(yuǎn)高于其他碳源，說(shuō)明微桿菌XL1通過(guò)底物誘導(dǎo)分泌左聚糖酶，左聚糖酶是一種底物誘導(dǎo)酶。因此，選擇左聚糖作為微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶的最佳碳源。研究顯示，許多多糖水解酶屬于底物誘導(dǎo)酶，目標(biāo)多糖水解酶發(fā)酵的最佳碳源為該酶的底物[17]。由圖1中B可知，左聚糖濃度對(duì)酶產(chǎn)量的影響較顯著，隨著左聚糖濃度的增加，微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，在左聚糖濃度為3 g/L時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)左聚糖濃度高于3 g/L時(shí)，酶的產(chǎn)量開(kāi)始下降，高于5 g/L時(shí)，下降迅速。這種抑制可歸因于黏度增加，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)所需的氧氣難以轉(zhuǎn)移。這與Dahech等[18]用5 g/L以上左聚糖發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)左聚糖酶活性下降迅速的結(jié)果相似。

氮源在微生物核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成中起到重要作用，微生物可利用的氮源可分為有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮。由圖1中C可知，以酵母粉為氮源時(shí)，酶活力提升最顯著，其次是胰蛋白胨和大豆蛋白胨，而以無(wú)機(jī)氮源氯化銨、硝酸鈉、尿素發(fā)酵時(shí)，酶活均極低，說(shuō)明微桿菌XL1更傾向于利用有機(jī)氮源。以酵母粉為氮源，考察其濃度對(duì)微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶的影響。由圖1中D可知，當(dāng)酵母粉濃度為3 g/L時(shí)，菌株發(fā)酵液中左聚糖酶活力最高，繼續(xù)增加酵母粉濃度，酶活力呈下降趨勢(shì)，故酵母粉濃度以3 g/L為最佳。

2.1.2 發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH、接種量及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

由圖2中A可知，微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶活性隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在25 ℃時(shí)酶活力最高，比Dahech等[18]報(bào)道的左聚糖酶最適發(fā)酵溫度低15 ℃。由圖2中B可知，培養(yǎng)基初始pH對(duì)左聚糖酶活力有較大影響，初始pH在4.0～5.5范圍內(nèi)時(shí)，微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶活力呈上升趨勢(shì)；當(dāng)初始pH為5.5時(shí)，左聚糖酶活力最高；當(dāng)初始pH為5.5以上時(shí)，左聚糖酶活力呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明略酸性的環(huán)境利于微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶。由圖2中C可知，接種量對(duì)微桿菌XL1產(chǎn)酶的影響較小，在2%～4%的接種量范圍內(nèi)，增加接種量可以提高左聚糖酶活力，當(dāng)接種量大于4%時(shí)酶活力開(kāi)始下降，可能是初期加入的菌體過(guò)多，造成培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，使其生長(zhǎng)受限，不利于產(chǎn)酶。因此，微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶的最適接種量為4%。由圖2中D可知，微桿菌XL1從發(fā)酵12 h開(kāi)始產(chǎn)酶，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步增加，酶活力不斷上升，于30 h達(dá)到峰值，產(chǎn)酶量最高，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，酶活力下降。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)中對(duì)微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶影響相對(duì)較大的3個(gè)因素：初始pH值、左聚糖添加量、酵母粉添加量對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。以初始pH值（A）、左聚糖添加量（B）、酵母粉添加量（C）3個(gè)因素為自變量，以左聚糖酶活力（Y）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，構(gòu)建的響應(yīng)面回歸模型：Y=3.26+0.607 5A+0.252 5B+0.400 1C+0.237 5AB+0.227 5AC+0.122 5BC-1.14A2-0.939 2B2-0.624 3C2。

由表3可知，模型的P<0.000 1，表明所建立的模型極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)的P值為0.276 5，判定為不顯著（P>0.05），證明模型建立成功。該模型的判定系數(shù)R2 =0.979 7，修正判定系數(shù)RAdj2=0.953 7，表明該模型的擬合程度良好。由P值可知，自變量B對(duì)Y的影響顯著（P<0.05），自變量A、C、A2、B2、C2對(duì)Y的影響極顯著（P<0.01），其余均不顯著（P>0.05）；由F值可知，各因素對(duì)微桿菌XL1產(chǎn)左聚糖酶活力的影響次序?yàn)锳（初始pH值）＞C（酵母粉添加量）＞B（左聚糖添加量）。

各因素間交互作用的三維響應(yīng)面圖見(jiàn)圖3。

通過(guò)Design-Expert 12對(duì)模型優(yōu)化求解，預(yù)測(cè)微桿菌XL1的最佳產(chǎn)酶條件為初始pH值5.99、左聚糖添加量3.40 g/L、酵母粉添加量3.79 g/L，此條件下左聚糖酶活力理論值為3.46 U/mL?？紤]到實(shí)際的操作情況，選取初始pH值6.0、左聚糖添加量3.4 g/L、酵母粉添加量3.8 g/L進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)所得左聚糖酶的平均酶活為（3.47±0.02） U/mL，與預(yù)測(cè)值較接近，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 酶的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

Fig.4 Optimal reaction temperature （A） and temperature stability （B） of levanase

左聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，比Jensen等[19]報(bào)道的B.subtilis所產(chǎn)左聚糖酶的最適溫度高15 ℃。在40～60 ℃范圍內(nèi)，可保持60%以上的相對(duì)酶活力，當(dāng)溫度在60 ℃以上時(shí)，酶活力迅速下降。熱穩(wěn)定性結(jié)果顯示，在40 ℃下溫浴2 h可以保持90%以上活性，60 ℃下溫浴酶活力迅速下降。研究表明，大多數(shù)左聚糖酶在30～50 ℃之間熱穩(wěn)定性較好，高于55 ℃時(shí)熱穩(wěn)定性較差[11]。

2.3.2 酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

左聚糖酶的最適反應(yīng)pH為5.5，在pH 4.5～6.5之間可以保持60%以上的酶活力，與Murakami等[8]報(bào)道的Bacillus sp.所產(chǎn)左聚糖酶的最適pH相似。pH穩(wěn)定性結(jié)果表明，左聚糖酶在pH 5.0～7.0的弱酸條件下高度穩(wěn)定，孵育2 h后殘余酶活力保持在80%以上，其中在50 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）中能保持90%以上的活性。

2.3.3 金屬離子及其他化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

金屬離子終濃度為5 mmol/L時(shí)對(duì)左聚糖酶活力的影響見(jiàn)表4。

Mn2+、Co2+、Ca2+對(duì)左聚糖酶活力有明顯的激活作用，其中Mn2+對(duì)酶活力的提升效果最顯著，其相對(duì)酶活力高達(dá)160.4%，其次是Ca2+和Co2+，而Cu2+、Ni2+、Zn2+對(duì)左聚糖酶活力有較強(qiáng)的抑制作用，Zn2+的抑制效果最明顯。EDTA對(duì)左聚糖酶活力有較強(qiáng)的抑制作用，5 mmol/L濃度下，測(cè)定酶活力為51.2%；蛋白酶抑制劑PMSF對(duì)左聚糖酶活性有部分抑制作用；還原劑β-巰基乙醇對(duì)酶活力的影響較?。槐砻婊钚詣㏕riton X100、Tween 80和SDS對(duì)酶活力基本沒(méi)有影響。

2.3.4 酶的底物專(zhuān)一性

由表5可知，微桿菌XL1產(chǎn)的左聚糖酶可以水解多種含β-呋喃果糖苷鍵的糖，如左聚糖、菊粉和蔗糖，而對(duì)普魯蘭、木聚糖、右旋糖酐均無(wú)酶活。

2.4 水解產(chǎn)物薄層層析

采用薄層層析法分析左聚糖酶水解左聚糖和菊粉的產(chǎn)物，見(jiàn)圖6。左聚糖和菊粉經(jīng)過(guò)與左聚糖酶反應(yīng)12 h，幾乎全部被水解，水解產(chǎn)物中幾乎全部為果糖，表明微桿菌XL1發(fā)酵得到的左聚糖酶能夠從非還原性末端水解左聚糖和菊粉，釋放出果糖。因此，微桿菌XL1左聚糖酶具有應(yīng)用于高果糖漿及結(jié)晶果糖生產(chǎn)的潛力。

圖6 水解產(chǎn)物薄層層析

Fig.6 Thin layer chromatography of hydrolysate

注：1為左聚糖，2為菊粉，3為蔗糖，4為果糖，5為葡萄糖，6為作用于左聚糖的水解產(chǎn)物，7為作用于菊粉的水解產(chǎn)物。

3 結(jié)果與討論

響應(yīng)面分析法（RSM）是一種優(yōu)化生物過(guò)程的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，已被用于多種微生物糖苷水解酶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化中，并取得了顯著效果，包括殼聚糖酶[20]、β-葡聚糖酶、纖維素酶[21]和β-半乳糖苷酶[22]等。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)微桿菌XL1產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳發(fā)酵條件為左聚糖3.4 g/L，酵母粉3.8 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，CaCl2 0.1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgCl2 0.15 g/L，初始pH值 6.0，接種量4%，25 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 h，發(fā)酵液中左聚糖酶活力達(dá)到3.47 U/mL，與初始酶活（0.87 U/mL）相比提高了298%。

通過(guò)對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，得到左聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在50 ℃及以下有較好的熱穩(wěn)定性；最適反應(yīng)pH為5.5，在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)孵育2 h，殘余酶活力保持在80%以上。Co2+、Ca2+、Mn2+對(duì)酶活力有較強(qiáng)激活作用，Cu2+、Ni2+、Zn2+對(duì)酶活力有強(qiáng)烈抑制作用。金屬離子對(duì)不同來(lái)源的左聚糖酶活力的影響各有不同，如Mn2+和Mg2+對(duì)Streptomyces sp. 7-3來(lái)源的左聚糖酶活力有一定促進(jìn)作用[5]，而對(duì)Pseudomonas sp. 43來(lái)源的左聚糖酶活力有強(qiáng)烈抑制作用[23]。EDTA對(duì)酶有較強(qiáng)的抑制作用，說(shuō)明該左聚糖酶的活性中心需要金屬離子的螯合，這與Chaudhary等[9]的研究結(jié)果相似。表面活性劑對(duì)酶活力幾乎無(wú)影響，因此可在洗滌劑中添加該酶，增強(qiáng)洗滌效果。

高果糖漿（high fructose syrup）是一種可替代蔗糖的甜味劑，廣泛應(yīng)用于食品及飲料行業(yè)，具有廣闊的市場(chǎng)需求。目前國(guó)內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)高果糖漿主要是以淀粉為原料，需用α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖異構(gòu)酶催化多步反應(yīng)生成，但該方法成本高、制備繁瑣、得率低[24]。微桿菌XL1左聚糖酶水解左聚糖和菊粉的最終產(chǎn)物幾乎全部為果糖，因此利用左聚糖酶一步反應(yīng)即可生產(chǎn)高純度的果糖，具有很高的商業(yè)價(jià)值。今后的研究將致力于粗酶的分離純化，以及挖掘產(chǎn)酶基因并通過(guò)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)左聚糖酶的高效表達(dá)，為左聚糖酶制劑的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)以及高果糖漿的開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陸璐，陶雅軍，羅學(xué)婭，等.糖苷水解酶32家族結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2019，38（8）：14-19.

[2]吳昕雨，嚴(yán)琳，伍紅.谷氨酸棒狀桿菌全細(xì)胞催化合成Levan果聚糖條件優(yōu)化分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2020，47（11）：3474-3483.

[3]周東，隋丹，于濤，等.鹽堿土壤對(duì)菊芋菊糖含量的影響[J].中國(guó)調(diào)味品，2014，39（3）：5-9.

[4]WANG X， YU S， ZHANG T， et al. From fructans to difructose dianhydrides[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99：175-188.

[5]MURAKAMI H， MUROI H， KURAMOTO T， et al. Purification and some properties of a levanase from Streptomyces sp. No.7-3[J].Agricultural and Biological Chemistry，1990，54（9）：2247-2255.

[6]KANG S K， LEE S O， LIM Y S， et al. Purification and characterization of a novel levanoctaose-producing levanase from Pseudomonas strain K-52[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，1998，27（2）：159-166.

[7]MENNDEZ C， HERNNDEZ L， SELMAN G， et al. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of an exo-levanase gene from the endophytic bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus SRT4[J].Current Microbiology，2002，45（1）：5-12.

[8]MURAKAMI H， KURAMOTO T， MIZUTANI K， et al. Purification and some properties of a new levanase from Bacillus sp. No.71[J].Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry，1992，56（4）：608-613.

[9]CHAUDHARY A， GUPTA L K， GUPTA J K， et al. Purification and properties of levanase from Rhodotorula sp.[J].Journal of Biotechnology，1996，46（1）：55-61.

[10]TAKAHASHI N， MIZUNO F， TAKAMORI K. Isolation and properties of levanase from Streptococcus salivarius KTA-19[J].Infection and Immunity，1983，42（1）：231-236.

[11]ZHANG W， XU W， NI D， et al. An overview of levan-degrading enzyme from microbes[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2019，103（19）：7891-7902.

[12]MENNDEZ C， HERNNDEZ L， BANGUELA A， et al.Functional production and secretion of the Gluconacetobacter diazotrophicus fructose-releasing exo-levanase （LsdB） in Pichia pastoris[J].Enzyme and Microbial Technology，2004，34（5）：446-452.

[13]馬俊，安啟坤，唐文竹.菊粉外切酶的異源表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（4）：25-30.

[14]李凱，朱中燕，潘莉莉，等.原糖水解生產(chǎn)果葡糖漿的工藝優(yōu)化[J].中國(guó)調(diào)味品，2019，44（5）：149-153.

[15]MAGRI A， OLIVEIRA M R， BALDO C， et al. Production of fructooligosaccharides by Bacillus subtilis natto CCT7712 and their antiproliferative potential[J].Journal of Applied Microbiology，2020，128（5）：1414-1426.

[16]PORRAS-DOMNGUEZ J R， VILA-FERNNDEZ ， RODRGUEZ-ALEGRA M E， et al. Levan-type FOS production using a Bacillus licheniformis endolevanase[J].Process Biochemistry，2014，49（5）：783-790.

[17]程瑞.索拉膠降解菌產(chǎn)葡聚糖酶的研究[D].南京：南京理工大學(xué)，2014.

[18]DAHECH I， AYED H B， BELGHITH K S， et al. Microbial production of levanase for specific hydrolysis of levan[J].International Journal of Biological Macromolecules，2013，60：128-133.

[19]JENSEN S L， DIEMER M B， LUNDMARK M， et al .Levanase from Bacillus subtilis hydrolyses β-2，6 fructosyl bonds in bacterial levans and in grass fructans[J].International Journal of Biological Macromolecules，2016，85：514-521.

[20]盧波斯，崔丹丹，李志明，等.高效產(chǎn)殼聚糖酶海洋菌株Mitsuaria sp. SH-50的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].中國(guó)調(diào)味品，2022，47（7）：1-9.

[21]文曉霞，李豪，魏溱，等.Cladosporium sp. AY-42固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化[J].中國(guó)調(diào)味品，2020，45（11）：23-28，33.

[22]黃倩，李潔，鄭曉春，等.奶酪中高產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].中國(guó)調(diào)味品，2021，46（2）：23-30.

[23]JUNG K， LEE S， LEE J， et al. Purification and characterization of a levanbiose-producing levanase from Pseudomonas sp. No. 43[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，1999，29（3）：263-268.

[24]戴晨霞，曹慧方，羅會(huì)穎，等.來(lái)源于Alicyclobacillus sp. A4葡萄糖異構(gòu)酶的克隆表達(dá)及轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2018，34（11）：144-151.