杭州地區(qū)草地貪夜蛾田間動(dòng)態(tài)分析與生物型鑒定

王國迪,馮行利,吳濤起,汪彥欣,吳慧明,饒 瓊,張莉麗,*

(1.杭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,浙江 杭州 310020; 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)試驗(yàn)室,浙江 杭州 311300; 3.金華市恒安生物技術(shù)有限公司,浙江 金華 321000)

草地貪夜蛾[Spodopterafrugiperda(J.E.Smith)]屬鱗翅目,夜蛾科,原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)[1],是近年來入侵我國的重要農(nóng)業(yè)害蟲。自2019年首次在云南被報(bào)道以來,便迅速在多個(gè)省市暴發(fā),給各地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大威脅[2]。草地貪夜蛾具有遷飛能力強(qiáng)、寄主范圍寬、適生區(qū)廣、增殖潛能強(qiáng)、擴(kuò)散速度快、突發(fā)危害重等顯著生物學(xué)特點(diǎn)[3-7],浙江省是草地貪夜蛾南北往返遷飛的橋梁地帶,防控地位非常重要。按照對寄主植物取食的偏好性,可將草地貪夜蛾分為“玉米型”和“水稻型”兩種生物型,根據(jù)張磊等[3]分析表明,入侵我國的草地貪夜蛾可能是玉米型父本和水稻型母本雜交后所產(chǎn)生的一種特殊的玉米品系,主要取食危害玉米。

對草地貪夜蛾發(fā)生分布、生物型鑒定及危害動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)測分析,可以更加高效地實(shí)施預(yù)測預(yù)報(bào)以及為有效防控草地貪夜蛾提供重要依據(jù)。本研究于2019年5月在杭州不同玉米種植區(qū)設(shè)置草地貪夜蛾誘捕器,連續(xù)3 a對杭州草地貪夜蛾發(fā)生動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)測,并通過分子生物學(xué)方法對其生物型進(jìn)行鑒定,為開展該蟲區(qū)域性預(yù)警和防控提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

動(dòng)物基因DNA快速抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]、臺式高速低溫離心機(jī)(Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R)、電泳儀(DYY-11,北京市六一儀器廠)、生物電泳圖像分析系統(tǒng)(FR-980A,復(fù)日科技)、PCR 儀(T100TMThermal Cycler,BIO-RAD)、電子分析天平(Mettler Toledo,AL-204)、桶型誘捕器和草地貪夜蛾監(jiān)測性誘芯(深圳百樂寶生物農(nóng)業(yè)科技有限公司)。

1.2 田間動(dòng)態(tài)性誘監(jiān)測

2019—2021年在杭州市淳安縣、建德市、錢塘區(qū)、蕭山區(qū)、富陽區(qū)、臨安區(qū)等玉米種植區(qū)設(shè)置草地貪夜蛾性誘劑誘捕監(jiān)測點(diǎn)。玉米種植區(qū)均進(jìn)行春秋兩季種植,春玉米3月下旬到4月上旬播種,6月下旬到7月中旬收獲;秋玉米7月下旬到8月上旬播種,10月中旬到11月上旬收獲。每個(gè)監(jiān)測點(diǎn)設(shè)3個(gè)誘捕器,每個(gè)誘捕器間隔100 m以上,誘芯距地面1.2 m,每月更換1次。自2019年5月份開始檢查并記錄誘捕到的雄成蟲數(shù),將記錄的數(shù)據(jù)按7 d進(jìn)行匯總分析。

1.3 生物型分子鑒定

收集杭州不同玉米種植區(qū)草地貪夜蛾幼蟲樣品,采用動(dòng)物基因DNA快速抽提試劑盒提取單頭草地貪夜蛾DNA,參考張磊等[3]PCR擴(kuò)增方法,分別選用COI和Tpi基因特異引物對草地貪夜蛾DNA進(jìn)行擴(kuò)增[11]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,條帶大小正常的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 取食選擇試驗(yàn)

將草地貪夜蛾置于養(yǎng)蟲室繼代飼養(yǎng),養(yǎng)蟲室溫度為(28±1)℃,濕度為70%±5%,光周期L∶D=16 h∶8 h。將生長健壯的苗期玉米葉片和水稻葉片各稱取5 g,在干凈的長方形養(yǎng)蟲盒(10.5 cm×7.5 cm)一端放入水稻葉片,另一端放入玉米葉片,放置時(shí)葉面朝上,選擇子代4齡幼蟲作為試驗(yàn)對象,設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)供試?yán)ハx各30頭,饑餓處理8 h后用毛筆將其輕輕挑入長方形飼養(yǎng)盒中,使其與水稻葉片及玉米葉片距離相等進(jìn)行寄主選擇試驗(yàn)。將養(yǎng)蟲盒放入養(yǎng)蟲室內(nèi)用黑布遮光處理,避免幼蟲受光照影響,飼養(yǎng)環(huán)境同上。12 h后記錄選擇取食玉米葉片或水稻葉片的幼蟲數(shù),計(jì)算比例。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel記錄整理每7 d誘捕草地貪夜蛾數(shù)據(jù),通過GraphPad Prism 8.3.0對監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析繪制熱圖;在NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)基因序列,使用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;取食選擇性數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杭州地區(qū)草地貪夜蛾發(fā)生動(dòng)態(tài)

2019—2021年誘捕器田間誘捕監(jiān)測結(jié)果如圖1所示。2019年5月在建德市、淳安縣、錢塘區(qū)等地已監(jiān)測到草地貪夜蛾(圖1-A),春季玉米種植期,草地貪夜蛾主要發(fā)生在玉米苗期,除臨安區(qū)外,其余地區(qū)均有發(fā)生,其中錢塘區(qū)Q3監(jiān)測點(diǎn)在春季整個(gè)種植期內(nèi)均發(fā)生較重;秋季玉米種植期,各監(jiān)測點(diǎn)發(fā)生情況較上半年有加重趨勢,且在玉米每個(gè)生長節(jié)點(diǎn)內(nèi)均有發(fā)生,淳安C1、建德J1和錢塘Q1、Q2監(jiān)測點(diǎn)發(fā)生最重,淳安C2和C3監(jiān)測點(diǎn)發(fā)生較輕,其中建德市和錢塘區(qū)平均每個(gè)誘捕器內(nèi)每7 d的雄蟲數(shù)達(dá)100頭以上,嚴(yán)重時(shí)最多有388頭。

圖1 2019—2021年杭州地區(qū)草地貪夜蛾田間誘捕量熱圖(單位:頭/誘捕器)Fig.1 Dynamics of trapped S. frugiperda in the field in Hangzhou from 2019 to 2021 (Unit: male moths/trap)

2020年種植期開始,在淳安縣、蕭山區(qū)、錢塘區(qū)和富陽區(qū)增加設(shè)置了更多監(jiān)測點(diǎn)。通過圖1-B分析,在上半年的春玉米種植期內(nèi),草地貪夜蛾發(fā)生較為零散,總體為害較輕,在蕭山區(qū)X4和臨安區(qū)L1監(jiān)測點(diǎn)的玉米收獲期發(fā)生較為嚴(yán)重。秋玉米種植期內(nèi)各地草地貪夜蛾發(fā)生加重,主要發(fā)生在淳安縣、建德市、錢塘區(qū)和蕭山區(qū),其中錢塘區(qū)Q1、Q2和蕭山區(qū)X6監(jiān)測點(diǎn)發(fā)生最為嚴(yán)重,平均每個(gè)誘捕器內(nèi)每7 d最多能達(dá)到174頭。錢塘區(qū)Q5、Q6和富陽區(qū)F3全年未監(jiān)測到草地貪夜蛾發(fā)生。

2021年草地貪夜蛾發(fā)生情況顯著降低,如圖1-C所示,上半年主要發(fā)生于錢塘區(qū)和蕭山區(qū),蕭山區(qū)X9監(jiān)測點(diǎn)發(fā)生最嚴(yán)重,平均每個(gè)誘捕器內(nèi)每7 d最多有27頭,其他種植地發(fā)生較輕。下半年集中發(fā)生在淳安地區(qū),錢塘區(qū)Q1監(jiān)測點(diǎn)發(fā)生最嚴(yán)重,平均每個(gè)誘捕器內(nèi)每7 d雄蟲數(shù)達(dá)29頭。錢塘區(qū)Q4、Q5、Q6,蕭山區(qū)X8,富陽區(qū)F1,F3和臨安區(qū)L1在2021年內(nèi)未監(jiān)測到草地貪夜蛾發(fā)生。

2.2 草地貪夜蛾生物型鑒定

凝膠電泳結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小正確,COI基因擴(kuò)增產(chǎn)物約為750 bp,Tpi基因擴(kuò)增產(chǎn)物約為450 bp,且無拖帶和雜帶等現(xiàn)象。測序得到的COI基因序列結(jié)果,比對所有樣品基因序列完全一致。根據(jù)本研究所得到的COI基因序列、NCBI數(shù)據(jù)庫中下載草地貪夜蛾水稻型與玉米型4條基因序列和Spodoptera屬近源物種序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖2所示,家蠶作為外群物種單獨(dú)作為一類與其他物種明顯區(qū)分開,草地貪夜蛾與其他Spodoptera屬的物種明顯區(qū)分開,兩種生物型又分為水稻型和玉米型2個(gè)分支,其中本試驗(yàn)樣品HZ-Strain1與水稻型單獨(dú)聚為一支,而HZ-Strain2與玉米型聚為一支。COI基因序列分析結(jié)果表明,本研究所測杭州地區(qū)草地貪夜蛾COI基因序列相對于玉米型而言,與水稻型的親緣關(guān)系更近。

RS為水稻型、CS為玉米型、HZ strain1和HZ strain2為本試驗(yàn)種群、Bombyx mori為外群。RS is a rice type, CS is a maize type, HZ strain1 and HZ strain2 are the experimental populations, and Bombyx mori is the outgroup.圖2 基于COI基因序列的草地貪夜蛾系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of S. frugiperda based on COI gene sequences

為進(jìn)一步明確其生物型,結(jié)合Tpi基因片段的分子標(biāo)記,將本試驗(yàn)種群測定的Tpi基因序列與兩種生物型相對應(yīng)的Tpi基因序列進(jìn)行單倍型位點(diǎn)比對分析。結(jié)果顯示,“水稻型”和 “玉米型”的基因序列差異位點(diǎn)比對中,通過Tpi基因分子標(biāo)記分析,本試驗(yàn)所測的草地貪夜蛾的Tpi基因序列(HZ-Strain1)與玉米型的親緣關(guān)系更近,而僅在蕭山監(jiān)測點(diǎn)發(fā)現(xiàn)有2個(gè)草地貪夜蛾樣品的Tpi基因序列(HZ-Strain2)為玉米型和水稻型的雜合型(圖3)。

圖中HZ-Strain1和HZ-Strain2為本試驗(yàn)樣本;紅色為玉米型和水稻型基因差異位點(diǎn)。HZ-Strain1 and HZ-Strain2 in the figure are samples for this experiment; The red arrow indicates the genetic differences between maize and rice types.圖3 基于Tpi基因片段單倍型位點(diǎn)比較Fig.3 Haplotype loci analysis based on Tpi gene fragments

圖中數(shù)據(jù)是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;**代表兩者差異性顯著。The data in the figure is the average ± standard error. ** represents significant differences between the two. 圖4 草地貪夜蛾幼蟲對兩種寄主植物的取食選擇Fig.4 Feeding rate of Spodoptera frugiperda on two host plants

2.3 草地貪夜蛾對不同寄主植物取食選擇性

取食選擇試驗(yàn)結(jié)果顯示,草地貪夜蛾4齡幼蟲對玉米和水稻兩種寄主植物的取食選擇比例分別為70.00%±8.82%、26.67%±8.81%,選擇取食玉米葉片的幼蟲顯著高于取食水稻葉片的幼蟲(P<0.05)(圖4)。

3 討論

草地貪夜蛾玉米型和水稻型兩種生物型對寄主植物的選擇并不是單一的,只是在選擇寄主時(shí)具有一定的偏好性[12]。本研究通過COI基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)種群所測得的COI基因經(jīng)序列聚類分析發(fā)現(xiàn)與水稻型的親緣關(guān)系更近,而Tpi基因多序列位點(diǎn)比對分析和寄主選擇性試驗(yàn)結(jié)果均表明其更符合玉米型特征。Dumas等[13]認(rèn)為,可能與COI基因位于線粒體基因組的母系遺傳特征有關(guān),來自水稻型的草地貪夜蛾母本和來自玉米型的父本在田間進(jìn)行雜交繁殖,后代經(jīng)母系遺傳獲得草地貪夜蛾水稻型的線粒體COI基因序列,本試驗(yàn)種群極可能為水稻型母本和玉米型父本雜交后的后代演變而來。因此,保留了母本COI基因和父本Tpi基因的遺傳特征。

草地貪夜蛾在當(dāng)?shù)氐陌l(fā)生情況與其遷飛數(shù)量、當(dāng)?shù)貧夂?、自然環(huán)境及防治方法等因素密切相關(guān),也有相關(guān)報(bào)道表示草地貪夜蛾的發(fā)生情況與當(dāng)?shù)氐挠衩追N植情況密切相關(guān)[14],郭歡樂等[15]發(fā)現(xiàn),相比春玉米草地貪夜蛾會(huì)更喜歡取食秋玉米,有人利用性誘劑誘芯監(jiān)測草地貪夜蛾發(fā)現(xiàn),草地貪夜蛾的發(fā)生量與玉米生長發(fā)育時(shí)期呈顯著負(fù)相關(guān),其中在玉米苗期和拔節(jié)期誘捕到的成蟲最多[14]。其中溫度是影響草地貪夜蛾分布的主要因素[16-17],姜玉英等[18]提出了南方春玉米的種植對草地貪夜蛾起到誘集作用,可減緩或者減輕其北遷的時(shí)間和蟲量,而浙江省作為草地貪夜蛾入侵的重要過渡地區(qū),更應(yīng)重視其玉米的種植區(qū)域的合理分布,并加強(qiáng)草地貪夜蛾監(jiān)測預(yù)報(bào)。

溫度影響著草地貪夜蛾生長發(fā)育和遷飛等一系列的活動(dòng)[14,16],很多研究表明,高溫會(huì)縮短草地貪夜的生命周期,魯智慧等[17]研究發(fā)現(xiàn),草地貪夜蛾的幼蟲期、蛹期及世代歷期都隨著溫度的升高而縮短,草地貪夜蛾在適宜溫度完成一世代需30 d左右[19],而在37 ℃時(shí)完成一個(gè)世代僅需要(22.57±0.84) d。草地貪夜蛾自2019年入侵浙江后在一年內(nèi)暴增,同時(shí)迅速在各個(gè)區(qū)域擴(kuò)散。從時(shí)間上看,杭州地區(qū)草地貪夜蛾5—12月份都有發(fā)生,但其中8—11月份是為害高峰,這可能與杭州秋熟玉米的種植有關(guān)。因在田間性誘劑所誘集到的都是成蟲,而草地貪夜蛾主要是以幼蟲取食玉米葉片危害[20],所以建議在8月份誘集高峰期之前7月初展開藥劑防控,可有效防治草地貪夜蛾的發(fā)生危害并有效控制后代種群數(shù)量。綜合來看,杭州地區(qū)草地貪夜蛾在2019年大發(fā)生之后呈一個(gè)逐年下降的趨勢。杭州草地貪夜蛾最早在2019年于淳安縣、建德市、錢塘區(qū)等地首次發(fā)現(xiàn),目前已在蕭山區(qū)、富陽區(qū)和臨安區(qū)等地均有為害。草地貪夜蛾發(fā)生集中在秋玉米種植期,其中錢塘區(qū)和蕭山區(qū)發(fā)生最嚴(yán)重,臨安區(qū)和富陽區(qū)發(fā)生較輕,其中蕭山區(qū)各監(jiān)測點(diǎn)經(jīng)防控后,在2021年下半年草地貪夜蛾零星發(fā)生。從發(fā)生時(shí)間來看,各種植地區(qū)監(jiān)測到草地貪夜蛾的時(shí)間不同年份有一定差異,Q1監(jiān)測點(diǎn)在2019年9—10月誘捕到大量雄蟲,而在2021年提前至7—8月發(fā)生,因此需要提前采用防治措施。綜合近3 a發(fā)生情況,草地貪夜蛾種群數(shù)量不斷降低,2019年發(fā)生最嚴(yán)重,但因其具有較強(qiáng)的遷飛能力,從淳安縣、建德市和錢塘區(qū)發(fā)生最嚴(yán)重的地區(qū)向其他種植地區(qū)擴(kuò)散,同時(shí)5月份發(fā)生的草地貪夜蛾可能來自外來遷入蟲源。