雞DDX41基因克隆表達、細胞定位及其在禽腺病毒4型感染調(diào)控天然免疫中的作用

劉 琪,曹影麗,魏寧波,楊侃侃,梁月巧,宋祥軍,邵 穎,涂 健,祁克宗

(獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室,安徽省動物性食品質(zhì)量與生物安全工程實驗室,安徽 合肥 230036)

天然免疫系統(tǒng)是機體抵抗病原體感染的第一道防線,病原體入侵宿主細胞后其病原相關分子模式(PAMPs)會被模式識別受體(PRRs)識別并活化,引起機體發(fā)生先天免疫應答產(chǎn)生干擾素(IFN)、干擾素誘導基因與炎癥因子,從而抑制病毒復制,發(fā)揮抗病毒的天然免疫功能[1-3]。Zhang等[4]在2011年首次證實DDX41作為一種DNA感受器識別DNA病毒激發(fā)天然免疫。DDX41是胞質(zhì)內(nèi)含DEXDc框的RNA解旋酶家族成員蛋白,僅由1個DEXDc、1個HELICc(carboxy-terminal helicase)和1個Zn F-C2HC(Zinc finger-Cys Cys His Cys)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[5-7]。DDX41基因編碼的蛋白質(zhì)在不同物種基因組中高度保守且廣泛分布在各組織系統(tǒng)中。另有研究表明,DDX41基因在魚類、鼠、豬和鴨中均表現(xiàn)出DNA感受器的功能,可以激發(fā)天然免疫、產(chǎn)生Ⅰ型干擾素,抵抗病毒感染[8-11]。

2017年Cheng等[12]首次克隆chDDX41基因,并通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、shRNA、poly(I:C)與poly(dA:dT)刺激等實驗證明chDDX41是雞體內(nèi)一種重要的DNA感受器,通過qRT-PCR、免疫共沉淀(CO-IP)等進一步證明了chDDX41與chSTING有很強的相互作用,參與DNA病毒介導的chDDX41-chSTING-IFN-β的天然免疫通路。禽腺病毒4型(FAdV-4)是屬于腺病毒科腺病毒屬一種無囊膜的雙股DNA病毒,是引起心包積液、出血性肝炎和肌胃糜爛等癥狀的主要病原體[13-16]。FAdV-4作為一種DNA病毒是否會引起chDDX41介導的天然免疫機制目前尚未見報道。

本研究通過克隆chDDX41基因,構(gòu)建pET-32a-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41、pCMV-3×Flag-chDDX41、pmCherry-chDDX41重組表達質(zhì)粒,利用原核表達系統(tǒng)對pET-32a-chDDX41重組蛋白進行表達純化;利用激光共聚焦技術探究chDDX41蛋白在雞肝癌細胞(LMH)、雞巨噬細胞(HD11)中的亞細胞定位;在mRNA水平上探索chDDX41是否會誘導細胞因子的表達進而影響FAdV-4的復制,為進一步研究chDDX41在免疫調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞與質(zhì)粒

FAdV-4 AH-F19株,LMH和HD11細胞,pET-32a、pCMV-3×Flag-N、pCAGGS-HA和pmCherry-C1空載質(zhì)粒均由安徽農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室登記保存;大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5a、BL21(DE3)均購買于吐露港生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

2×TaqMaster Mix(DYE Plus)、ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Lipo8000TM、Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑均購自上海碧云天生物技術有限公司;EcoRⅠ、KnpⅠ、HindⅢ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶均購自寶日醫(yī)生物技術有限公司;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、ECL顯色液均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;普通質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自簡石生物;蛋白純化試劑盒購自康為世紀生物科技股份有限公司;6×His Tag Mouse MCAb購自Proteintech Group, Inc.;Anti-DYKDDDDK-Tag Antibody AF594購自艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司;HA-Tag、Rabbit pAb兔抗HA-Tag多克隆抗體、Flag-Tag(DYKDDDDK)Rabbit pAb購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;Goat anti Mouse IgG、Goat anti Rabbit IgG購自成都正能生物科技有限責任公司。

1.3 chDDX41基因引物設計與克隆

按照GenBank中登錄號為NM_001349708.2的chDDX41基因序列設計1對特異性引物chDDX41-F/chDDX41-R。引物序列見表1。引物均在通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。按照SPARKeasy細胞RNA快速提取試劑盒說明書提取LMH細胞總RNA,并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為RT-PCR的模板,用chDDX41-F/chDDX41-R特異性引物進行PCR擴增,PCR擴增體系:2×TaqMaster Mix(DYE Plus) 10 μL、上游引物(10 mmol·L-1)1 μL、下游引物(10 mmol·L-1)1 μL、DNA模板1 μL,用ddH2O補至20 μL。反應程序:95℃ 3min;95 ℃ 15s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 60s,30～35個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR原液送至南京擎科生物科技有限公司進行測序。

表1 PCR擴增的特異性引物Table 1 Specific primers for PCR

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用CE Design軟件設計chDDX41基因的同源臂引物,引物依次命名為pET-32a-chDDX41-F/R、pCAGGS-HA-chDDX41-F/R、pCMV-3Flag-chDDX41-F/R、pmCherry-chDDX41-F/R,引物具體序列見表1。以凝膠純化產(chǎn)物為模板,用同源臂引物進行擴增純化后分別與酶切的pET-32a、pCAGGS-HA、pCMV-3×Flag-N和pmCherry-C1空載質(zhì)粒進行同源重組。酶連產(chǎn)物立即轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5a中過夜培養(yǎng)。挑選單菌落擴大培養(yǎng)后進行菌液PCR驗證,將陽性菌液送至南京擎科生物科技有限公司進行測序,獲得含有目的片段的陽性重組子依次命名為pET-32a-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41、pCMV-3×Flag-chDDX41、pmCherry-chDDX41。

1.5 pET-32a-chDDX41重組蛋白的表達、純化與可溶性分析

分別將測序結(jié)果正確的pET-32a(+)-chDDX41重組質(zhì)粒和pET-32a(+)空載體劃轉(zhuǎn)到大腸埃希菌BL21(DE3)中過夜培養(yǎng),挑取陽性菌株分別轉(zhuǎn)入含氨芐青霉素(100 μg·mL-1)的LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)到吸光度D600為0.4～0.6。加入IPTG進行誘導表達。誘導結(jié)束后低溫高速離心收集菌體,用提前預冷的PBS重懸菌體,重復上述步驟3次。按照1:10加入PBS重懸處理好的菌體,用超聲波破碎儀破碎。菌液破碎至透明后4 ℃ 10 000×g離心30 min,分別取上清液與包涵體進行SDS-PAGE驗證并分析目的蛋白質(zhì)的可溶性。使用CWBIO蛋白純化試劑盒純化上述離心后的上清液,純化后的產(chǎn)物用SDS-PAGE凝膠電泳驗證。

1.6 pET-32a-chDDX41重組蛋白Western blot鑒定

pET-32a-chDDX41重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%脫脂奶粉在37 ℃培養(yǎng)箱中封閉5 h,封閉結(jié)束后用PBST洗3次。將6×His Tag Mouse MCAb按照1∶8 000稀釋作為一抗,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h,一抗孵育結(jié)束后用PBST洗3次。再將Goat anti Mouse IgG按照1∶5 000稀釋作為二抗,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,二抗孵育結(jié)束后用PBST洗3次。配制ECL顯色液避光顯色。

1.7 chDDX41細胞定位

將處于對數(shù)生長期的LMH和HD11細胞分裝至鋪有爬片的12孔細胞板中,待細胞密度達到85%～90%時分別將pCMV-3×Flag-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41和pmCherry-chDDX41真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至LMH和HD11細胞中,轉(zhuǎn)染24 h后進行IFA(間接免疫熒光)。IFA結(jié)束后,加入含有封片劑的DAPI染色液進行染色,室溫孵育5 min即制片結(jié)束。轉(zhuǎn)染pmCherry-chDDX41重組質(zhì)粒的細胞僅進行固定、通透、封閉和DAPI染色即可。制片結(jié)束后用激光共聚焦顯微鏡觀察chDDX41蛋白在LMH和HD11中的亞細胞定位。

1.8 siRNA轉(zhuǎn)染LMH細胞

將處于對數(shù)生長期且狀態(tài)佳的LMH細胞分裝至6孔細胞板中,待細胞密度達到90%～100%時將pCMV-3×Flag-chSTING真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至LMH細胞中,24 h后將由南京擎科生物科技有限公司合成的3對靶向chSTING基因的siRNA轉(zhuǎn)染至LMH細胞中,通過Western blot結(jié)合灰度分析篩選最佳siRNA。隨后用FAdV-4感染同時過表達chDDX41和用siRNA敲低chSTING的LMH細胞,通過Western blot在蛋白質(zhì)水平分析chDDX41對FAdV-4復制的影響。

1.9 qRT-PCR

將pCMV-3×Flag-chDDX41與pCMV-3×Flag-N空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到LMH細胞中,用FAdV-4感染。以感染16 h后提取的LMH細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板,按照試劑說明書進行qRT-PCR實驗,以β-actin為內(nèi)參,利用2-ΔΔCT法計算感染FAdV-4后LMH細胞中IFN-β、IL-6、IL-8、IL-1β、MX-1、MYD88、IRF7、TBK1、MDA5、NF-κB和PKR在轉(zhuǎn)錄水平的變化。引物序列見表1。

1.10 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計和分析,組間比較采用方差分析,設置檢驗水準為0.05,可視化使用GraphPad Prism 8軟件。本研究所有實驗均重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 chDDX41基因克隆

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,用凝膠成像儀觀察可見1條約1 854 bp的特異性條帶(圖1),切膠純化后送至南京擎科生物科技有限公司進行測序,結(jié)果與預期一致,無基因突變。

M,DL2000 marker;1,chDDX41基因PCR產(chǎn)物;2,陰性對照。M, DL2000 marker; 1, PCR product of chDDX41 gene; 2, Negative control.圖1 chDDX41基因擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of chDDX41gene

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

使用限制性內(nèi)切酶雙酶切重組質(zhì)粒pET-32a-chDDX41、pmCherry-chDDX41、pCMV-3×Flag-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,依次出現(xiàn)pET-32a、pmCherry-C1、pCMV-3×Flag和pCAGGS-HA空載體條帶和大小約1 854 bp的chDDX41基因條帶(圖2),表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,并將重組質(zhì)粒送至南京擎科生物科技有限公司進行測序,結(jié)果與預期一致,無基因突變。

M,DNA marker(A,1 kb plus DNA ladder;B-C,DL5000)。1,pET-32a(+)-chDDX41重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物;2,pmCherry-chDDX41重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物;3,pCMV-3×Flag-chDDX41重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物;4,pCAGGS-HA-chDDX41重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。M:DNA marker(A, 1 kb plus DNA ladder; B-C, DL5000). 1, pET-32a(+)-chDDX41 recombinant plasmid digested product; 2, pmCherry-chDDX41 recombinant plasmid digested product; 3, pCMV-3×Flag-chDDX41 recombinant plasmid digested product; 4, pCAGGS-HA-chDDX41 recombinant plasmid digested product.圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant plasmids

2.3 重組蛋白的表達與可溶性分析

pET-32a-chDDX41重組蛋白在15 ℃、IPTG終濃度為0.5 mmol·L-1條件誘導表達19 h,收集菌體并經(jīng)SDS-PAGE驗證,在90 ku左右出現(xiàn)明顯條帶并且在上清和包涵體中均有表達(圖3),說明重組蛋白具有可溶性,與預期結(jié)果一致。

M,10～250 ku marker;1～2, 15 ℃ pET-32a空載體未誘導、誘導產(chǎn)物;3～4, 15 ℃ pET-32a-chDDX41重組蛋白未誘導、誘導產(chǎn)物;5～6, 15 ℃誘導19 h pET-32a-chDDX41重組蛋白的包涵體、上清液。M, 10-250 ku marker; 1-2, Not induced and induction products of pET-32a empty vector at 15 ℃; 3-4, Not induced and induction products of pET-32a-chDDX41 recombinant protein at 15 ℃; 5-6, Induction of inclusion bodies and supernatants of pET-32a-chDDX41 recombinant protein at15 ℃for 19 h.圖3 pET-32a-chDDX41重組蛋白SDS-PAGE驗證結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE verification of pET-32a-chDDX41 protein

2.4 pET-32a-chDDX41重組蛋白的純化

使用試劑盒對重組蛋白pET-32a-chDDX41進行純化,在咪唑濃度為500 mmol·L-1時目的蛋白被成功洗脫(圖4)。

M,10-250 ku marker;1,pET-32a-chDDX41重組蛋白在15 ℃的誘導產(chǎn)物;2,15 ℃誘導19 h pET-32a-chDDX41重組蛋白的包涵體;3,15 ℃誘導19 h pET-32a-chDDX41重組蛋白的上清;4～5,流穿液;6～7,洗滌液;8～10,洗脫液。M, 10-250 ku marker; 1, Induction product of pET-32a-chDDX41 recombinant protein at 15 ℃; 2, Inclusion body of pET-32a-chDDX41 recombinant protein induced at 15 ℃ for 19 h; 3, Supernatant expression of pET-32a-chDDX41 recombinant protein induced at 15 ℃ for 19 h; 4-5, Flow-through fluid; 6-7, Detergent; 8-10, Elution solution.圖4 pET-32a-chDDX41重組蛋白的純化Fig.4 Purification of pET-32a-chDDX41 recombinant protein

2.5 重組蛋白的Western-blot驗證

Western-blot驗證結(jié)果表明,誘導后的pET-32a-chDDX41重組蛋白在90 ku左右出現(xiàn)一條特異性條帶(圖5),與預期結(jié)果一致,說明誘導出的pET-32a-chDDX41重組蛋白即為目的蛋白。

1,特異性條帶;M,10～250 ku marker。1, Specific band; M, 10-250 ku marker.圖5 pET-32a-chDDX41重組蛋白Western-blot驗證Fig.5 Western-blot validation of pET-32a-chDDX41 recombinant protein

2.6 chDDX41的亞細胞定位

將真核表達質(zhì)粒pmCherry-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41、pCMV-3×Flag-chDDX41分別轉(zhuǎn)染到LMH細胞中,將真核表達質(zhì)粒pmCherry-chDDX41和pCAGGS-HA-chDDX41分別轉(zhuǎn)染到HD11細胞中,轉(zhuǎn)染24 h后進行IFA和DAPI染色,然后用激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果均顯示chDDX41定位在細胞核中(圖6、圖7)。

A-C, pmCherry-chDDX41; D-F, FITC-chDDX41; H-J, AF594-chDDX41.圖6 chDDX41在LMH細胞中的定位Fig.6 Subcellular localization of chDDX41 in LMH cells

A-C, pmCherry-chDDX41; D-F, FITC-chDDX41.圖7 chDDX41在HD11細胞中的亞細胞定位Fig.7 Subcellular localization of chDDX41 in HD11 cells

2.7 FAdV-4對過表達chDDX41基因的LMH細胞中細胞因子表達量的影響

如圖8所示,用FAdV-4感染過表達chDDX41的LMH細胞16 h后,細胞中的IFN-β、IL-6、IL-8、IL-1β、MX-1、MYD88、IRF7、TBK1、MDA5、NF-κB和PKR在mRNA水平上表達量均上調(diào)。

1,轉(zhuǎn)pCMV-3×Flag-N空載質(zhì)粒的LMH細胞;2,轉(zhuǎn)pCMV-3×Flag-chDDX41質(zhì)粒的LMH細胞。1, LMH cell transformed with empty plasmid pCMV-3×Flag-N; 2, LMH cell transformed with plasmid pCMV-3×Flag-chDDX41.圖8 過表達chDDX41對細胞因子表達量的影響Fig.8 Effect of overexpression of chDDX41 gene on cytokine expression

2.8 siRNA干擾影響FAdV-4復制

通過siRNA敲低chSTING反向驗證chDDX41對FAdV-4復制的影響,將3對靶向chSTING基因的siRNA轉(zhuǎn)染至LMH細胞,然后感染FAdV-4。利用灰度分析chDDX41對FAdV-4復制的影響,結(jié)果如圖9所示。siSTING-2的干擾效率最高,可達66%,siRNA敲低chSTING后,過表達chDDX41使FAdV-4-Hexon的蛋白表達量上調(diào)20%,這個結(jié)果反向證實了chDDX41確實參與雞體內(nèi)天然免疫信號通路,是影響FAdV-4復制的關鍵因子。

A,siRNA引物篩選。B,FAdV-4-Hexon蛋白表達;1,對照;2,轉(zhuǎn)pCMV-3×Flag-chSTING質(zhì)粒的LMH細胞;3,同時過表達chDDX41基因和用siRNA敲低chSTING基因的LMH細胞。A, Screening of siRNA primers. B, FAdV-4-Hexon protein expression; 1, Control; 2, LMH cell transformed with plasmid pCMV-3×Flag-chSTING; 3, LMH cell overexpressing chDDX41 gene and knocking down chSTING gene simultaneously.圖9 siRNA干擾影響FAdV-4復制Fig.9 siRNA interference affects FAdV-4 replication

3 討論

在病原體感染細胞后,DDX41作為一種DNA感受器被酪氨酸激酶(BTK)磷酸化,磷酸化的DDX41可以與STING結(jié)合并使之活化,活化后的STING能招募TBK1磷酸化IRF3,產(chǎn)生IFN,影響病原體復制[9, 17-19]。chDDX41與FAdV-4之間的關系目前還未見報道。chDDX41基因全長2 930 bp,共包含33 bp的5′UTR、1 043 bp的3′UTR和1 854 bp的開放閱讀框(ORF),本研究成功克隆出chDDX41的ORF。chDDX41基因共編碼617個氨基酸殘基,共有282個α折疊、37個β轉(zhuǎn)角[20]。chDDX41蛋白質(zhì)分子量約為79 ku。本研究利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)對chDDX41蛋白進行原核表達,經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot驗證,15 ℃、0.5 mmol·L-1IPTG誘導19 h是最佳誘導條件,重組蛋白在上清液和包涵體中均有表達且蛋白具有可溶性。進一步利用柱層析蛋白純化方法成功純化出chDDX41重組蛋白,可為后續(xù)研究chDDX41基因的功能奠定基礎。

Hu等[8]證明在CIK細胞中DDX41定位在細胞核,本研究結(jié)果與此一致,表明DDX41在不同物種中的定位具有高度保守性。此外,在Hu等[8]的研究中發(fā)現(xiàn),DDX41在草魚出血病毒(GCRV)的刺激下可發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運,與STING互作,從而促進IFN的表達,發(fā)揮抗病毒的作用,這一結(jié)果提示我們后續(xù)可通過FAdV-4刺激,觀察chDDX41在不同時間點的細胞定位,進一步探索chDDX41在天然免疫信號通路中的功能。近年來關于DDX41介導的天然免疫信號通路被廣泛解析,如Zhu等[10]研究證明,DDX41可以激活IRF3和NF-κB,促進IFN的表達,影響偽狂犬病毒復制;Liu等[21]證實,在GS細胞中DDX41可以促進IFN、IRF3,以及細胞因子IL-8和IL-1β的表達,影響石斑魚彩虹病毒(SGIV)的復制。FAdV-4作為一種DNA病毒,chDDX41是否可以識別FAdV-4從而引發(fā)天然免疫目前還未有報道。本研究通過qRT-PCR證明,過表達chDDX41的LMH細胞感染FAdV-4后,其IFN-β、IL-6、IL-8和IL-1β的表達量均上調(diào),這與前人的研究結(jié)果一致[10, 21],表明chDDX41可以識別FAdV-4,誘導機體產(chǎn)生天然免疫并具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。

綜上所述,本研究利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)首次獲得chDDX41原核表達蛋白,利用激光共聚焦顯微鏡證明chDDX41定位在細胞核中;FAdV-4感染過表達chDDX41的LMH細胞后IFN和細胞因子在mRNA水平上的表達量均上調(diào),證明chDDX41參與FAdV-4感染引起的天然免疫信號通路,為今后探索chDDX41影響FAdV-4感染的具體分子機制奠定了基礎。