白菜型油菜開花調(diào)控基因BrFT的生物信息學(xué)特性和表達(dá)分析

姚彥林, 馬 驪, 劉麗君, 蒲媛媛, 李學(xué)才, 王旺田,方 彥 , 孫萬倉(cāng),武軍艷,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州 730070; 2.省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070; 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

開花是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)的重要階段[1]。植物開花不但受外界環(huán)境的影響還受多基因調(diào)控。近些年隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展,通過對(duì)一些模式植物擬南芥、水稻的研究,有大量與開花相關(guān)的基因被成功鑒定和分離。已有研究表明,植物成花過程存在6條途徑,分別是光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、自主途徑、年齡途徑以及溫敏途徑,各途徑中的信號(hào)通過開花整合因子相互聯(lián)系,植物才能完成開花[2-3]。FT、SOC1是植物開花過程中重要的開花整合因子,其中FT基因是光周期途徑與春化途徑中各信號(hào)的整合點(diǎn),在調(diào)控植物開花中發(fā)揮著重要作用[4-5]。

FT基因編碼的蛋白屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP),前人在單子葉與雙子葉植物中研究發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)植物開花時(shí)間具有重要作用,PEBP對(duì)于株型分化也產(chǎn)生調(diào)控作用[6-7]。FT基因?qū)χ参镩_花產(chǎn)生促進(jìn)作用最早是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的,發(fā)現(xiàn)FT基因在擬南芥葉片中被誘導(dǎo)表達(dá),然后經(jīng)韌皮部運(yùn)輸?shù)窖宽敹朔稚M織,與FD蛋白形成復(fù)合體來調(diào)控下游開花基因的表達(dá)來促進(jìn)植物開花[8-10]。FT基因已在多種植物被鑒定分析、克隆并驗(yàn)證基因功能,例如一些園藝植物如甘蔗[11]、月季[12]、葡萄[13]、大豆[14]、柑橘[15]等,FT基因的過表達(dá)都能出現(xiàn)早花現(xiàn)象[16],但同時(shí)也有一些FT的同源基因?qū)儆谕砘ɑ?例如龍眼[17]的DlFT1、辣椒[18]、郁金香[19]的FT同源基因都是抑制成花的基因,說明不同物種間由于成花特性的差異,FT基因的功能也有差異。

白菜型冬油菜目前是北方地區(qū)主要的越冬類新型冬季覆蓋作物,具有優(yōu)異的抗寒性,提高產(chǎn)量和品質(zhì)一直是油菜研究的首要目標(biāo),而開花時(shí)間是影響產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。低溫和長(zhǎng)日照均可促使冬性植物提早開花,這不但可以有效解決與其他作物的茬口矛盾,還可以促進(jìn)育種進(jìn)程。FT基因作為開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要整合因子,在白菜型油菜中至今未報(bào)道,本研究通過生物信息學(xué)方法,首次利用甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)最新測(cè)序的白菜型油菜基因組數(shù)據(jù),研究了BrFT基因的結(jié)構(gòu)特征,結(jié)合BrFT基因在白菜型油菜各器官的表達(dá)情況,分析了BrFT1基因在不同白菜型油菜4 ℃,16 h光照/8 h黑暗光周期中的表達(dá)模式,來揭示BrFT1對(duì)白菜型冬油菜開花的調(diào)控作用,為進(jìn)一步研究白菜型油菜開花調(diào)控的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

以白菜型油菜隴油6號(hào)、隴油7號(hào)(強(qiáng)冬性)、隴油17號(hào)、天油2號(hào)(冬性)以及天祝小油菜(春性)為實(shí)驗(yàn)材料。選取各品種籽粒飽滿的種子,用5%的次氯酸鈉消毒5 min,蒸餾水沖洗干凈后播于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中,置于室溫條件下,24 h種子露白后,將天祝小油菜種植于花盆,待到始蕾期取根、莖、葉、花蕾,初花期取花并液氮速凍,之后放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將天?號(hào)、隴油17號(hào)、隴油6號(hào)和隴油7號(hào)露白后的種子放于培養(yǎng)箱開始4 ℃,16 h光照/8 h黑暗處理,以0 d作為對(duì)照,處理時(shí)間為20、30、40、50、60、70 d,每處理完成后,取出植物材料,一部分蒸餾水沖洗干凈后用濾紙迅速吸干水分,液氮速凍保存?zhèn)溆?一部分種植于花盆,每處理每個(gè)品種調(diào)查植株數(shù)15株,用于觀察統(tǒng)計(jì)開花株率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù)。

1.2 相關(guān)物種數(shù)據(jù)

使用的擬南芥蛋白序列下載于(http://www.arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),大白菜全基因組數(shù)據(jù)下載于Ensembl網(wǎng)站(http://plants.ensembl.org/index.html),白菜型冬油菜基因組數(shù)據(jù)來自于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)最新測(cè)序結(jié)果。

1.3 白菜型油菜BrFTs基因的鑒定與分析

利用FT基因保守結(jié)構(gòu)域(http://Pfam.xfam.org/family/PF01161),通過HMMER3.0軟件在白菜型油菜基因組數(shù)據(jù)中提取FT蛋白序列,將獲得的蛋白序列提交至SMART(https://www.omicsclass.com/article/)和NCBI CDD(https://www.omicsclass.com/article/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證,剔除不包含F(xiàn)T結(jié)構(gòu)域及不完整的序列,最終確定BrFT家族成員。參照馬驪等[20]方法分析各成員的蛋白理化性質(zhì)。通過在線工具M(jìn)EME(http://meme-suite.org/)和GSGD(http://gsds.gao-lab.org/)分別分析各成員的保守結(jié)構(gòu)域、內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)特征。由BrFT基因的位置信息,結(jié)合染色體的名稱、長(zhǎng)度信息通過軟件Mapchart繪制BrFT基因染色體分布圖。運(yùn)用MCScanX軟件分析基因共線性關(guān)系。提取基因上游2 000 bp作為啟動(dòng)子區(qū),利用在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件。

1.4 RNA的提取和cDNA的合成

按照TIANGEN(天根生化科技公司)植物RNA快速提取試劑盒說明書提取植物組織總RNA,利用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.5 基因的克隆與表達(dá)分析

根據(jù)BrFT基因序列設(shè)計(jì)引物(表1),進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),檢測(cè)BrFT基因在天祝小油菜不同組織中的表達(dá)情況,根據(jù)表達(dá)量篩選BrFT1基因設(shè)計(jì)克隆引物(表1),以常溫下隴油6號(hào)、隴油17號(hào)和天油2號(hào)葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后參照TIANGEN(天根生化科技公司)的DNA純化回收試劑盒說明書進(jìn)行純化,純化后的產(chǎn)物與PMD19-T克隆載體過夜連接,再與DH5α感受態(tài)混勻培養(yǎng),篩選白斑進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,將驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1,其中Actin為內(nèi)參基因),以不同感溫性冬油菜4 ℃,16 h光照/8 h黑暗處理中植株的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),每個(gè)處理時(shí)間3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。通過公式2-△△CT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量,利用SPSS22.0軟件分析顯著性,作圖采用Origin2021軟件。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜型油菜BrFT基因家族成員鑒定與蛋白理化性質(zhì)

通過HMM搜索在白菜型油菜基因組中共搜索到3個(gè)BrFT基因,分別將它們命名為BrFT1、BrFT2、BrFT3(表2)。BrFT基因序列長(zhǎng)度差異不大,從528 bp到531 bp,編碼的氨基酸數(shù)目在175～176 aa,分子量為19.77～19.93 ku,理論等電點(diǎn)為7.72～7.82,說明該家族均為堿性氨基酸。蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)反映出該家族蛋白中BrFT2和BrFT3為穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)的親水性均小于0,說明BrFT均為親水性蛋白。BrFT蛋白均由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成,其中無規(guī)則卷曲在3條BrFT蛋白中所占比例高于其他類型,其次為延伸鏈、α-螺旋,β-折疊最低,由此可知,無規(guī)則卷曲是BrFT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

表2 BrFT基因家族成員基本信息Table 2 Basic information of BrFT gene family members

2.2 BrFT基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

根據(jù)motif分析結(jié)果(圖1),該家族3個(gè)成員均含有4個(gè)保守基序,motif1、motif2、motif3和motif4。進(jìn)一步分析保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn),BrFT編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域主要是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白PEBP結(jié)構(gòu)域,大約由23個(gè)氨基酸組成,該結(jié)構(gòu)域作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的調(diào)節(jié)器來調(diào)控基因的表達(dá)?；蚪Y(jié)構(gòu)顯示,該家族基因均含有4個(gè)外顯子,3個(gè)內(nèi)含子。BrFT1和BrFT2基因結(jié)構(gòu)極度相似,BrFT3基因結(jié)構(gòu)最長(zhǎng),長(zhǎng)度3 500 bp左右(圖2)。

圖1 BrFT基因保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The conserved domain and gene structure of BrFT gene

背景區(qū)域?yàn)榘撞诵陀筒嘶蚪M中的所有共線性部分,紅色線條代表存在共線性關(guān)系的BrFT基因?qū)?不同顏色的半圈代表染色體。The background area is all the collinearity parts in B. rapa genome. The red lines represent the contributing BrFT gene pairs, and the half circles with different colors represent chromosomes.圖2 BrFT基因在染色體上的位置信息及共線性關(guān)系Fig.2 Location information and collinearity of BrFT gene on chromosomes

2.3 白菜型油菜BrFT在染色體上的分布以及共線性分析

染色體定位結(jié)果顯示,3個(gè)BrFT基因分別位于白菜型油菜A02、A07染色體上,其中,A02染色體上只有一個(gè)基因,其余2個(gè)基因位于A07染色體上(圖2-A)。白菜型油菜組內(nèi)共線性分析表明,位于A02染色體上的BrFT1與A07染色體上的BrFT2存在共線性關(guān)系,推測(cè)片段復(fù)制可能是BrFT擴(kuò)增的主要因素,BrFT1和BrFT2可能在功能方面具有一定的相通性(圖2-B)。

2.4 BrFT基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件

BrFT基因啟動(dòng)子區(qū)除含有啟動(dòng)子區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)共同的順式作用元件CAAT-box,核心啟動(dòng)子元件TATA-box外,主要富含4類調(diào)控元件,包括參與光反應(yīng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫和激素誘導(dǎo)的相關(guān)元件(圖3)。分析每個(gè)基因所含順式作用元件,發(fā)現(xiàn)3個(gè)成員含有光反應(yīng)的順式作用元件最多,共38個(gè),另外均含參與厭氧誘導(dǎo)、防御和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控元件,除此之外BrFT1和BrFT2含有參與胚乳表達(dá)、生長(zhǎng)素反應(yīng)、水楊酸反應(yīng)、脫落酸反應(yīng)的作用元件。

圖3 BrFT基因順式作用元件分析Fig.3 Cis-acting element analysis of BrFT gene

2.5 白菜型油菜BrFT基因在不同器官中的表達(dá)模式分析

利用課題組前期完成的隴油7號(hào)材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析BrFT基因在4 ℃,16 h光照/8 h黑暗處理30 d的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,當(dāng)4 ℃,16 h光照/8 h黑暗處理30 d時(shí),BrFT1、BrFT2、BrFT3均上調(diào)表達(dá),其中BrFT1表達(dá)量明顯高于其余兩個(gè)成員(圖4)。通過qRT-PCR檢測(cè)BrFT在隴油7號(hào)和天祝小油菜根、莖、葉、花蕾和花各器官中的表達(dá)。結(jié)果表明,在強(qiáng)冬性隴油7號(hào)和春性品種天祝小油菜中,BrFT在根、莖、葉、花蕾和花各器官中均表達(dá),其中在葉中的表達(dá)量高于其他器官部位,且BrFT1在葉中的表達(dá)量顯著高于BrFT2和BrFT3(圖5)。

圖4 隴油7號(hào)在4 ℃,16 h光照/8 h黑暗處理30 d時(shí)BrFT的表達(dá)模式Fig.4 Expression pattern of BrFT in Longyou 7 at 4 ℃, 16 h light/8 h darkness for 30 days

不同數(shù)據(jù)柱上沒有相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。The bars with different lowercase letters showed the significant difference (P<0.05). The same as below.圖5 BrFT基因在隴油7號(hào)(A)和天祝小油菜(B)各器官中的表達(dá)Fig.5 Expression of BrFT genes in organs of Longyou 7(A) and Tianzhu small rape (B)

2.6 BrFT1基因的克隆

根據(jù)BrFT基因的表達(dá)模式,篩選表達(dá)量最高的BrFT1基因克隆,結(jié)果顯示(圖6),BrFT1基因CDS長(zhǎng)528 bp,起始密碼子ATG,終止密碼子TAG,編碼175個(gè)氨基酸。不同品種BrFT1序列比對(duì)分析表明,隴油17號(hào)中178 bp處發(fā)生了堿基突變,A突變?yōu)镚,233 bp處堿基由C突變?yōu)門,與隴油7號(hào)相比,序列相似性為99.92%,隴油6號(hào)、天油2號(hào)與隴油7號(hào)相比,序列沒有發(fā)生堿基突變。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明,隴油17號(hào)第233 bp處發(fā)生的堿基突變并沒有引起編碼氨基酸的突變,而178 bp處的堿基突變致使編碼的氨基酸也發(fā)生了改變,氨基酸序列相似性為99.50%(圖7)。

L6,隴油6號(hào);L17,隴油17號(hào);T2,天油2號(hào)。L6, Longyou 6; L17, Longyou 17; T2, Tianyou 2.圖6 BrFT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoretic image of BrFT1 gene amplification product

圖7 不同品種白菜型冬油菜BrFT1基因氨基酸序列比對(duì)分析Fig.7 Alignment analysis of the amino acid sequence of BrFT1 gene in different varieties of winter rapeseed

2.7 BrFT1基因的表達(dá)分析

檢測(cè)BrFT1基因在不同感溫性白菜型冬油菜4 ℃,16 h光照/8 h黑暗處理下不同階段的表達(dá)情況,表明該基因整體呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)(圖8),這與2.5節(jié)中BrFT1基因在隴油7號(hào)中的表達(dá)模式相近。但在相同處理時(shí)間下不同品種中BrFT1基因表達(dá)不盡相同,當(dāng)處理30 d時(shí),天油2號(hào)中BrFT1的表達(dá)量高于其他各品種,結(jié)合對(duì)開花株率的統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)處理30 d,天油2號(hào)開花株率在各品種間最高(表3)。處理40、60 d時(shí),BrFT1分別在天油2號(hào)和隴油17號(hào)中表達(dá)量極顯著升高,發(fā)現(xiàn)天油2號(hào)在處理40 d的時(shí)候開花株率為98.3%,基本全部開花,而隴油17號(hào)處理60 d的時(shí)候開花株率為93.3%,開花植株數(shù)相比其他處理時(shí)間增多。而在強(qiáng)冬性隴油6號(hào)和隴油7號(hào)中,當(dāng)處理70 d時(shí),BrFT1基因表達(dá)量達(dá)到最大,處理70 d時(shí),隴油6號(hào)和隴油7號(hào)開花株率明顯升高,開花植株數(shù)最多。發(fā)現(xiàn)BrFT1的過量表達(dá)能夠引起不同感溫性白菜型冬油菜開花。

圖8 BrFT1基因在不同白菜型冬油菜4 ℃,16 h光照/8 h黑暗處理中的熒光定量表達(dá)Fig.8 Quantitative expression of BrFT1 gene in different varieties of winter rapeseed at 4 ℃, 16 h light/8 h darkness

表3 不同處理時(shí)間對(duì)白菜型油菜開花株率的影響Table 3 Effect of different treatment time on flowering plant rate of Brassica rapa L.

3 討論

PEBP蛋白在植物種子發(fā)育,花序結(jié)構(gòu)形成和成花轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用[21-22],FT屬于PEBP蛋白的一個(gè)亞類,目前已報(bào)到的FT擬南芥中2個(gè)[23],甘藍(lán)型油菜中6個(gè)FT的拷貝[24],玉米中12個(gè)[25],水稻中13個(gè)[26],棉花、桃中各1個(gè)[27],蘋果中2個(gè)[28]、草莓中3個(gè)[29]。本研究參照擬南芥中FT基因,通過甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)最新測(cè)序獲得的白菜型冬油菜基因組,共鑒定得到3個(gè)BrFT基因,其數(shù)量與擬南芥接近,對(duì)白菜型油菜BrFT蛋白結(jié)構(gòu)詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn),所編碼的蛋白均含有PEBP特定的保守結(jié)構(gòu)域,且都含有相同或相似的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu),共線性分析表明,BrFT1和BrFT2存在明顯的共線性關(guān)系,由此推測(cè),二者在功能方面具有一定的相通性。啟動(dòng)子元件分析表明,BrFT含有大量的光響應(yīng)元件,推測(cè)它們能夠?qū)Π撞诵陀筒送饨绻庹兆龀鰬?yīng)答,這與甘藍(lán)型油菜中A7-FT啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件的研究結(jié)果相似[30]。另外BrFT1和BrFT2在啟動(dòng)子區(qū)存在參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素誘導(dǎo)的作用元件,推測(cè)它們能夠參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、植物激素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此,下一步將對(duì)激素和白菜型冬油菜BrFT基因的相互關(guān)系進(jìn)行研究。

本研究發(fā)現(xiàn),BrFT在白菜型油菜的各器官均表達(dá),且葉中的表達(dá)量高于其他器官部位,這與已有研究報(bào)道FT在葉片和維管束組織中特異性表達(dá)相似[31]?？寺〉玫搅税撞诵陀筒穗]油6號(hào)、隴油17號(hào)、天油2號(hào)BrFT1基因,發(fā)現(xiàn)不同品種的感溫性與BrFT1基因的序列并無關(guān)系,可能不同白菜型油菜的開花時(shí)間不受BrFT基因本身結(jié)構(gòu)特征的影響。qRT-PCR分析結(jié)果表明,在4 ℃,16 h光照/8 h黑暗處理下,使BrFT1的表達(dá)被激活,呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá),并且在不同感溫性白菜型油菜品種中BrFT1基因的過量表達(dá)能夠相應(yīng)的引起植株開花,推測(cè)長(zhǎng)日照通過提高BrFT1基因的表達(dá)量來相應(yīng)激活蛋白活性,從而利于白菜型油菜開花。研究發(fā)現(xiàn),相同處理時(shí)間下,BrFT1的表達(dá)水平與不同感溫性白菜型油菜開花時(shí)間有關(guān),推斷BrFT1的表達(dá)可能還受其他調(diào)控因子的影響,結(jié)合前面對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件的分析,預(yù)測(cè)這些因子有可能是參與基因調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育通路中的上游調(diào)控因子,這些結(jié)果也為白菜型冬油菜的進(jìn)一步研究提供了線索。

4 結(jié)論

本研究首次從白菜型冬油菜基因組中檢索到3個(gè)BrFT家族基因,生物信息學(xué)分析顯示,3個(gè)家族成員外顯子、內(nèi)含子、保守Motif分布相似,基因啟動(dòng)子區(qū)均含光應(yīng)答元件,另外存在參與植物生長(zhǎng)、激素誘導(dǎo)元件。篩選在白菜型油菜中表達(dá)量最高的BrFT1基因進(jìn)行克隆及qRT-PCR,表明白菜型冬油菜的不同感溫性與BrFT1基因序列無關(guān),但不同感溫性冬油菜開花時(shí)間與該基因表達(dá)模式有關(guān),可能在4 ℃,16 h光照/8 h黑暗處理過程中該基因的表達(dá)受到了其他調(diào)控因子的影響。該結(jié)論為進(jìn)一步研究基因功能提供了參考依據(jù)。