茉莉酸信號關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OsMYC2影響水稻愈傷誘導(dǎo)和分化的功能初探

蔣瑩瑩,張 華,雷志偉,3,徐 恒,張 恒,朱 英,*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所,農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控省部共建國家重點實驗室,浙江省作物分子育種工程技術(shù)研究中心,浙江 杭州 310021; 3.浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院,浙江 杭州 311300)

植物高度分化的成熟組織或細胞通過激素刺激和離體培養(yǎng)再次形成完整植株的過程是植物的一種再生過程。植物再生主要存在兩種方式,一種是通過激素刺激直接產(chǎn)生芽和根,然后再形成完整植株;而另外一種則是植物組織在激素的刺激下先形成愈傷組織,然后愈傷組織經(jīng)過分化形成體細胞胚后,再通過生長發(fā)育形成植株[1-3]。其中第二種再生方式對于水稻和小麥等作物基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用尤為重要,因為這些作物的轉(zhuǎn)基因效率與愈傷組織的質(zhì)量和胚性愈傷的分化效率高度相關(guān)[4]。不同植物的再生效率存在顯著差異,如煙草、胡蘿卜和擬南芥等植物再生效率較高,而小麥、玉米和大豆等作物的再生效率卻明顯偏低[5]。同種植物不同亞種間的再生效率也存在明顯差異,如亞洲栽培稻中粳稻品種的再生效率普遍高于秈稻品種,由此表明,基因型差異可能對植物再生效率具有重要影響作用[6-7]。

植物再生過程中,生長素(indole-3-acetic acid, IAA)和細胞分裂素(cytokinin, CTK)的作用最先被人們發(fā)現(xiàn)。1957年,Skoog等[8]通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中IAA和CTK的比例,第一次成功實現(xiàn)對植物器官形成的人為控制,從而表明植物再生過程中IAA和CTK具有重要作用。已有結(jié)果表明,植物體中IAA主要通過ARF-LBD-E2Fa信號傳遞途徑促進離體組織形成愈傷[9]。ARF(auxin response factor)是一類轉(zhuǎn)錄因子基因,它們在IAA信號途徑中具有重要作用[10]。擬南芥arf7arf19雙基因突變體對IAA不敏感,在含有2,4-D(一種人工合成生長素)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無法形成愈傷組織。LBD(lateral organ boundaries domain)也是一類轉(zhuǎn)錄因子基因,其表達受ARF基因的直接調(diào)控。過表達LBD16、LBD17或LBD29可恢復(fù)arf7arf19雙突變體的愈傷組織形成能力[11]。E2Fa是LBD的下游基因,它們可以與細胞周期蛋白結(jié)合促進植物愈傷組織形成[12]。愈傷分化過程中,CTK可以平衡IAA的作用,并促進芽的再生。擬南芥CTK信號傳遞主要通過HK-HP-ARR分子途徑向下傳遞[13]。HK(histidine kinase)是CTK的受體。在CTK刺激下,HK將磷酸基團傳給HP(his-containing phosphotransfer)后再轉(zhuǎn)移給ARR(arabidopsis response regulator)。ARR是一類轉(zhuǎn)錄因子基因,B類ARR在發(fā)生磷酸化后可以激活細胞周期蛋白基因CYCDs(D-type cyclin)的表達,從而促進愈傷進行分化[14-15]。

除IAA和CTK外,人們通過對植物傷口處自然形成的愈傷研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸(jasmonic acid, JA)也是影響植物再生的另外一種重要激素[16-18]。植物在受到外界傷害后,傷口處的JA含量會快速上升,而JA又可以通過COI1-MYC2-ERF115分子途徑促進愈傷組織形成[18-19]。擬南芥中,COI1是JA的受體基因。在受到JA刺激后,COI1(coronatine insensitive 1)可以與JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白結(jié)合,促使后者進入泛素化降解途徑。JAZ蛋白降解后,MYC2的轉(zhuǎn)錄活性被重新釋放[20],激活ERF115(ethylene response factor 115)的表達,而ERF115又可激活SCN(stem cell niche)等基因的表達,最終促進植物進行再生[18]。

水稻中,OsMYC2(LOC_Os10g42430)也是JA信號傳遞途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子之一[21]。水稻依賴于OsMYC2的JA信號傳遞途徑與擬南芥較為類似。受體OsCOI1b在與JA結(jié)合后可以促使OsJAZs蛋白發(fā)生降解,從而解除對OsMYC2轉(zhuǎn)錄活性的抑制,激活下游JA信號響應(yīng)基因的表達[21]?；蚬δ苎芯拷Y(jié)果表明,OsMYC2是水稻抗病能力的正向作用因子,過表達OsMYC2,水稻白葉枯病、條紋葉枯病和稻瘟病抗性均獲得顯著性提高[22-26]。不過,OsMYC2的過量表達也會導(dǎo)致葉綠素代謝基因表達上調(diào),從而導(dǎo)致水稻植株發(fā)生早衰[27]。此外,OsMYC2也可通過MADS類轉(zhuǎn)錄因子影響水稻的小穗發(fā)育。當(dāng)OsMYC2的功能被抑制時,水稻OsMADS1、OsMADS7和OsMADS8基因的表達明顯下調(diào),小穗發(fā)育發(fā)生異常[21]。目前,水稻JA信號傳遞基因在再生過程中是否也存在與擬南芥類似的功能尚不清楚。因此,本研究對OsMYC2基因在水稻再生過程中的作用開展研究,同時對水稻ERF115同源基因的表達進行鑒定分析,以了解JA信號途徑基因?qū)λ境墒炫哂鷤M織形成和分化的影響,從而為進一步提高水稻轉(zhuǎn)基因效率提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料的鑒定

本研究所用的野生型水稻材料為粳稻品種日本晴(Nipponbare,NIP),osmyc2基因編輯突變體材料種子由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院洪高潔研究員友情提供[23]。該突變體材料以日本晴為受體構(gòu)建。將水稻種子播種和移栽后,對各水稻單株進行取樣和基因組DNA提取,并通過PCR擴增和測序確定野生型和突變體單株中OsMYC2基因的序列變異情況。待水稻種子成熟后,進行單株收獲,所收獲的野生型和osmyc2純合突變體種子用于后續(xù)成熟胚組織愈傷的誘導(dǎo)和分化試驗。

1.2 水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和分化

本研究以水稻成熟胚為材料,通過組織培養(yǎng)進行愈傷誘導(dǎo)和分化。主要操作過程如下:為了減少機械外力對胚活性的損失,成熟的水稻種子進行手工去殼,然后選取健康的水稻種子進行消毒和清洗。水稻種子首先通過75%乙醇(約1 min)去除表面細菌后,再通過30%次氯酸鈉(約20 min)進行深度滅菌。消毒好的種子通過無菌去離子水清洗若干次(5～7次)后,再在滅菌后的濾紙上吸干剩余水分,最后將種子放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)(30～35 d)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以NB培養(yǎng)基(Coolaber)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,外加2 mg·L-12,4-D。愈傷組織誘導(dǎo)期間,對愈傷組織進行觀察、取樣和拍照,培養(yǎng)約32 d時根據(jù)形成的愈傷組織大小和胚性愈傷的數(shù)量進行計分,以展示野生型日本晴和osmyc2突變體的愈傷誘導(dǎo)效率。

待野生型對照日本晴產(chǎn)生較多胚性愈傷后,挑選日本晴和osmyc2突變體的胚性愈傷移入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)45 d。分化培養(yǎng)基以NB培養(yǎng)基(Coolaber)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,外加3 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA。愈傷分化期間,對愈傷組織進行觀察、取樣和拍照,分化約42 d時根據(jù)愈傷組織的擴散程度和完整植株的形成數(shù)量進行計分,以展示野生型日本晴和osmyc2突變體的愈傷分化效率。

1.3 水稻愈傷組織樣品的獲取

為了調(diào)查OsMYC2基因在水稻再生過程中的表達情況,我們在日本晴成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)和分化期間進行了連續(xù)取樣。愈傷誘導(dǎo)期間,從愈傷組織開始形成時,即誘導(dǎo)培養(yǎng)基中第9天進行第一次取樣。隨后,每隔一天取樣一次,即誘導(dǎo)期第11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31 天時進行取樣。愈傷分化期間,在培養(yǎng)第2、4、6、8、10、12、14、19、24、26、28和30天時進行取樣。愈傷組織誘導(dǎo)和分化期間,每次愈傷組織取樣均在當(dāng)天下午3:00左右進行,每個時間點的樣品取5個重復(fù)。所取愈傷組織放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入超低溫冰箱進行保存。為了調(diào)查OsMYC2可能的下游基因的表達情況,在分化期第24天對osmyc2突變體的愈傷組織也進行取樣,取樣時間和生物學(xué)重復(fù)與日本晴相似。

1.4 愈傷組織樣品RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

愈傷組織的總RNA利用英俊公司的TRIzol reagent進行提取。具體方法如下:在1.5 mL的RNase-Free EP管中加入1 mL Trizol(Invitrogen),取50～80 mg的愈傷組織放入EP管中,用電動研磨器充分研磨后室溫靜置5 min。4 ℃,12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清至一新的1.5 mL的RNase-Free EP管中。加入200 μL氯仿,劇烈振蕩15 s,室溫放置5 min。4 ℃,12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清至新的RNase-Free EP管中,加入2.5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇,顛倒混勻后冰上放置10 min。4 ℃,13 000 r·min-1離心15 min后棄去上清,用75%乙醇洗滌后,離心棄上清。待沉淀干燥后,加入適量的RNase-Free水溶解沉淀,即為提取的RNA粗樣品。用瓊脂糖凝膠電泳對RNA粗樣品進行品質(zhì)鑒定。抽提所獲得的RNA粗樣用英俊公司TURBO DNA-freeTM試劑盒進行消化,以徹底消除殘留基因組DNA。取50 μL RNA粗樣,加入5 μL反應(yīng)緩沖液(10×), 再加入1 μL DNAase?；靹蚝蠓湃?7 ℃培養(yǎng)箱進行溫浴,25 min后取出樣品待冷卻至室溫(25 ℃)后加入5 μL reactive反應(yīng)液,室溫下反應(yīng)5 min,并進行間斷性混勻。反應(yīng)完后,4 ℃,12 000 r·min-1離心3 min,吸取上清即為消化完成的RNA樣品。

消化后所獲得RNA精樣用Promega的GoScriptTM 反轉(zhuǎn)系統(tǒng)進行反轉(zhuǎn)錄,以獲得第1鏈cDNA。冰上配置如下反應(yīng)液:RNA 樣品約1 μg;Oligo dT Primer,1 μL;加入DEPC水到最終體積5 μL。70 ℃變性5 min后,直接置于冰上。配置反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液:DEPC水,6 μL;ImProm-Ⅱ 5×Reaction Buffer,4 μL;MgCl2(25 mmol·L-1),2.5 μL;dNTP mix(10 mmol·L-1each dNTP),1 μL;RNA抑制劑,0.5 μL;ImProm-Ⅱ Reverse Transcriptase,1 μL?；靹蝾A(yù)混液后,分裝15 μL到每個已變性過的樣品中,再混勻。25 ℃放置5 min后,42 ℃反應(yīng)1 h。70 ℃高溫失活10 min,將反轉(zhuǎn)好的cDNA置于冰上或放入-20 ℃冰箱中長久保存。

1.5 基因表達分析

qRT-PCR定量表達分析主要是利用Bio-rad 公司的C1000定量分析儀和 SYBR?Green Supermix反應(yīng)液完成。基因定量表達分析采用的內(nèi)參為水稻Actin基因[28],每個樣品重復(fù)3～5次,目標(biāo)基因相對表達量通過△CT方法計算獲得。基因定量表達分析所用引物序列見表1。樣本間的數(shù)據(jù)差異顯著性分析結(jié)果通過t-測驗獲得。

表1 用于基因表達鑒定的引物序列信息Table 1 Oligonucleotide primer sequences used for gene expression analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 OsMYC2基因在成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)和分化期間的表達情況

觀察發(fā)現(xiàn),日本晴成熟種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)第9天時,愈傷組織開始形成。隨著愈傷組織逐步長大,在培養(yǎng)后期(第25天后)開始出現(xiàn)胚性愈傷?；虮磉_分析結(jié)果表明,愈傷形成初期(第9～15天)OsMYC2基因的表達量相對較高;而愈傷誘導(dǎo)中期(第15～19天),OsMYC2的表達量出現(xiàn)一段明顯的下降過程;胚性愈傷開始形成后(第25～31天),OsMYC2的表達量又出現(xiàn)一定的上升,并在這一階段保持相對穩(wěn)定(圖1-A),由此我們推測OsMYC2的表達對水稻胚性愈傷的形成可能存在一定促進作用。

A-OsMYC2基因在水稻愈傷誘導(dǎo)期的表達情況;B-OsMYC2基因在水稻愈傷分化期的表達情況;C-水稻愈傷分化期的表型圖。A, Expression analysis of OsMYC2 in callus cultured in the induction medium; B, Expression analysis of OsMYC2 in callus cultured in the differentiation medium; C, Phenotype of callus in the differentiation medium.圖1 OsMYC2基因在水稻再生過程中的動態(tài)表達情況Fig.1 Dynamic expression analysis of OsMYC2 in regeneration process of rice

在愈傷分化期間,日本晴愈傷組織中OsMYC2的表達則比較活躍,普遍高于誘導(dǎo)期的愈傷。在分化培養(yǎng)早期(第4天),OsMYC2的表達量相對較低;而在第8天,即部分愈傷出現(xiàn)明顯綠點,體細胞胚開始形成時(圖1-C),OsMYC2的表達量開始上升。愈傷分化中期(第12～24天),體細胞胚的形成和發(fā)育逐漸進入繁盛期(圖1-C),相應(yīng)地,OsMYC2的表達量也最為豐富(圖1-B)。根據(jù)上述結(jié)果,我們推測OsMYC2在水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和分化過程中可能均存在一定作用,其中分化期的作用更為重要。

2.2 OsMYC2基因影響水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和分化

本研究中采用的osmyc2突變體材料共有3個系(osmyc2-2、osmyc2-3和osmyc2-6)。以水稻基因組為模板對編輯靶位點測序,結(jié)果表明,3個osmyc2突變體材料的OsMYC2基因序列變異屬于同一個編輯位點不同形勢突變。與野生型日本晴序列進行比較,osmyc2-2在編輯位點處插入1個堿基,而osmyc2-3和osmyc2-6分別缺失4和7個堿基。3種突變均導(dǎo)致OsMYC2基因在翻譯時發(fā)生提前終止,它們產(chǎn)生的短肽分別含有55、60和61個氨基酸殘基。蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果顯示,osmyc2-2編碼的55個氨基酸殘基與野生型OsMYC2蛋白N端的55個氨基酸殘基完全一致;而osmyc2-3和osmyc2-6的前57個氨基酸殘基與OsMYC2蛋白N端的57個氨基酸殘基相同,但剩下的3和4個氨基酸殘基存在差異(圖2-A)。同時,我們利用qRT-PCR技術(shù)對突變體中OsMYC2基因的表達進行了鑒定,結(jié)果顯示,OsMYC2基因在osmyc2-2、osmyc2-3和osmyc2-6突變體分化期愈傷中的表達均明顯低于野生型日本晴愈傷中的表達(圖2-C),表明osmyc2的基因編輯位點可能也影響OsMYC2基因在水稻愈傷中的表達。

A,osmyc2基因編輯突變體的基因組序列變異和根據(jù)DNA序列預(yù)測所獲的蛋白質(zhì)序列變異情況。OsMYC2基因組序列變異展示圖中,紅色和綠色字母分別表示插入和缺失的堿基。OsMYC2蛋白序列展示圖中,紅色字母表示不同的氨基酸殘基,55和57表示該氨基酸殘基位于OsMYC2蛋白序列的位置;B,野生型對照日本晴和osmyc2基因編輯突變體在分化第30天時的表型圖;C,野生型日本晴和osmyc2突變體分化期(第24天時)愈傷組織中OsMYC2基因的表達情況;D,野生型日本晴和osmyc2突變體成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)效率的統(tǒng)計結(jié)果;E,野生型日本晴和osmyc2突變體胚性愈傷的分化效率統(tǒng)計結(jié)果;**代表樣品與野生型NIP之間存在顯著性差異P<0.01。A, Genomic and protein sequence of OsMYC2 in wild type (NIP) and osmyc2 mutant. The red and green letters in the genomic sequence of OsMYC2 represent insert and deleted nucleotide bases, respectively. The red letters in the OsMYC2 Protein sequence represent different amino acid residue and the number means 55 and 57 amino acid residue from N-terminal of OsMYC2 Protein; B, Callus phenotype at 30 days after differentiation of wild type Nipponbare (NIP) and osmyc2 mutant; C, Expression of OsMYC2 in wild type NIP and osmyc2 mutant callus cultured in the differentiation medium; D, Callus induction efficiency of wild type NIP and osmyc2 mutant; E, Embryogenic callus differentiation efficiency of wild type NIP and osmyc2 mutant; ** represents significant difference at the 0.01 levels (t-test).圖2 野生型日本晴(NIP)和osmyc2基因編輯突變體的基因型和表型鑒定結(jié)果Fig.2 Genotype and phenotype of wild type rice Nipponbare (NIP) and osmyc2 mutant

為了分析OsMYC2基因是否影響水稻愈傷的誘導(dǎo)和分化,我們對日本晴和osmyc2突變體種子進行了成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和分化實驗。根據(jù)愈傷組織大小和胚性愈傷數(shù)量,我們對野生型日本晴和osmyc2突變體的愈傷誘導(dǎo)效率進行了計分和統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示,osmyc2突變體的愈傷誘導(dǎo)效率(47.2%～72.3%)均顯著低于野生型日本晴(NIP,89.6%),其中osmyc2-6的誘導(dǎo)效率最低(圖2-D),由此表明,OsMYC2在水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)過程中可能對胚性愈傷的形成具有一定促進作用。隨后,將osmyc2突變體和野生型水稻品種日本晴的胚性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)。通過觀察發(fā)現(xiàn),osmyc2突變體的分化效率明顯低于野生型對照(圖2-E)。根據(jù)愈傷擴增數(shù)量和水稻再生植株的形成效率,我們對各組愈傷進行計分和統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示3個osmyc2突變體的愈傷分化效率(32.6%～62.3%)均顯著低于野生型日本晴(NIP,91.3%)。與誘導(dǎo)培養(yǎng)類似,突變體osmyc2-6的愈傷分化效率最低(32.6%),而突變體osmyc2-2的愈傷分化效率較高(62.3%),osmyc2-3的愈傷分化效率與osmyc2-6較為接近,為39.6%(圖2-E)。綜合以上結(jié)果,我們推測在水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和分化過程中,OsMYC2的表達不僅影響胚性愈傷的形成,同時也影響胚性愈傷的分化。

2.3 OsMYC2基因影響水稻愈傷分化效率潛在下游基因的表達分析

擬南芥中,ERF115是JA和IAA影響再生分子途徑中的共同基因[18,29]。ERF115可以激活WOX5和SCN等基因的表達,從而促進植物進行再生。由于擬南芥JA信號途徑中,ERF115位于COI1和MYC2的下游[18],因此我們推測OsMYC2也可能通過ERF115在水稻中的同源基因影響成熟胚的愈傷誘導(dǎo)和分化。蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果表明,水稻基因組中與擬南芥ERF115相似的同源基因可能有2個[30-31],它們分別是OsERF101/OsRap2.6和OsERF60/OsRLP2.6L。我們利用日本晴和osmyc2突變體分化期愈傷組織進行基因表達分析。取樣時間點為水稻愈傷分化培養(yǎng)第24天,此時野生型愈傷組織中OsMYC2基因的表達最為活躍。利用qRT-PCR技術(shù),對OsERF101和OsERF60進行基因表達分析,結(jié)果表明,OsERF101和OsERF60基因在愈傷組織中的表達豐度較高,OsERF60的表達明顯高于OsERF101。而與野生型相比,OsERF101和OsERF60在osmyc2突變體中的表達均顯著下降,其中OsERF101的下降幅度更大(圖3-A和B)。

N.S.代表樣品與野生型NIP之間無顯著性差異,*代表樣品與野生型NIP之間存在顯著性差異P<0.05,**代表樣品與野生型NIP之間存在顯著性差異P<0.01。N.S. represents no difference and *, ** represents significant difference at the 0.05 and 0.01 levels (t-test), respectively.圖3 野生型日本晴(NIP)和osmyc2突變體愈傷中OsERF101(A)、OsERF60(B)、OsWUS(C)、OsBBM1(D)、OsBBM2(E)、OsWOX5(F)的基因表達結(jié)果Fig.3 Expresssion analysis results of OsERF101 (A), OsERF60 (B), OsWUS (C), OsBBM1 (D), OsBBM2 (E) and OsWOX5 (F) in callus of wild type rice Nipponbare (NIP) and osmyc2 mutant

這一結(jié)果表明,水稻中的OsERF101和OsERF60與擬南芥的ERF115相似,可能也參與了植物再生過程。而根據(jù)基因表達水平的變化幅度我們推測OsMYC2可能調(diào)控OsERF101在愈傷中的表達。

同時,由于OsMYC2基因缺失后水稻體細胞胚的形成效率顯著下降,因此我們對OsBBM和OsWUS等可能影響水稻胚胎發(fā)育的基因的表達進行了鑒定。水稻基因組中有4個與擬南芥BBM同源的基因[32],它們分別是OsBBM1、OsBBM2、OsBBM3和OsBBM4。qRT-PCR結(jié)果表明,OsBBM1和OsBBM2在愈傷組織中的表達比較高,而OsBBM3和OsBBM4則豐度很低,因此我們對水稻OsBBM1和OsBBM2基因的表達結(jié)果進行了比較分析。結(jié)果顯示,所有osmyc2突變體中OsBBM2基因表達水平均顯著低于野生型對照日本晴;OsBBM1除了在osmyc2-2中表達與日本晴無顯著差異外,在osmyc2-3和osmyc2-6中的表達也明顯下降(圖3-D和E)。隨后,我們分別對擬南芥中的再生標(biāo)記基因WUS[33]和WOX5[34]在水稻中的同源基因OsWUS和OsWOX5進行了表達分析[35-36]。結(jié)果表明,OsWUS和OsWOX5在水稻愈傷中的表達均較高,且它們在野生型日本晴愈傷中的表達水平與OsBBM2較為相似。通過與突變體的比較,我們發(fā)現(xiàn)osmyc2突變體愈傷中OsWUS和OsWOX5的表達與日本晴均存在顯著差異。但是,OsWUS和OsWOX5的表達變化趨勢卻并不相同。OsWUS在osmyc2突變體中的表達明顯下調(diào)(圖3-C),而OsWOX5在osmyc2突變體中的表達則顯著上升(圖3-F),由此表明,OsMYC2基因可能同時影響OsWUS和OsWOX5在水稻愈傷中的表達,但是調(diào)控方向可能是相反的。

綜合以上結(jié)果,可以看出水稻OsMYC2基因缺失后,分化第24天時的愈傷組織中OsERF101、OsBBM2和OsWUS的表達均顯著下降。由于水稻OsERF101與擬南芥ERF115基因的同源,且擬南芥MYC2可通過ERF115影響植株再生。同時,BBM和WUS等基因可以顯著影響擬南芥的再生。因此,我們推測OsMYC2影響水稻愈傷誘導(dǎo)和分化的分子機制與擬南芥較為相似,可能主要通過OsERF101、OsBBM2和OsWUS等基因影響水稻的再生過程。

3 討論

60多年前,Skook等[8]通過對植物組織體外培養(yǎng)成功實現(xiàn)植物再生,從而證明IAA和CTK是控制植物再生的重要激素。而通過對自然界天然形成的植物愈傷的深入研究,人們又發(fā)現(xiàn)另一個激素JA在植物再生過程中扮演關(guān)鍵角色[16-18]。水稻組織培養(yǎng)過程中,成熟胚可在富含IAA和CTK的培養(yǎng)基上成功實現(xiàn)再生,因此IAA和CTK也是影響水稻再生的重要激素,但是JA信號途徑基因是否參與IAA和CTK主導(dǎo)的水稻再生過程人們并不清楚。

OsMYC2是水稻JA信號傳遞途徑中的重要基因之一[21]。在本研究中,我們對JA信號途徑基因OsMYC2對水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和分化的影響進行了探索。當(dāng)JA相對缺乏時,OsMYC2的轉(zhuǎn)錄活性被OsJAZs蛋白抑制;而當(dāng)體內(nèi)JA含量較高時,受體蛋白OsCOI1b在JA的刺激下與OsJAZs結(jié)合,并促使OsJAZs蛋白通過泛素化途徑進行降解,因此OsMYC2的轉(zhuǎn)錄活性獲得釋放,從而激活下游基因的表達[21]。通過基因表達分析,我們發(fā)現(xiàn)OsMYC2基因在水稻愈傷的誘導(dǎo)和分化過程均存在一定量的表達,而且愈傷分化期間的表達量相對較高,尤其是在愈傷分化培養(yǎng)過程的體細胞胚形成高峰期(第12～24 天)OsMYC2基因的表達最為活躍(圖1-B),這些結(jié)果暗示OsMYC2基因可能參與水稻愈傷的誘導(dǎo)和體細胞胚的形成過程。遺傳研究結(jié)果驗證了這一想法,結(jié)果顯示,當(dāng)OsMYC2基因缺失后,水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)效率和胚性愈傷的分化效率均顯著下降(圖2-E),由此表明,OsMYC2對于水稻愈傷組織誘導(dǎo)和分化可能均具有一定促進作用。

在JA影響植株再生的途徑中,擬南芥MYC2的下游基因是ERF115[18]。ERF115也是一種轉(zhuǎn)錄因子基因,序列相似性結(jié)果表明,水稻中存在2個與擬南芥ERF115可能同源的基因OsERF101和OsERF60[30-31]?；虮磉_結(jié)果顯示,osmyc2突變體中OsERF101和OsERF60均顯著下降,而OsERF101下降的相對幅度更大(圖3-A和B),且OsERF101與擬南芥ERF115的相似性較高,因此我們推測,OsMYC2通過OsERF101影響水稻再生的可能性較大。目前,OsERF101是否參與水稻再生過程的研究尚不清楚,相關(guān)的研究結(jié)果尚無報道,因而下一步我們計劃對OsERF101在水稻再生過程中的作用進行研究。由于osmyc2突變體的愈傷分化效率顯著低于野生型對照日本晴,因此我們推測部分參與體細胞胚形成的重要基因可能也受OsMYC2調(diào)控。隨后,我們對OsBBMs和OsWUS等基因[32,35-36]進行了基因表達分析。在擬南芥和玉米等植物中,BBM和WUS基因?qū)w細胞胚的形成具有重要作用。過表達玉米中的BBM和WUS2可以顯著提高玉米、高粱和水稻等作物的體細胞胚的形成效率[37]。本研究的基因表達分析結(jié)果顯示,OsBBM2和OsWUS在osmyc2突變體愈傷中的表達均顯著下降(圖3-C和E),因而我們認為osmyc2突變體愈傷中體細胞形成效率的下降可能與OsBBM2和OsWUS的基因表達顯著下降有關(guān)。啟動子序列分析結(jié)果顯示,OsERF101、OsBBM2和OsWUS基因啟動子上均存在多個OsMYC2蛋白結(jié)合的G-box順式元件,其中OsERF101啟動子上含有的G-box順式元件最多,有15個;而OsBBM2啟動子上含有11個OsMYC2蛋白結(jié)合序列;OsWUS基因啟動子上含有的G-box順式元件較少,只有5個,因此OsMYC2存在直接調(diào)控OsERF101、OsBBM2和OsWUS基因表達水平的可能。我們未來將通過酵母單雜交和EMSA等實驗手段對OsMYC2直接調(diào)控的下游基因進行鑒定和驗證。以上結(jié)果表明,JA信號途徑基因可能參與了水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和分化過程,并在這一過程中起正向促進作用,從而為JA在水稻轉(zhuǎn)基因效率提高中的應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)。