采后黃瓜冷害及耐冷性調(diào)控研究進展

王斌　袁曉　蔣園園　王玉昆　朱世江

摘要： 黃瓜是冷敏型果菜類蔬菜，采后黃瓜在低溫貯藏期間很容易發(fā)生冷害，降低采后品質(zhì)，縮短貯藏壽命，造成較大的采后損失。因此，探明采后黃瓜冷害發(fā)生機制，并有針對性地提出冷害防控措施，是當(dāng)下果蔬采后保鮮研究領(lǐng)域中迫切需要解決的科技問題。近年來，在采后黃瓜冷害防控及耐冷性調(diào)控研究方面取得了一系列進展。本文重點從采后黃瓜冷害癥狀、冷害發(fā)生過程中的生理生化變化和防控技術(shù)等角度，總結(jié)了采后黃瓜冷害及耐冷性調(diào)控研究方面的進展，可以為采后黃瓜的低溫貯藏和冷害防控研究提供借鑒和參考。

關(guān)鍵詞： 采后黃瓜；低溫貯藏；冷害；防控技術(shù)；耐冷性

中圖分類號： S642.2 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0596-13

Research advances in chilling injury and the regulation of chilling tolerance of postharvest cucumber fruit

WANG Bin^1，2， YUAN Xiao²， JIANG Yuan-yuan^1，2， WANG Yu-kun^1，2， ZHU Shi-jiang³

（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Utilization and Conservation of Food and Medicinal Resources in Northern Region， Shaoguan University， Shaoguan 512005， China;2.Henry Fok College of Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan 512005， China;3.College of Horticulture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract： Cucumber is a kind of chilling-sensitive fruit vegetable. Harvested cucumber is subjected to chilling injury under cold storage conditions， which will reduce the postharvest quality and shorten the storage life， and cause great postharvest losses. Therefore， the urgent scientific-technical issue to be solved in the field of postharvest preservation of fruits and vegetables is to ascertain the mechanisms of chilling injury in harvested cucumber and propose purposeful technical measures for the prevention of chilling injury. In recent years， a series of important progresses about prevention technologies of chilling injury and the regulation of chilling tolerance in harvested cucumber have been made. This article comprehensively summarized research advances on chilling injury and chilling tolerance of harvested cucumber fruit， from the perspectives of chilling injury symptoms， physiological and biochemical changes during the occurrence of chilling injury， and prevention techniques. This article can provide references for the research of cold storage technology and prevention technologies of chilling injury in harvested cucumber.

Key words： harvested cucumber;cold storage;chilling injury;prevention techniques;chilling tolerance

黃瓜是葫蘆科黃瓜屬植物，起源于喜馬拉雅山南麓一帶的熱帶雨林地區(qū)，是典型的熱帶、亞熱帶蔬菜作物^[1]。黃瓜最初由絲綢之路開拓者張騫出使西域時帶入中國，目前在世界各地廣泛栽種。中國是黃瓜的主產(chǎn)區(qū)，黃瓜也是中國重要的果菜類蔬菜，是許多省份市銷和出口的主要蔬菜之一^[2-3]。農(nóng)戶及相關(guān)農(nóng)業(yè)企業(yè)種植黃瓜，產(chǎn)生了很大的經(jīng)濟效益和社會效益，有助于鄉(xiāng)村振興。

采后黃瓜組織鮮嫩，含水量高，生理代謝依然旺盛，常溫條件下不耐貯藏^[4]。低溫貯藏可明顯降低采后果蔬的呼吸強度，減少營養(yǎng)物質(zhì)損耗，抑制病原微生物活動，因此，低溫貯運成為保證采后黃瓜品質(zhì)，減少采后損失，并延長貯藏壽命的重要方法之一^[5]。但采后黃瓜對低溫特別敏感，在低于10 ℃的環(huán)境中貯藏會產(chǎn)生冷害^[6]。發(fā)生冷害的采后黃瓜，很容易被致病菌感染，引發(fā)較為嚴重的次生病害，降低采后黃瓜的商品性，造成較大的采后損失^[7]，極大限制了低溫貯運保鮮技術(shù)在采后黃瓜中的應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計，果蔬物流總量中約30%的采后損失是由冷害導(dǎo)致的^[8]。由此可見，探明采后黃瓜冷害發(fā)生機制，有針對性地研發(fā)冷害防控技術(shù)，是當(dāng)下果蔬采后保鮮領(lǐng)域中迫切需要解決的科學(xué)與技術(shù)問題。

近年來，隨著研究方法的迭代升級，分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，以及測序技術(shù)和生物信息學(xué)的廣泛應(yīng)用，相關(guān)科研工作者從生理生化、分子生物學(xué)、組學(xué)（基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組等）等多個層次，深入探究了采后黃瓜冷害發(fā)生及調(diào)控機理，并研發(fā)了許多能有效控制采后黃瓜冷害的保鮮新技術(shù)，但在該領(lǐng)域尚未見近幾年相關(guān)研究成果的綜合性概括與總結(jié)。為此，本文從采后黃瓜冷害癥狀、冷害發(fā)生過程中的生理生化變化和防控技術(shù)等角度，較為全面地總結(jié)了采后黃瓜冷害及耐冷性研究方面的進展情況，以期為采后黃瓜的低溫貯運和冷害防控研究提供借鑒和參考。

1 采后黃瓜冷害及冷害癥狀

影響采后果蔬貯藏期和貨架期的主要因素是貯藏環(huán)境溫度^[9]。低溫貯藏是目前保持采后果蔬品質(zhì)的重要技術(shù)手段之一。但在過低溫度的環(huán)境下貯運時，采后黃瓜會發(fā)生冷害現(xiàn)象^[10]。采后果蔬冷害是由零上低溫導(dǎo)致的物理性傷害，屬于細胞內(nèi)部發(fā)生結(jié)構(gòu)損傷而產(chǎn)生的物理傷害^[11]。在低溫貯藏條件下，冷藏黃瓜的冷害癥狀主要表現(xiàn)為果皮表面出現(xiàn)向果肉內(nèi)部凹陷的水漬狀或點蝕狀斑點（圖1A）。此時，黃瓜果實的冷害癥狀與果刺脫落的癥狀非常相似，不仔細辨別很難區(qū)分開來。區(qū)別在于果刺脫落發(fā)生在果刺凸起的位置，而冷害癥狀主要出現(xiàn)在光滑的果面（圖1A）。冷害嚴重時可能還會發(fā)生脫水現(xiàn)象，且受害部位的顏色明顯加深，斑點逐漸擴大^[11]。關(guān)于采后黃瓜果皮表現(xiàn)出水漬狀凹陷斑點的原因，Tatsumi等^[12]認為是以下多個因素共同作用的結(jié)果：（1）氣孔周圍出現(xiàn)裂縫；（2）包括薄壁組織在內(nèi)的內(nèi)部組織塌陷；（3）氣孔附近表皮細胞下沉，刺激氣孔的蒸騰作用；（4）黏液沉積。

采后黃瓜冷害的嚴重程度主要與貯藏溫度、貯藏時間、品種或基因型，以及采收成熟度等因素有關(guān)。通常而言，貯藏環(huán)境的溫度越低，貯藏時間越久，冷害越嚴重，冷害癥狀也愈加明顯。但短時間的冷激處理反而能提高采后黃瓜的耐冷性，降低冷害發(fā)生^[13]。華北類型黃瓜品種的耐冷性明顯高于華南類型的黃瓜品種^[14-15]。處于早期發(fā)育階段的黃瓜果實更易發(fā)生冷害，而成熟度高的果實有更強的耐冷性^[16]。

發(fā)生冷害的采后黃瓜抗病性明顯降低，容易被環(huán)境中的病原微生物侵染。當(dāng)轉(zhuǎn)移至室溫貨架貯藏時，環(huán)境中的致病微生物通過冷害傷口侵入組織，導(dǎo)致采后黃瓜發(fā)生嚴重的次生病害（圖1B、圖1C），進而迅速腐爛、變質(zhì)。由冷害引起的次生病害癥狀與環(huán)境微生物的類型有關(guān)，若侵入的病原微生物以細菌為主，則組織表現(xiàn)為水樣化潰爛（圖1B）；若侵入的病原微生物以霉菌為主，則發(fā)生冷害部位長滿霉?fàn)钗铮▓D1C）。此時，由于組織嚴重腐爛，造成大量脫水，并產(chǎn)生難聞的酸腐味，采后黃瓜的商品性明顯降低，甚至完全喪失商品價值。通常，采后黃瓜的次生病害并不是由單一類型的微生物引起的，而是由多種細菌性、真菌性微生物共同作用的結(jié)果。次生病害嚴重程度與冷害嚴重程度密切相關(guān)，冷害越嚴重，相應(yīng)的次生病害癥狀也越嚴重。因此，可使用冷害指數(shù)和次生病害病情指數(shù)綜合評估采后黃瓜冷害的嚴重程度^[17]。

2 采后黃瓜冷害發(fā)生過程中的生理生化變化

采后果蔬冷害是細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)漸進性損傷的結(jié)果，最終會引發(fā)一系列的生理功能故障^[8]。在采后黃瓜冷害發(fā)生過程中，在生理生化方面會發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為細胞膜相變、膜脂過氧化、活性氧自由基清除能力下降、呼吸異常升高、能量供應(yīng)不足、激素平衡失調(diào)、滲透性物質(zhì)含量增加、細胞壁降解等。

2.1 細胞膜變化

細胞膜是細胞生命活動賴以延續(xù)的基礎(chǔ)，細胞膜損傷后，將引起組織的生理代謝紊亂。正常情況下，植物細胞膜呈現(xiàn)出液晶態(tài)的流動相，但當(dāng)植物遭遇低溫脅迫后，膜脂逐步向凝膠態(tài)的凝固相轉(zhuǎn)變^[18]。膜脂相變的結(jié)果導(dǎo)致細胞膜流動性降低，細胞膜透性增大，胞內(nèi)的電解質(zhì)向胞外滲漏，細胞內(nèi)外的離子平衡失調(diào)，引發(fā)一系列的代謝過程紊亂^[19]。此外，冷害還會改變鑲嵌在細胞膜上的膜蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致相關(guān)酶活性變化，催化產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)，對細胞產(chǎn)生毒害作用。

采后黃瓜細胞膜透性增大的直接表現(xiàn)是，細胞滲出物的電導(dǎo)值明顯增加^[20]。采后黃瓜細胞膜損傷程度與貯藏低溫、持續(xù)時間密切相關(guān)。貯藏環(huán)境溫度越低，細胞膜損傷的也越嚴重。劉云芬^[21]比較了不同貯藏溫度（0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃和20 ℃）下黃瓜果皮細胞膜透性的變化，發(fā)現(xiàn)0 ℃溫度下貯藏的黃瓜果皮電導(dǎo)率始終大于其他貯藏溫度下的電導(dǎo)率，采后黃瓜在貯藏6 d后，0 ℃和5 ℃條件下貯藏的黃瓜果皮電導(dǎo)率急劇上升，而10 ℃條件下貯藏的果皮電導(dǎo)率增加幅度最小。由此，該作者提出，10 ℃低溫可能是采后黃瓜比較合適的貯藏溫度。陳健華等^[22]也觀察到了類似現(xiàn)象，即貯藏溫度越低，電導(dǎo)率變化越明顯，出現(xiàn)躍變的時間越早，則采后黃瓜冷害發(fā)生得越早；隨著貯藏時間的延長，細胞膜電導(dǎo)率隨之增加，冷害也逐漸加重。這些研究結(jié)果表明，低溫使黃瓜果皮的細胞膜結(jié)構(gòu)遭受了嚴重的物理破壞，導(dǎo)致細胞膜滲透性增大，造成細胞外滲物質(zhì)增加，冷害加劇。

目前，在許多采后果蔬中，比如香蕉、番茄、甜椒、桃子、枇杷、甜瓜等，已證實果實在發(fā)生冷害后，細胞膜的選擇透過能力降低，膜內(nèi)向膜外的離子滲漏明顯增加^[23-28]。由此可知，相對電導(dǎo)率是反應(yīng)采后果蔬冷害嚴重程度的一個可靠指標。由于黃瓜果皮直接與貯藏環(huán)境相接觸，可通過監(jiān)測黃瓜果皮相對電導(dǎo)率在低溫貯藏期間的變化，準確判斷采后黃瓜的冷害程度^[7，20]。

若采后黃瓜在脅迫環(huán)境下保存時間較短，一般不會對細胞膜造成永久損傷，或者損傷后可恢復(fù)到初始狀態(tài)，不產(chǎn)生冷害。但若低溫脅迫環(huán)境持續(xù)的時間過長，將導(dǎo)致細胞膜不可逆的損傷，最終引起胞內(nèi)代謝失調(diào)，細胞功能紊亂，冷害發(fā)生。比如，采后黃瓜在2.5 ℃條件下貯藏18 h，細胞膜透性不會明顯增加，但在2.5 ℃條件下貯藏13 d后，細胞內(nèi)容物大量外滲，細胞膜遭受到不可逆損傷^[29]。采后黃瓜在5 ℃條件下貯藏3 d，未觀察到細胞膜透性的明顯增加，但在貯藏12 d后，采后黃瓜果皮表現(xiàn)出十分明顯的冷害癥狀，且相對電導(dǎo)率大幅增加^{[5，7，17]}。

在冷害發(fā)生的過程中，細胞膜的膜脂組分也會發(fā)生明顯變化^[30]。利用氣相色譜儀分析黃瓜果實的膜脂組分，發(fā)現(xiàn)黃瓜果實細胞膜脂脂肪酸主要由棕櫚酸和硬脂酸2種飽和脂肪酸，以及油酸、亞油酸和亞麻酸3種不飽和脂肪酸組成。其中，飽和脂肪酸中棕櫚酸的相對含量最高，而不飽和脂肪酸主要以亞麻酸和亞油酸為主^[10]。在低溫貯藏過程中，黃瓜果實中2種飽和脂肪酸（棕櫚酸和硬脂酸）和1種不飽和脂肪酸（油酸）的相對含量均逐漸增加，而2種主要不飽和脂肪酸（亞麻酸和亞油酸）含量逐漸降低^[10]。磷脂酶D（PLD）和脂氧合酶（LOX）是采后黃瓜中參與細胞膜脂質(zhì)降解的2個主要脂質(zhì)氧化酶，在低溫貯藏期間，采后黃瓜果實中PLD、LOX活性增加，不飽和脂肪酸含量降低^[31]。這些研究結(jié)果表明，在低溫貯藏期間，采后黃瓜的膜脂不飽和度明顯降低，這可能也是細胞膜流動性下降、滲透性增加的重要原因之一。一些可抑制PLD、LOX活性的采后處理措施，比如熱處理，能提高不飽和脂肪酸相對含量和細胞膜的膜脂不飽和度，從而更有利于保持細胞膜的流動性^{[10，31]}。

2.2 自由基清除能力下降

植物體內(nèi)的活性氧（ROS）自由基主要包括過氧化氫（H₂O₂）、超氧陰離子（O₂^·-）和羥基自由基（·OH）^[11]。采后果蔬細胞內(nèi)具有一套高效的抗氧化防御系統(tǒng)，正常貯藏條件下，自由基含量維持在一個平衡狀態(tài)，機體產(chǎn)生的活性氧等自由基能及時通過抗氧化防御系統(tǒng)清除，避免對細胞造成氧化損傷^[8]。但在低溫貯藏條件下，一方面，低溫脅迫刺激細胞產(chǎn)生大量的活性氧自由基；另一方面，與活性氧清除有關(guān)的抗氧化酶活性降低，活性氧的清除能力下降，使得活性氧不能及時清除。這就導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧含量急劇增加，對細胞膜及其他大分子物質(zhì)造成嚴重的氧化損傷^[32-33]。

許多研究結(jié)果表明，在低溫貯藏期間，采后黃瓜中O₂^·-產(chǎn)生速率和H₂O₂含量隨貯藏時間延長而急劇增加，與活性氧清除有關(guān)的抗氧化酶[如過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）]的活性隨貯藏時間延長而逐漸降低^[4，6-7]。采后黃瓜中非酶類抗氧化物（如抗壞血酸、還原型谷胱甘肽）的含量也隨冷藏時間延長而逐漸下降^[7，34]。一些能增強采后黃瓜抗氧化能力的采后處理措施，能緩解采后黃瓜的冷害，減少活性氧對生物大分子的氧化損傷^[35-36]。說明低溫貯藏會降低采后黃瓜抗氧化酶的活性，抑制非酶抗氧化物的生物合成，從而降低活性氧清除能力。

過量積累的活性氧還會導(dǎo)致細胞膜脂過氧化。4 ℃貯藏的采后黃瓜，在貯藏7 d時，磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量降低，而磷脂酸含量相應(yīng)增加，說明在低溫貯藏過程中，采后黃瓜的膜脂發(fā)生了過氧化反應(yīng)^[37]。丙二醛（MDA）是細胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量與冷害嚴重程度密切相關(guān)，MDA含量越高暗示冷害越嚴重^[38]。有研究結(jié)果表明，在低溫貯藏期間，采后黃瓜的MDA含量隨貯藏時間延長而明顯增加^[11，34]。因此，MDA含量增加也常作為判斷采后黃瓜冷害發(fā)生的重要指標之一，通過監(jiān)測MDA含量變化，可判斷細胞膜脂的過氧化程度，間接反映采后黃瓜冷害情況^[4，7]。這些結(jié)果表明，活性氧等自由基的清除能力下降，使活性氧在細胞中過量積累，對細胞膜及其他生物大分子造成氧化損傷，可能是采后黃瓜發(fā)生冷害的重要原因之一。

2.3 呼吸強度異常升高

采后果蔬仍是有生命的生物體，采收后仍然需要通過呼吸作用，為自身的生命活動提供能量。當(dāng)采后果蔬產(chǎn)生冷害時，呼吸作用一般會異常升高，這可能是因為呼吸鏈中一些酶的活性發(fā)生了改變^[39-40]。若低溫脅迫持續(xù)時間較短，這種呼吸作用異常升高的現(xiàn)象是可逆的；當(dāng)持續(xù)時間達到一定時長，則異常升高的呼吸作用不會降低到正常水平，這與細胞膜損傷的可逆/不可逆修復(fù)是相類似的。比如，將采后黃瓜在5 ℃低溫貯藏4 d，呼吸速率明顯加快，之后貯藏在25 ℃條件下，呼吸強度又恢復(fù)到正常水平。但在低溫下貯藏的時間大于8 d時，呼吸速率不能恢復(fù)到正常水平^[16]。

采后黃瓜發(fā)生冷害時，呼吸代謝異常可能與以下3個方面^[8]有關(guān)：（1）呼吸效率降低，為滿足生命活動所需能量，需要加強呼吸作用；（2）抗氰呼吸途徑被激活，以利于活性氧的清除；（3）發(fā)生了無氧呼吸，導(dǎo)致乙醇、乙醛等有毒產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累，對細胞造成嚴重的毒害作用。呼吸作用加快，使有機物過快消耗，產(chǎn)品品質(zhì)快速下降。同時，過快的呼吸作用還可能導(dǎo)致能量虧缺，使采后黃瓜抵御冷害的能力減弱，最終產(chǎn)生冷害癥狀。

2.4 能量供應(yīng)能力下降

在正常條件下，植物細胞通常能夠合成足夠的能量以維持組織的正常代謝過程^[41]。正如前文所述，在低溫脅迫條件下，采后果蔬的呼吸強度會異常升高，導(dǎo)致能量過度損耗，使線粒體的呼吸活性增強，繼而促進電子傳遞鏈中ROS的產(chǎn)生；而ROS反過來又會造成線粒體氧化損傷，阻斷三磷酸腺苷（ATP）合成進程，進而引起能量供給不足^[8]。較高的能量水平有利于細胞膜脂的合成以及損傷修復(fù)，減緩膜脂的過氧化程度，抑制膜脂相關(guān)降解酶的活性和膜透性的增加，從而較好地維持細胞膜的完整性，提高采后果蔬的抗冷性，延緩冷害發(fā)生^[39]。

有研究結(jié)果表明，在低溫貯藏過程中，隨著冷害的發(fā)生，黃瓜果實內(nèi)ATP、二磷酸腺苷（ADP）含量以及能荷水平明顯下降，一磷酸腺苷（AMP）含量上升，與能量代謝有關(guān)的酶活性降低，比如，H⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase、琥鉑酸脫氫酶（SDH）和線粒體細胞色素C氧化酶（CCO）等，細胞膜脂過氧化加劇，膜透性增加，果皮表面出現(xiàn)嚴重的水漬狀斑點^[42]。使用冷激、外源水楊酸以及兩者的結(jié)合處理，能提高采后黃瓜的能量代謝水平，減少呼吸電子傳遞鏈ROS的產(chǎn)生，從而維持細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，進而提高采后黃瓜抗冷性^[43]。另外，硫化氫（H₂S）處理誘導(dǎo)采后黃瓜耐冷性，減輕冷害癥狀，與提高能量代謝有關(guān)酶活性以及改善能量供應(yīng)密切相關(guān)^[44]。由此可見，采后黃瓜冷害發(fā)生可能與能量供給不足有關(guān)。進一步說明，通過調(diào)控采后黃瓜的能量代謝水平，促進細胞膜功能與結(jié)構(gòu)的恢復(fù)具有減輕采后黃瓜冷害的作用。

2.5 激素水平變化

在采后果蔬響應(yīng)或適應(yīng)低溫脅迫過程中，植物激素起著非常重要的作用。在低溫貯藏初期，采后黃瓜中乙烯的產(chǎn)生量保持在較低水平，但在2.0 ℃低溫環(huán)境貯藏9 d后，黃瓜果實的乙烯釋放量急劇增加^[45]。采后黃瓜在2.5 ℃低溫環(huán)境貯藏14 d時，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）酶活性和ACC氧化酶的活性被明顯誘導(dǎo)，乙烯釋放量增加^[46]。表明冷害發(fā)生過程中乙烯合成速率明顯增加，異常增加的乙烯可能是采后黃瓜對低溫脅迫的一種生理反應(yīng)。采后黃瓜在冷害發(fā)生過程中，除乙烯合成增加外，與內(nèi)源脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）和茉莉酸（JA）等植物激素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的表達被低溫處理抑制或強化，說明植物激素水平在冷害過程中也會發(fā)生變化^[47]。低溫鍛煉或外源ABA處理可提高內(nèi)源ABA含量和采后黃瓜耐冷性，ABA抑制劑處理采后黃瓜能增加冷害指數(shù)^[20]，說明內(nèi)源ABA含量與采后黃瓜冷害發(fā)生密切相關(guān)。以上結(jié)果表明，采后黃瓜冷害發(fā)生可能與內(nèi)源激素合成不足或激素間平衡失調(diào)有關(guān)，尚需更多研究進一步闡明不同植物激素在采后黃瓜冷害發(fā)生過程中的具體作用及其相互作用。

2.6 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加

當(dāng)植物處于逆境脅迫條件下時，為應(yīng)對環(huán)境脅迫，通常會做出應(yīng)激反應(yīng)，來緩解脅迫所造成的傷害^[48]。其中，誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，促進滲透物質(zhì)的合成積累，提高細胞內(nèi)滲透勢，保持胞內(nèi)外滲透平衡，提高細胞的保水力，是植物應(yīng)對低溫脅迫的重要方式之一^[49]。將采后黃瓜貯藏在低溫條件下時，能促使?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，提高細胞內(nèi)的滲透勢，避免細胞因脫水而受到傷害。脯氨酸是植物體內(nèi)最有效的一種親和性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)，在冷害發(fā)生過程中，采后黃瓜中蛋白質(zhì)的降解速率超過合成速率，總蛋白質(zhì)含量下降，但游離氨基酸隨之積累，尤其是脯氨酸含量明顯增加，以保持原生質(zhì)與環(huán)境滲透平衡，防止細胞失水^[50]。外源H₂S處理能提高采后黃瓜耐冷性，與其誘導(dǎo)鳥氨酸δ-氨基轉(zhuǎn)移酶（OAT）、Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性，抑制脯氨酸脫氫酶（PDH）活性，促進脯氨酸的積累有關(guān)^[44]。隨著冷害發(fā)生，采后黃瓜果實中的總可溶性固形物和總可溶性蛋白質(zhì)的含量也隨之增加，階段降溫處理通過誘導(dǎo)可溶性固形物和可溶性蛋白質(zhì)的積累，提高采后黃瓜的抗?jié)B透能力，從而降低冷害發(fā)生率^[4]。多胺是生物體代謝過程中產(chǎn)生的一類低分子量的次生代謝產(chǎn)物，主要包括腐胺（Put）、亞精胺（Spd）和精胺（Spm），具有穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)的功能^[51]。受到低溫脅迫時，黃瓜果實內(nèi)源多胺含量增加，能抑制蛋白質(zhì)的降解，調(diào)節(jié)細胞滲透平衡^[52]。這些研究結(jié)果表明，低溫誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，是采后黃瓜適應(yīng)低溫脅迫的一種方式，當(dāng)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累的量不足以抵御低溫脅迫時，便會產(chǎn)生冷害。

綜上所述，低溫貯藏會誘導(dǎo)采后黃瓜果實中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成積累，以應(yīng)對低溫脅迫，但通常低溫誘導(dǎo)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)不足以抵御低溫脅迫，仍會發(fā)生冷害。因此，采用其他采后處理方式，誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成積累，可能是增強采后黃瓜耐冷性，減少冷害發(fā)生的重要策略。

2.7 細胞壁降解

植物細胞壁主要由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)等多糖大分子物質(zhì)組成^[53]。在纖維素酶（Cx）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、果膠甲酯酶（PME）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）等水解酶的作用下，細胞壁會發(fā)生降解，引起果蔬組織軟化^[54]。采后黃瓜在低溫條件下貯藏時，可能會增強纖維素酶和果膠酶等細胞壁水解酶的活性^[55]。采用適當(dāng)梯度的熱水處理能抑制與細胞壁降解相關(guān)的酶的活性，減少細胞壁組分的降解，從而降低采后黃瓜果實的冷害發(fā)生率^[56]。沈麗雯等^[57]認為，利用熱激處理調(diào)控細胞壁代謝，能提高采后黃瓜耐冷性，減輕冷害癥狀，推測是因為熱激處理抑制了采后黃瓜PG、β-Gal、Cx和PME等細胞壁水解相關(guān)酶的活性，延緩了細胞壁組分的降解，從而維持細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性。由此可見，采后黃瓜冷害的發(fā)生與細胞壁代謝異常有關(guān)。因此，施用一些可調(diào)節(jié)細胞壁降解的物質(zhì)作為采后處理措施，或許能降低采后黃瓜冷害發(fā)生率^[58]。比如，使用一氧化氮、褪黑素、草酸、氯化鈣等處理降低采后果蔬冷害發(fā)生率，都和與調(diào)控細胞壁降解相關(guān)的酶的活性、維持細胞壁完整性有關(guān)^[59-62]。園藝產(chǎn)品采收后，成熟會引發(fā)細胞壁降解，采后黃瓜盡管貯藏在低溫條件下，但成熟進程仍在繼續(xù)，細胞壁降解主要是由成熟引起的還是冷害造成的，尚需更多研究進一步明確，因為提高采后果蔬耐冷性的許多處理措施同樣也能延緩成熟進程^[63-65]。

2.8 果實葉綠體功能損傷

植物葉綠體是進行光合作用的主要器官，采后黃瓜在冷害低溫下貯藏時，葉綠體可能發(fā)生降解，導(dǎo)致葉綠體功能損傷。本課題組近幾年的研究結(jié)果表明，采后黃瓜在5 ℃低溫條件下貯藏時，黃瓜果皮的葉綠素?zé)晒鈴姸群蚉SⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量值會迅速下降^{[4，7，20，47]}。冷馴化處理能提高葉綠素?zé)晒鈴姸?，延緩黃瓜果皮的葉綠體降解速率，增強采后黃瓜耐冷性^{[7， 47]}。這些結(jié)果說明，伴隨著冷害的發(fā)生，葉綠體會發(fā)生降解，電子的傳遞活性被抑制，因此葉綠體降解可能與采后黃瓜冷害發(fā)生有關(guān)。

綜上，采后黃瓜在冷害發(fā)生過程中會發(fā)生許多生理生化變化，除細胞膜變化與冷害的關(guān)系較為明確之外，即膜脂相變可能是冷害發(fā)生的重要原因，其他生理生化變化與冷害的因果關(guān)系還不明了。即這些生理生化變化是由冷害引起的，還是這些變化是導(dǎo)致冷害發(fā)生的原因，目前仍未有確鑿的證據(jù)確認。

3 采后黃瓜冷害防控技術(shù)及生物技術(shù)在調(diào)控采后黃瓜耐冷性中的研究與應(yīng)用

3.1 物理方法

物理方法主要通過調(diào)節(jié)溫度誘導(dǎo)采后黃瓜抗冷性，從而達到控制冷害的目的。據(jù)文獻報道，氣調(diào)貯藏、包裝、高濕貯藏等物理方法，也可以延緩采后黃瓜冷害的發(fā)生。幾種主要的物理防控技術(shù)及其產(chǎn)生的生理效應(yīng)總結(jié)在表1中。

適宜溫度的熱處理是一種有效控制采后果蔬冷害的采后處理方法。關(guān)于熱處理控制采后黃瓜冷害，國內(nèi)外有許多研究報道。熱處理主要通過提高細胞膜脂不飽和度，保持細胞膜流動性和完整性，提高組織抗氧化活性，增強精氨酸合成能力，促進內(nèi)源植物激素（多胺、脫落酸、一氧化氮等）的合成，促進熱激蛋白和可溶性滲透物質(zhì)的積累，從而提高采后黃瓜的耐冷性。比如，將采后黃瓜在39.4 ℃的熱水中處理24.4 min，能誘導(dǎo)4.0 ℃冷藏黃瓜的抗冷性，提高活性氧清除酶的活性，保持細胞膜的完整性，抑制膜脂過氧化進程，從而降低冷藏條件下采后黃瓜的冷害發(fā)生率^[66]。但熱處理不當(dāng)也會對采后黃瓜品質(zhì)產(chǎn)生不利影響，經(jīng)不適溫度或時長的熱處理后，采后黃瓜可能會表現(xiàn)出果皮黃化、組織軟化、產(chǎn)生異味等不良變化^[67]。此外，熱處理還可與其他物理處理（比如包裝、涂膜、短波紫外線照射等）或化學(xué)處理（比如使用過氧化氫、茉莉酸甲酯、草酸等）結(jié)合使用^[68-70]，能明顯提高冷害防控效果。

將采后黃瓜在低溫貯藏前，先在稍高于冷害臨界溫度的環(huán)境中預(yù)貯一段時間，這種處理方法被稱為冷馴化、冷鍛煉或低溫預(yù)貯^{[20，71]}。冷馴化通過誘導(dǎo)采后黃瓜啟動自身抗冷防御系統(tǒng)，增強其對低溫脅迫的適應(yīng)能力，達到減輕冷害的目的^[7，20]。冷馴化處理對采后黃瓜冷害的控制效果與處理溫度和時長有關(guān)。將采后黃瓜在10 ℃條件下冷馴化處理1～3 d，然后再貯藏于5 ℃條件下，經(jīng)過12 d的低溫貯藏，冷馴化處理能有效控制采后黃瓜冷害，且冷馴化處理3 d的效果最好^[7]。本課題組近幾年的研究結(jié)果表明，冷馴化誘導(dǎo)采后黃瓜耐冷性的作用機制，可能與增強抗氧化能力、誘導(dǎo)耐冷相關(guān)基因表達和蛋白質(zhì)積累、激活DNA損傷修復(fù)機制、促進苯丙烷類物質(zhì)的合成等有關(guān)^{[7，20，47，72]}。冷馴化處理激活耐冷性調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，進一步強化耐冷相關(guān)基因的表達，可能也是誘導(dǎo)采后黃瓜耐冷性的重要分子機制^[5]。

間歇升溫是指通過短期升溫處理的方式，中斷低溫脅迫對采后果蔬的持續(xù)性傷害^[73]。一些研究結(jié)果表明，間歇升溫處理降低了采后黃瓜在低溫貯藏期間的乙烯釋放速率和離子滲出，延緩果實表面凹陷和腐爛發(fā)生，提高CAT活性^[74]。同時，間歇升溫處理還能提高冷藏黃瓜的代謝活性，減少冷害過程中有毒物質(zhì)的積累，緩解有害物質(zhì)對采后果蔬細胞的毒害作用^[8]。

此外，冷激處理、短時高壓靜電場處理、臭氧處理、逐漸（緩慢）降溫、高濕貯藏、氣調(diào)貯藏、包裝、可食性涂膜等^{[35，42，75-80]}物理措施，也能有效減少采后黃瓜冷害發(fā)生。這些處理方法既可單獨使用，也可與其他物理或化學(xué)方法聯(lián)合使用，聯(lián)合使用能取得更好的冷害防控效果。

3.2 化學(xué)方法

化學(xué)方法是通過施用一定劑量的化學(xué)藥劑，誘導(dǎo)采后黃瓜的耐冷性，減少冷害發(fā)生?？煽刂撇珊簏S瓜冷害的化學(xué)藥劑總體可分為2類：植物激素類和化學(xué)誘抗劑類。幾種主要的化學(xué)防控方法及其產(chǎn)生的生理效應(yīng)見表2。

植物激素與植物對逆境脅迫的抗性密切相關(guān)，生物學(xué)家據(jù)此探究了不同植物激素對采后黃瓜冷害的防控作用。外源施用多種植物激素，可有效誘導(dǎo)采后黃瓜產(chǎn)生抗冷性，從而減少冷害發(fā)生。已報道的可抑制采后黃瓜冷害的植物激素有：水楊酸、油菜素內(nèi)酯、脫落酸、茉莉酸甲酯、褪黑素等^[20，81-83]。此外，一些類激素化合物也可誘導(dǎo)采后黃瓜的耐冷性，比如6-芐基氨基嘌呤^[84]、一氧化氮^[85-86]、過氧化氫^[87]、H₂S^[88]等。植物激素對采后黃瓜耐冷性的誘導(dǎo)作用，主要是通過激活抗氧化防御系統(tǒng)，影響次生代謝物含量，調(diào)節(jié)細胞膜脂和細胞壁代謝，誘導(dǎo)自身抗冷防御系統(tǒng)，從而提高抗冷性。另外，植物激素還是重要的信號物質(zhì)，可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)耐冷相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)采后黃瓜耐冷性。外源植物激素處理采后黃瓜，還會影響內(nèi)源植物激素的含量和種類，且植物激素間還存在復(fù)雜的相互作用，協(xié)同調(diào)控耐冷反應(yīng)^[72]。

鈣離子是植物生長發(fā)育的必須營養(yǎng)元素，在植物適應(yīng)逆境脅迫的過程中，鈣離子可能以“第二信使”的角色，通過鈣調(diào)蛋白發(fā)揮作用^[89]。外源鈣離子處理能緩解采后黃瓜冷害，其可能通過調(diào)節(jié)細胞壁降解酶和抗氧化系統(tǒng)酶的活性，保持細胞膜完整性^[90]。此外，一些研究指出，外源施用γ-氨基丁酸、L-精氨酸、精胺等化學(xué)物質(zhì)，也可有效抑制采后黃瓜冷害^[91-93]。相比于植物激素，化學(xué)誘抗劑的使用成本要低很多，在采后黃瓜產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用的可行性更高。但隨著消費者對食品安全關(guān)注度的提高，使用化學(xué)誘抗劑時，應(yīng)兼顧考慮食品安全性和冷害防控效果。

3.3 生物技術(shù)在調(diào)控采后黃瓜耐冷性中的研究與應(yīng)用

通過生物技術(shù)將耐冷相關(guān)基因?qū)朦S瓜中，培育耐冷性強的轉(zhuǎn)基因黃瓜新品種，提高采后黃瓜的基礎(chǔ)抗冷性，可能是減少采后黃瓜冷害的關(guān)鍵途徑。隨著基因工程技術(shù)的改進，以及對采后黃瓜耐冷性分子調(diào)控的深入研究，目前已經(jīng)可以利用生物技術(shù)減少采后黃瓜冷害，從而延長采后黃瓜的冷藏保鮮期。

在模式植物（比如擬南芥）耐冷性的研究中，發(fā)現(xiàn)許多基因與植物耐冷性有關(guān)。這些耐冷基因主要包括：抗凍蛋白基因、冷誘導(dǎo)基因、抗氧化酶編碼基因、乙烯合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、CBF（C-repeat binding transcription factor）途徑基因、熱激蛋白等其他功能蛋白基因以及轉(zhuǎn)錄因子、脯氨酸、甜菜堿、小分于糖類等滲透物質(zhì)合成相關(guān)酶編碼基因等^{[49， 94-99]}。在植物中過表達上述基因，均能提高植物抗冷性，尤其是轉(zhuǎn)入低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子基因，能使植物無需冷馴化就具有耐冷特征，這使得培育耐冷性強的黃瓜新品種成為可能^[8]。但在黃瓜中，有關(guān)耐冷基因挖掘及功能鑒定的研究還不夠深入，相關(guān)研究也較少，特別是在與采后黃瓜耐冷性密切相關(guān)的基因方面的研究非常少。與黃瓜耐冷性有關(guān)的基因及潛在功能總結(jié)見表3。

低溫處理誘導(dǎo)黃瓜一氧化氮合酶基因1（NOA1）的表達，擬南芥noa1突變體中過表達CsNOA1，可部分修復(fù)擬南芥noa1突變導(dǎo)致的耐冷性降低，且能誘導(dǎo)可溶性糖和淀粉的積累，上調(diào)CBF基因的表達^[100]。在黃瓜中過表達擬南芥CBF1基因，提高了轉(zhuǎn)基因黃瓜的耐冷性^[101]。ICE1是調(diào)控CBF3基因表達的正調(diào)控因子，過表達CsICE1的轉(zhuǎn)基因黃瓜耐冷性顯著強于野生型，且過表達CsICE1顯著上調(diào)了下游耐冷相關(guān)基因的表達^[102]。在煙草中過表達黃瓜抗壞血酸氧化酶（AOX）編碼基因，能顯著提高AOX活性，降低還原態(tài)抗壞血酸含量和二氧化碳同化速率^[103]。棉子糖系列寡糖（RFOs）是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，肌醇半乳糖苷合成酶（GolS）在調(diào)控RFOs合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用^[104]。黃瓜基因組中共含有4個GolS基因。在多種非生物脅迫處理后，4個黃瓜GolS基因在葉片中的表達顯著上調(diào)，其中GolS1表達上調(diào)能在低溫脅迫條件下促進同化物在韌皮部的裝載，提高葉片光合作用效率，促進RFOs積累^[105]。低溫、干旱脅迫處理誘導(dǎo)黃瓜GolS4在葉片中的表達，過表達GolS4可提高RFOs含量，降低ROS含量；相反，沉默GolS4表達的轉(zhuǎn)基因黃瓜在干旱脅迫處理后，更容易萎蔫^[106]。這些研究結(jié)果表明，通過生物技術(shù)手段培育轉(zhuǎn)基因黃瓜，是提高黃瓜基礎(chǔ)耐冷性的重要途徑。

目前，在采后黃瓜耐冷性的研究中，發(fā)現(xiàn)一些基因可能與黃瓜果實抗冷性密切相關(guān)。黃瓜CsCAT3是一個過氧化氫酶編碼基因，該基因表達與茉莉酸甲酯和一氧化氮誘導(dǎo)的采后黃瓜耐冷性密切相關(guān)，在擬南芥中過表達CsCAT3，能提高擬南芥對活性氧的清除能力^[21]。冷馴化誘導(dǎo)的采后黃瓜耐冷性也可能與CsCAT3表達有關(guān)^[6]。在黃瓜果實中，富甘氨酸RNA結(jié)合蛋白3（GRP3）基因和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1（DDI1）基因的表達可被低溫處理所誘導(dǎo)，在擬南芥中過表達CsGRP3和CsDDI1，能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥抗冷性，并增強對活性氧的清除活性^{[20，72-73]}。進一步研究發(fā)現(xiàn)，低溫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子CsMYB62，可直接與CsGRP3啟動子結(jié)合，激活其表達，表明CsMYB62可能是調(diào)控采后黃瓜耐冷性的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子^{[5，107]}。陳珊等^[108]分析了黃瓜HSF家族基因響應(yīng)冷馴化處理的表達模式，發(fā)現(xiàn)CsHSF7、CsHSF11基因響應(yīng)低溫脅迫，并與黃瓜果實耐冷性有關(guān)，且CsHSF7轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性。低溫處理后，黃瓜CsERF17的表達明顯上調(diào)，CsERF17也具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可激活CsDGK1、CsPLDα1、CsPLDβ1、CsFAD2、CsSAD1和CsSPK1/2等膜脂合成代謝基因的表達^[109]。這些結(jié)果表明，CsCAT3、CsMYB62、CsGRP3、CsDDI1、CsHSF7及CsERF17等基因的表達與采后黃瓜耐冷性密切相關(guān)。

同一基因在不同物種和同一物種不同器官中的功能存在較大差異。COLD1是一個G蛋白偶聯(lián)受體蛋白，與植物耐冷性密切相關(guān)。在水稻中，低溫處理誘導(dǎo)COLD1基因的表達，且COLD1蛋白能與Gα亞基RGA相互作用，激活Ca²⁺通道和G蛋白的三磷酸尿苷酶活性，觸發(fā)下游耐冷防御機制^[110]。在玉米、高粱和斑茅等單子葉植物中也觀察到類似現(xiàn)象，即低溫處理誘導(dǎo)COLD1基因表達^[111-112]。本課題組近期的研究結(jié)果表明，在黃瓜幼苗中，低溫處理不會影響COLD1基因的表達，卻顯著抑制其在果實中的表達，暗示著黃瓜COLD1表達可能與黃瓜耐冷性負相關(guān)^［113］。由此可見，同一基因的功能具有明顯的物種和組織特異性，因此，未來更應(yīng)重點鑒定耐冷相關(guān)基因在采后黃瓜耐冷性中的作用，以期為使用生物技術(shù)培育黃瓜新種質(zhì)提供核心基因資源。

4 展望

黃瓜是中國重要的果菜類蔬菜，在采后貯藏和物流運輸過程中，常因溫度控制不當(dāng)而引起冷害，造成較嚴重的經(jīng)濟損失。因此，研發(fā)采后黃瓜冷害防控技術(shù)，對于保持采后黃瓜貯藏品質(zhì)具有重要意義。其中，闡明采后黃瓜冷害發(fā)生機制，是研發(fā)采后黃瓜抗冷保鮮新技術(shù)的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有的一些理論雖能在一定程度上解釋采后黃瓜冷害發(fā)生機理，但這些理論尚缺乏準確數(shù)據(jù)的支持。比如自由基傷害學(xué)說，一般認為活性氧自由基會對生物大分子造成氧化損傷，損傷后的生物大分子具體形態(tài)是怎樣的？冷害發(fā)生過程中，具體是哪些活性氧自由基被誘導(dǎo)生成？考慮到冷害是由低溫脅迫導(dǎo)致的，后續(xù)研究應(yīng)該重點探究采后黃瓜是如何感知低溫信號，并將低溫信號向下游傳遞，最終對低溫作出抗性反應(yīng)的。這些關(guān)鍵問題的探明，有助于深入揭示采后黃瓜冷害的發(fā)生機制。

現(xiàn)有的可控制采后黃瓜冷害的處理方法主要包括物理方法、化學(xué)方法和生物技術(shù)法。物理方法主要有熱處理、冷馴化、逐漸降溫、高濕貯藏、包裝等，化學(xué)方法主要是使用植物激素或化學(xué)誘抗劑誘導(dǎo)采后黃瓜產(chǎn)生抗冷性，從而減少冷害發(fā)生。從目前的研究情況來看，單一防控技術(shù)雖能降低采后黃瓜冷害發(fā)生，但整體防控效果還不盡如人意，且多數(shù)研究只側(cè)重在試驗條件下的冷害防控效果，對應(yīng)用效果和應(yīng)用成本的考慮還比較少。后續(xù)研究可重點探討物理方法與化學(xué)方法相結(jié)合對采后黃瓜冷害的影響，以提高冷害防控的可靠性，降低應(yīng)用成本?？紤]到這些處理技術(shù)的實際應(yīng)用效果還受到原料品質(zhì)、貯運條件、食品安全性以及保鮮成本等多種因素的制約，因此在后續(xù)的研發(fā)中，應(yīng)兼顧考慮冷害防控技術(shù)的可靠性、安全性、通用性、實用性等要求，提高冷害防控效果，促進采后黃瓜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

盡管一些采后處理可抑制采后黃瓜冷害的發(fā)生，但采后處理通常需要使用專門的處理設(shè)備或藥劑，這會明顯增加生產(chǎn)成本，不利于采后黃瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。通過挖掘具有重要應(yīng)用價值的耐冷基因，并通過分子育種的方法，培育抗冷黃瓜新品種，再結(jié)合采后處理技術(shù)，是減少甚至避免采后冷害的重要途徑。近幾年對黃瓜耐冷性的研究中，初步發(fā)現(xiàn)許多基因具有潛在的應(yīng)用價值。但在離體的采后黃瓜中，耐冷相關(guān)基因的功能，是否與仍處于生長發(fā)育階段的黃瓜類似，目前還未進行系統(tǒng)比較。因此，深度挖掘耐冷相關(guān)基因資源，尤其是與采后黃瓜果實耐冷性密切相關(guān)的基因，并利用生物技術(shù)培育冷敏性低的黃瓜新品種，是未來一段時間的重點研究方向。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)的研究方法，可能是快速、高效篩選耐冷相關(guān)基因的重要研究手段。另外，還可運用多組學(xué)聯(lián)合分析的方法，從遺傳、代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等角度，解析采后黃瓜冷害的發(fā)生機制。最近幾年，以CRISPR-Cas9系統(tǒng)為代表的基因編輯技術(shù)得到快速發(fā)展，并不斷成熟完善，已有在黃瓜中成功編輯特定基因的研究報道^[114]，未來可利用該技術(shù)研究特定基因的功能，以降低消費者對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的顧慮。

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（責(zé)任編輯：王 妮）