轉(zhuǎn)基因在菊花葉肉原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)及亞細(xì)胞定位分析

丁林云　萬可　楊丹　王同　王春梅　郭書巧　楊霞

摘要： 為探究用于亞細(xì)胞定位研究的菊花葉肉原生質(zhì)體分離的最適條件，本研究以菊花無菌苗葉片為受體材料，分析不同葉齡葉片和酶解時(shí)間對菊花原生質(zhì)體細(xì)胞產(chǎn)量的影響，并利用外源質(zhì)粒的導(dǎo)入驗(yàn)證了聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的菊花原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，以組織培養(yǎng)14 d的菊花無菌苗葉片為外植體材料，在含1.5%纖維素酶、0.4%離析酶和0.8 mol/L甘露醇的酶解液中振蕩酶解6 h，能獲得高產(chǎn)的原生質(zhì)體細(xì)胞。采用PEG介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化含綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)載體，在菊花原生質(zhì)體細(xì)胞中觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光信號。結(jié)果顯示，稗草乙烯轉(zhuǎn)錄因子基因（EcERF）在菊花原生質(zhì)體中與本氏煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)一致， EcERF基因定位于細(xì)胞核中。

關(guān)鍵詞： 菊花；原生質(zhì)體；瞬時(shí)表達(dá)；亞細(xì)胞定位

中圖分類號： S682.1⁺¹文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0518-07

Analysis of transient expression of chrysanthemum mesophyll protoplasts and subcellular localization

DING Lin-yun^1，2， WAN Ke³， YANG Dan^1，2， WANG Tong^1，2， WANG Chun-mei^1，2， GUO Shu-qiao^1，2， YANG Xia^1，2

（1.Central Laboratory of Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Institute of Crop Germplasm and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;3.College of Agriculture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： To explore the optimal condition for the separation of mesophyll protoplasts of chrysanthemum for subcellular localization study， leaves of aseptic chrysanthemum seedlings were used as acceptor material in this study to analyze the effects of leaves with different culture times and different enzymatic hydrolysis time on the yield of chrysanthemum protoplast cells， and polyethylene glycol （PEG）-mediated transient transformation system of chrysanthemum protoplasts was verified by leading in exogenous plasmids. The results showed that， protoplasmic cells with high yield could be obtained by shaking enzymatic hydrolysis for six hours in enzymatic hydrolysis solution containing 1.5% cellulase， 0.4% macerozyme and 0.8 mol/L mannitol， using leaves of aseptic chrysanthemum seedlings cultured for 14 days as explants material. A strong green fluorescent signal was observed in chrysanthemum protoplast cells by using PEG mediated expression vector for transient transformation containing green fluorescent protein （GFP）. The results indicated that ethylene transcription factor gene in Echinochloa crusgalli （EcERF） were transiently expressed in chrysanthemum protoplasts and tobacco （Nicotiana benthamiana） leaves， which were both located in the nucleus.

Key words： chrysanthemum;protoplast;transient expression;subcellular localization

菊花（Dendranthema morifolium Ramat.）是菊科菊屬多年生宿根草本植物，其種質(zhì)資源豐富，起源于中國并廣泛栽培于世界各地，具有較高的觀賞、食用、茶飲和藥用價(jià)值，在生產(chǎn)和園林應(yīng)用中具有重要作用^[1-2]。隨著社會發(fā)展及人們生活水平的提高，菊花產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，不斷增長的菊花需求促使科學(xué)家們選育出新型性狀、耐脅迫、品質(zhì)高的菊花品種，然而，菊花的高度雜合性和多倍性給菊花功能基因的鑒定工作增加了難度，給菊花育種工作帶來了很大的挑戰(zhàn)^[3-4]。據(jù)研究，原生質(zhì)體細(xì)胞作為優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)化外植體運(yùn)用于瞬時(shí)表達(dá)分析，可為關(guān)鍵基因的功能研究、轉(zhuǎn)基因研究提供重要的材料基礎(chǔ)，可為菊花育種研究提供重要的技術(shù)手段。

原生質(zhì)體是植物細(xì)胞經(jīng)酶解或機(jī)械去除細(xì)胞壁后分離純化的裸露細(xì)胞，具有細(xì)胞全能性，能夠高效表達(dá)外源DNA^[5]。植物原生質(zhì)體作為功能基因研究的轉(zhuǎn)化受體材料，能夠讓植物細(xì)胞快速增殖和植物再生，廣泛應(yīng)用于植物分子育種、亞細(xì)胞定位、基因啟動子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及蛋白質(zhì)互作等方面^[6-9]。據(jù)報(bào)道，利用原生質(zhì)體的高效瞬時(shí)基因表達(dá)系統(tǒng)在許多植物（包括煙草^[10]、擬南芥和玉米^[11]、水稻^[12]、棉花^[13]、多年生黑麥草^[14]、短梗草^[15]、茶樹^[16]等）中已成功建立原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，在植物的非生物脅迫和生物脅迫等研究中得到了應(yīng)用^[17-18]。菊花中原生質(zhì)體分離和再生體系近幾年才有報(bào)道^[19]，將外源基因轉(zhuǎn)化的菊花原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，并進(jìn)行目標(biāo)基因功能分析的報(bào)道較少^[20]，且不同菊花品種之間可能存在差異。參考擬南芥等模式作物原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，本研究以金絲皇菊菊花品種為轉(zhuǎn)化受體，研究其用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化研究的原生質(zhì)體葉肉分離的最適條件，將帶有綠色熒光蛋白（GFP） 報(bào)告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菊花原生質(zhì)體細(xì)胞，以期進(jìn)行外源基因的亞細(xì)胞定位應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料

菊花品種為金絲皇菊，幼苗來源于江蘇省淮安茹園生態(tài)農(nóng)業(yè)種植基地。將生長至葉片數(shù)為（15±1）張的菊花苗移栽到溫室（25 ℃，16 h光照/8 h黑暗）進(jìn)行盆栽培養(yǎng)，選取完全展開、綠色無病害的菊花植株，取其頂芽培養(yǎng)的無菌苗作為外植體。

煙草品種為本氏煙（Nicotiana benthamiana），種子由本研究室保存。將煙草種子撒播于無菌營養(yǎng)土中，盆栽（26 ℃，16 h光照/8 h黑暗）培養(yǎng)30 d左右，待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菊花無菌苗的培養(yǎng) 選取完全展開的健康菊花葉片頂芽，流水下沖洗2 h；無菌環(huán)境下，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇表面滅菌30 s，用無菌水沖洗；然后用 0.1% HgCl₂浸泡6 min，再用無菌水沖洗5～6次。切割2～3 cm 左右的葉片頂芽并去除葉片，接種于含1.2 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA） +0.3 mg/L萘乙酸（NAA）的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行無菌苗成苗培養(yǎng)。待培養(yǎng)15～30 d后，頂芽伸長并葉片舒展，株高1～2 cm，將伸長芽接種至含0.5 mg/L吲哚丁酸（IBA）的1/2 MS培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，誘導(dǎo)大量不定根生成，獲得菊花無菌苗。

1.2.2 菊花外植體的制備 獲得菊花生根無菌苗后，溫室繼代培養(yǎng)14 d。挑選健康、發(fā)育完全的菊花無菌苗植株，選取長勢良好、大小一致、飽滿圓潤的倒3葉和倒4葉葉片?；诟弋a(chǎn)原生質(zhì)體細(xì)胞的獲得，進(jìn)行外植體最適生長周期的篩選，試驗(yàn)設(shè)置菊花無菌苗不同繼代培養(yǎng)時(shí)間：6 d、10 d、14 d和18 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 菊花原生質(zhì)體細(xì)胞的分離 將1.0～1.5 g無菌苗葉片置于覆蓋濾紙的玻璃培養(yǎng)皿上，用刀片將葉鞘切成1～2 mm的細(xì)絲狀，并迅速浸入配制好的20 ml酶解液[含1.5%纖維素酶R-10、0.4%離析酶R-10、 0.8 mol/L甘露醇、0.2 mol/L 嗎啉乙磺酸鈉（MES）（pH 5.7）、2.0 mol/L NaCl、1.0 mol/L CaCl₂、2.0 mol/L KCl、2.0 mol/L MgCl₂]中，使其充分散開，26 ℃避光，置于搖床輕搖（40 r/min）酶解，至酶解混合液呈現(xiàn)淡綠色，肉眼觀察到沉淀細(xì)胞?？紤]在不同酶解時(shí)間條件下，獲得的原生質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)量有差異，試驗(yàn)設(shè)置了不同梯度的酶解時(shí)間：2 h、4 h、6 h和8 h。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 菊花原生質(zhì)體細(xì)胞的純化與產(chǎn)量檢測 預(yù)先用W5溶液（含2.0 mol/L NaCl， 1.0 mol/L CaCl₂， 2.0 mol/L KCl， 0.2 mol/L MES）浸潤無菌細(xì)胞過濾器（40 μm），過濾酶解混合液至培養(yǎng)皿中，并沿著管壁輕輕加入到50 ml離心管，再吸取20 ml W5溶液潤洗酶解液的燒杯、細(xì)胞篩及培養(yǎng)皿，收集其中殘余的原生質(zhì)體細(xì)胞，與濾液加入到同一個(gè)50 ml離心管輕旋混勻。使用吊籃低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品），1檔升/降速，4 ℃、60 g離心4 min，棄去上清液，加入20 ml W5溶液重懸細(xì)胞，1檔升/降速，4 ℃、60 g離心4 min，棄去上清液。沉淀加入適量的W5重懸細(xì)胞。

取1 ml純凈的原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)行鏡檢，取8 μl滴于載玻片上，用18 mm×18 mm的蓋玻片加蓋，利用熒光顯微鏡進(jìn)行圖片采集，在10倍物鏡視野（640 mm×480 mm）下觀察總原生質(zhì)體數(shù)，生物學(xué)3次重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，取平均值。按植物原生質(zhì)體簡易計(jì)數(shù)法^[21]統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體總密度，原生質(zhì)體總密度（個(gè)，1 ml）=［（1 000÷8）×（18×18÷3.14）］×平均值。

1.2.5 載體制備 將目的基因稗草乙烯轉(zhuǎn)錄因子（EcERF）插入到植物表達(dá)載體pBinGFP4中^[22]，構(gòu)建EcERF：：GFP融合表達(dá)載體，以pBinGFP4空載體為對照，進(jìn)行菊花原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化；并將稗草乙烯轉(zhuǎn)錄因子基因插入到含黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein， YFP）的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-YFP中，構(gòu)建EcERF：：YFP融合表達(dá)載體，進(jìn)行煙草的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。

1.2.6 目標(biāo)基因在菊花原生質(zhì)體中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 加入適量的MMG（0.8 mol/L 甘露醇， 2.0 mol/L MgCl₂， 0.2 mol/L MES）溶液于原生質(zhì)體細(xì)胞沉淀中，混勻后利用吊籃低速離心機(jī)，1檔升/降速，4 ℃、60 g轉(zhuǎn)速離心4 min，棄去上清液。分別將重組質(zhì)粒EcERF：：GFP和空載體pBinGFP4質(zhì)粒各10 μg（1 μg/μl， 10 μl）與原生質(zhì)體細(xì)胞按照體積比1∶30混勻，加入與質(zhì)粒DNA及原生質(zhì)體細(xì)胞混合液等體積的40%聚乙二醇（PEG，4000）溶液。然后，立即輕柔混勻，室溫靜置15 min。再加入2倍體積的W5溶液，輕彈混勻，再次離心。加入2 ml W5溶液，輕彈或顛倒混勻，26 ℃避光，靜置過夜培養(yǎng)8～12 h。

取出過夜培養(yǎng)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)液，1檔升/降速，60 g轉(zhuǎn)速離心4 min，收集沉淀。去除上清液，加入適量的W5溶液重懸原生質(zhì)體。利用激光共聚焦顯微鏡（珀金埃爾默儀器有限公司產(chǎn)品）進(jìn)行觀察，顯示綠色熒光信號的原生質(zhì)體為已成功轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，觀察GFP在菊花原生質(zhì)體細(xì)胞中是否正常表達(dá)，計(jì)算其轉(zhuǎn)化率。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率=綠色熒光視野中原生質(zhì)體個(gè)數(shù)/明場中原生質(zhì)體個(gè)數(shù)×100%。

1.2.7 目標(biāo)基因在煙草中的亞細(xì)胞定位 將EcERF：：YFP載體導(dǎo)入菌株GV3101中，挑取單克隆置于含有卡那霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，4 000 r/min，離心20 min，棄去上清液。用緩沖液[10 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L MES（pH 5.7），200 μmol/L 乙酰丁香酮（AS）]重懸浮2次， 將OD₆₀₀調(diào)至0.5左右。黑暗室溫放置3～4 h，用1 ml的針頭注射器將菌液注入煙草葉片的反面，注射后48～72 h用激光共聚焦顯微鏡觀察，使用細(xì)胞核染料4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）作為細(xì)胞核定位的標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花原生質(zhì)體細(xì)胞體系的制備

選取菊花組培苗幼嫩葉片作為外植體（圖1a）并切成均勻的細(xì)絲，再迅速置于酶解混合液中（圖1b）。充分酶解受體組織，破除細(xì)胞壁并釋放原生質(zhì)體細(xì)胞，收集菊花的原生質(zhì)體沉淀后進(jìn)行純化（圖1c），鏡檢獲得大量的菊花葉片原生質(zhì)體細(xì)胞，并且產(chǎn)生少量碎片（圖1d）。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對菊花原生質(zhì)體細(xì)胞分離的影響

研究結(jié)果表明，在相同的酶解時(shí)間下，不同培養(yǎng)時(shí)間的菊花組培苗獲得的原生質(zhì)體細(xì)胞得率存在顯著差異。參考宋愛華等^[20]的方法選擇酶解時(shí)間4 h、組培時(shí)間6 d的菊花無菌苗的葉片，產(chǎn)生了極少量的原生質(zhì)體（圖2a）；選用培養(yǎng)10 d的組培苗的葉片制備原生質(zhì)體細(xì)胞，獲得的原生質(zhì)體大小均一，且產(chǎn)量顯著增加，細(xì)胞碎片減少（圖2b）；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到14 d時(shí)，獲得原生質(zhì)體的數(shù)量達(dá)到最高值（圖2c）。但是，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，培養(yǎng)18 d的菊花無菌苗獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量卻開始下降（圖2d）。因此，選取培養(yǎng)14 d 的菊花組培苗嫩葉為最佳外植體材料，能獲得純凈原生質(zhì)體細(xì)胞，且數(shù)量可達(dá)1 ml 4.9×10⁵個(gè)（圖3）。

2.3 不同酶解時(shí)間對原生質(zhì)體細(xì)胞分離的影響

不同的酶解時(shí)間對獲得的原生質(zhì)體的產(chǎn)量有較大影響。在滲透壓、葉齡一致的條件下，不同的酶解時(shí)間，原生質(zhì)體的產(chǎn)量有明顯差異。在酶解2 h后，菊花葉片開始變軟，并有少量的原生質(zhì)體細(xì)胞產(chǎn)生（圖4a）；酶解4 h后，游離出的原生質(zhì)體細(xì)胞數(shù)量逐漸增多（圖4b）；酶解6 h后，酶解液的酶解效率最高（圖4c），原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到1 ml 9.4×10⁵個(gè)。但是，酶解8 h后，因已分離出的原生質(zhì)體會破開，細(xì)胞碎片增加，原生質(zhì)體的得率減少（圖4d）。結(jié)果顯示，菊花葉片最適酶解時(shí)間為6 h（圖5）。

2.4 菊花原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化

激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果顯示，在菊花的原生質(zhì)體細(xì)胞的細(xì)胞核、質(zhì)膜等部位均可檢測到綠色熒光（圖6），與同一視野其明場原生質(zhì)體細(xì)胞相比，計(jì)算得出成功轉(zhuǎn)化綠色熒光原生質(zhì)體細(xì)胞的陽性轉(zhuǎn)化率達(dá)91.3%。結(jié)果表明，本研究已將帶有GFP熒光蛋白的空載體質(zhì)粒DNA成功轉(zhuǎn)入菊花原生質(zhì)體中，并進(jìn)行了有效的瞬時(shí)表達(dá)。

2.5 菊花原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的驗(yàn)證

將EcERF：：YFP載體轉(zhuǎn)化煙草，采用DAPI染料作為細(xì)胞核定位標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)與EcERF融合的YFP的熒光信號與DAPI共定位，表明EcERF基因定位于細(xì)胞核中（圖7）。將EcERF基因融合GFP蛋白，在菊花原生質(zhì)體細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，EcERF基因亦定位于細(xì)胞核中（圖8），與該基因在煙草中的定位結(jié)果一致。

3 討論

3.1 高質(zhì)量菊花原生質(zhì)體的制備

在進(jìn)行植物原生質(zhì)體的制備過程中，選擇合適的外植體材料、不同的酶解時(shí)間、合適的滲透壓、不同酶液質(zhì)量濃度或幾個(gè)關(guān)鍵因素組合，對于高質(zhì)量原生質(zhì)體細(xì)胞的獲得至關(guān)重要。本研究利用酶解法分離純化出菊花葉肉的原生質(zhì)體細(xì)胞，對影響制備菊花原生質(zhì)體的上述部分關(guān)鍵因素進(jìn)行探索分析。不同生理狀態(tài)和生長周期的植物外植體，對獲得高產(chǎn)量原生質(zhì)體有著極其重要的影響。本試驗(yàn)選用組織培養(yǎng)14 d的菊花無菌苗，并挑選生長狀態(tài)良好的菊花無菌苗倒3～4葉葉片提取原生質(zhì)體，獲得了1 ml 4.9×10⁵個(gè)以上的原生質(zhì)體。而酶解時(shí)間的長短是獲得高產(chǎn)原生質(zhì)體的另一個(gè)重要條件，植物原生質(zhì)體細(xì)胞的產(chǎn)量會隨著酶解時(shí)間的延長而逐漸下降。在選擇最適培養(yǎng)周期（14 d）的菊花無菌苗的條件下，進(jìn)行最佳酶解時(shí)間的摸索，發(fā)現(xiàn)酶解6 h時(shí)，獲得的原生質(zhì)體的數(shù)量與質(zhì)量均最佳，產(chǎn)量達(dá)1 ml 9.4×10⁵個(gè)；當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到 8 h時(shí)，原生質(zhì)體的數(shù)量呈下降趨勢。在其他試驗(yàn)條件一致的前提下，酶解時(shí)間越長，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜越易受到傷害，產(chǎn)生破碎的細(xì)胞也越多，對細(xì)胞產(chǎn)生的毒害作用亦越大。因此，酶解時(shí)間是否合適是能否獲得優(yōu)質(zhì)的原生質(zhì)體的重要限制因素之一。

3.2 目標(biāo)基因在菊花原生質(zhì)體細(xì)胞中的有效表達(dá)

目前，關(guān)于菊花的轉(zhuǎn)基因功能研究已有很多報(bào)道，如轉(zhuǎn)錄因子基因DgWRKY5^[23]、CmERF053^[24]、ClCBF1^[25]等，在菊花育種上具有很高的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。本研究運(yùn)用已建立的菊花原生質(zhì)體制備及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，對ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因EcERF進(jìn)行亞細(xì)胞定位，EcERF蛋白清晰定位在細(xì)胞核上，表明該體系可用于基因的功能研究。

在進(jìn)行原生質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，原生質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)量的高低直接影響到轉(zhuǎn)化效率。首先，內(nèi)毒素對細(xì)胞具有毒性，在極大程度上影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。為確保目的基因成功轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體細(xì)胞，本試驗(yàn)利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]大量提取重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒，成功轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體；其次，如果載體質(zhì)粒DNA濃度過高或過低，均會影響蛋白質(zhì)的有效瞬時(shí)表達(dá)。本研究通過紫外-可見光全光譜分光光度計(jì)測定的質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度在1 μg/μl以上，OD₂₆0/OD₂₈0為1.8～2.0時(shí)，能夠有效地將目的基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體細(xì)胞。

鑒于菊花的生理特性，結(jié)合菊花外植體的材料選擇，對菊花原生質(zhì)體制備的其他因素進(jìn)行了優(yōu)化。為提高菊花葉肉細(xì)胞的酶解效率，對酶解液進(jìn)行預(yù)處理（55 ℃水浴10～15 min），能夠提高酶的活性，提高破碎植物細(xì)胞壁的效率，大大縮短酶解時(shí)間，降低細(xì)胞毒害，從而減少因細(xì)胞破碎產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，降低亞細(xì)胞的數(shù)量，有助于獲得產(chǎn)量高且大小一致的原生質(zhì)體細(xì)胞。在酶解過程中選擇避光和輕柔振蕩，能夠有效提高酶解效率，大大縮短酶解時(shí)間，為進(jìn)一步高質(zhì)量的基因轉(zhuǎn)化提供基礎(chǔ)。此外，由于原生質(zhì)體是裸露的無細(xì)胞壁的細(xì)胞，極易破裂，離心力大小可能會影響原生質(zhì)體的得率。因此，本研究選擇60 g、1檔升/降速，適宜的離心速度可以減少原生質(zhì)體受外力破壞的程度，有利于獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體細(xì)胞。

4 結(jié)論

綜上所述，以組織培養(yǎng)14 d的菊花無菌苗葉片為外植體，酶解液組合為1.5%纖維素酶、0.4%離析酶和0.8 mol/L甘露醇，26 ℃避光振蕩酶解6 h，獲得高質(zhì)量的菊花原生質(zhì)體細(xì)胞，并成功進(jìn)行了EcERF基因的瞬時(shí)表達(dá)，對EcERF基因在煙草中的亞細(xì)胞定位的結(jié)果進(jìn)行了佐證，證明EcERF蛋白清晰定位于細(xì)胞核中。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）