一株植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌對6種鄰苯二甲酸酯的共代謝降解

楊云　肖霞霞　陳小龍　程金金　余向陽　王亞　馬桂珍

摘要： 從鄰苯二甲酸酯（PAEs）污染的青菜（Brassica rapa var. chinensis）中篩選獲得1株編號為W34的內(nèi)生菌。通過生理生化特征和16S rRNA基因測序?qū)υ摼M行鑒定，并研究W34對6種PAEs的共代謝降解特性，優(yōu)化共代謝降解條件，初步探索共代謝基質(zhì)對W34降解代謝PAEs的影響。結(jié)果表明，內(nèi)生菌W34為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌能以6種PAEs為碳源生長，可同時降解鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）和鄰苯二甲酸二正辛酯（DnOP） 6種PAEs。其中，該菌對DBP和BBP的降解能力較強，20 mg/L質(zhì)量濃度下DBP和BBP的降解半衰期均小于0.33 d。添加D-纖維二糖為共代謝基質(zhì)，W34對DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率均顯著提升。吐溫-80添加量、碳源種類、碳源質(zhì)量濃度和接菌量對這4種PAEs的降解率均有顯著影響。通過單因素試驗，得到該菌的吐溫-80最佳添加量為0.025%，最佳碳源為蔗糖（濃度為20 mmol/L），最佳接種菌液OD₆₀₀為0.3。此外，發(fā)現(xiàn)菌株W34含有質(zhì)粒，但其質(zhì)粒上不含PAEs降解基因，該菌的PAEs降解基因位于細菌的染色體上。菌株W34的粗酶液對6種PAEs均有催化降解活性，蔗糖可顯著提高菌株W34胞內(nèi)酶的催化活性。

關(guān)鍵詞： 內(nèi)生菌；鄰苯二甲酸酯；共代謝；降解途徑

中圖分類號： Q939.96 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0393-12

Co-metabolic degradation of six phthalic acid esters by an endophytic Bacillus subtilis

YANG Yun^1，2， XIAO Xia-xia^1，2， CHEN Xiao-long^2，3， CHENG Jin-jin^2，3， YU Xiang-yang^2，3， WANG Ya^2，3， MA Gui-zhen¹

（1.School of Food Science and Engineering， Jiangsu Ocean University， Lianyungang 222000， China;2.Institute of Agricultural Resources and Environment， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;3.School of the Environment and Safety Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

Abstract： An endophytic bacterium was isolated from phthalic acid esters （PAEs） contaminated Brassica rapa var. chinensis， and was designated W34. The strain was identified by physiological-biochemical and 16S rRNA gene sequencing analyses， and the co-metabolic degradation characteristics of W34 on six PAEs were investigated to optimize the co-metabolic degradation conditions， so as to make preliminary exploration of the effect of co-substrate on the degradation and metabolism of PAEs by strain W34. The results indicated that， the endophytic bacterium W34 was identified as Bacillus subtilis. The strain could utilize six PAEs as carbon sources for growth and could degrade six PAEs in MSM medium at the same time， such as dibutyl phthalate （DBP）， butyl benzyl phthalate （BBP）， dimethyl phthalate （DMP）， diethyl phthalate （DEP）， di-（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP） and di-n-octyl phthalate （DnOP）. Among them， strain W34 exhibited relative higher degradation ability on DBP and BBP compared with the other four PAEs， and the degradation half-life period of DBP and BBP were all less than 0.33 d at mass concentration of 20 mg/L. The degradation rates of DMP， DEP， DEHP and DnOP by strain W34 were all significantly enhanced in MSM medium by adding D-cellobiose as co-metabolizing matrix. Besides， adding amount of Tween-80， type and mass concentration of the carbon source and inoculation dose all had significant effects on the degradation rates of the four PAEs by strain W34. According to the results of single factor experiment， the optimal adding amount of Tween-80 was 0.025%， the best carbon source was sucrose with a concentration of 20 mmol/L， and the most suitable OD₆₀₀for bacterial solution used in inoculating was 0.3. Furthermore， it was found that strain W34 contained plasmids， but its plasmids did not contain PAEs degradation gene， and the degradation gene of W34 was located on the chromosome. The crude enzyme solution of strain W34 showed catalytic and degrading activities on the six PAEs， and the addition of sucrose could significantly improve the catalytic activity of intracellular enzymes in stain W34.

Key words： endophyte;phthalic acid esters;co-metabolism;degradation pathways

鄰苯二甲酸酯（PAEs）是最常見的增塑劑，已從中國大氣、水體、土壤等環(huán)境介質(zhì)中普遍檢出^[1]。PAEs是一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有生殖毒性和“三致”效應(yīng)^[2]。PAEs在環(huán)境中大量積累不但會對農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生不利影響，還可以通過皮膚、呼吸和食物鏈等途徑被人體吸收，對人體健康造成危害^[3]。中國耕地土壤中PAEs主要污染種類為鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）^[4]，污染水平在μg/kg～mg/kg 級，遠高于多環(huán)芳烴（PAHs）、多氯聯(lián)苯（PCBs）等持久性有機污染物^[5-7]。土壤PAEs可被作物根系吸收并向地上部運輸，造成蔬菜可食部位PAEs污染^[1]。珠三角、長三角等地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，中國蔬菜中普遍檢出DBP和DEHP等PAEs，含量最高分別可達17.1 mg/kg和38.1 mg/kg^[7]。因此，如何降低農(nóng)作物PAEs污染、保障農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)安全已經(jīng)成為亟待解決的突出問題。

土壤中PAEs的自然凈化（包括水解、光降解等）過程非常緩慢^[8]，微生物是土壤PAEs降解的主要驅(qū)動者^[9]。目前，國內(nèi)外學者已從各類環(huán)境介質(zhì)中分離獲得不少具有PAEs降解功能的微生物種類，主要包括真菌、放線菌、藻類和細菌等^{[1， 10-13]}。其中，細菌是研究報道最多的PAEs降解微生物類群^[14]，但多數(shù)研究主要關(guān)注土壤細菌對PAEs的降解代謝，對具有PAEs降解功能的內(nèi)生菌的研究較少^[15]。Feng等^[15]從植物體內(nèi)分離獲得一株具有DBP降解功能的巨大芽孢桿菌YJB3，發(fā)現(xiàn)接菌后菜心對DBP的積累和轉(zhuǎn)運能力均顯著降低，說明內(nèi)生菌可以促進蔬菜體內(nèi)PAEs的降解，從而降低蔬菜PAEs污染。針對PAHs、毒死蜱等有機污染物的研究結(jié)果也表明，利用植物內(nèi)生菌同時消減土壤和植物體內(nèi)的有機污染物具備可能性^[16-17]。

共代謝是微生物協(xié)同植物降解有機污染物的重要途徑^[18]。微生物共代謝是指只有在初級能源物質(zhì)存在的條件下才能進行的有機物生物降解過程，其中提供碳源或能源的物質(zhì)為第一底物，被共代謝的污染物為第二底物^[19]。內(nèi)生菌入侵植物后，植物體內(nèi)的有機污染物濃度很難維持微生物細胞生長繁殖，植物光合作用產(chǎn)生的糖類、有機酸和氨基酸等碳源可為內(nèi)生菌提供生長所需的基質(zhì)^[18]，從而提高內(nèi)生菌活性并加速植物體內(nèi)污染物的降解。研究結(jié)果表明，微生物可以通過共代謝途徑促進高分子量、難降解多環(huán)芳烴[比如芘、苯并（a）芘]的降解^[20-21]。然而，共代謝底物對內(nèi)生菌降解PAEs的影響研究較少^[15]。開展內(nèi)生菌對PAEs的共代謝降解及機制研究，對于促進PAEs污染植物的微生物修復有重要的理論和現(xiàn)實意義。

基于此，本研究從被PAEs污染的植物體內(nèi)分離鑒定獲得1株內(nèi)生枯草芽孢桿菌W34，以糖類為共代謝底物，探索了W34對6種PAEs [DBP、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、DEHP和鄰苯二甲酸二正辛酯（DnOP）]的共代謝降解特性，優(yōu)化了共代謝降解條件，初步解析了糖類對內(nèi)生菌PAEs代謝途徑的影響。研究結(jié)果可以豐富污染物脅迫下植物與內(nèi)生菌的互作模式及理論，可為未來揭示植物與其內(nèi)生菌協(xié)同降解PAEs的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本來源 供試作物為上海青（Brassica rapa var. chinensis），采集自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院一處PAEs污染試驗田，試驗田土壤和上海青中的PAEs污染種類均為DMP、DEP、DBP、BBP和DEHP。其中，土壤中DMP、DEP、DBP、BBP和DEHP含量分別為1.180 mg/kg、0.980 mg/kg、1.000 mg/kg、2.790 mg/kg和88.400 mg/kg；上海青根系中DMP、DEP、DBP、BBP和DEHP含量分別為1.390 mg/kg、0.374 mg/kg、2.510 mg/kg、0.685 mg/kg和62.100 mg/kg，莖葉中DMP、DEP、DBP、BBP和DEHP含量分別為0.617 mg/kg、0.135 mg/kg、1.360 mg/kg、0.143 mg/kg和34.400 mg/kg，從上海青的根系和莖葉中分離能以美國EPA規(guī)定的6種優(yōu)控PAEs（DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP）為碳源或能源的內(nèi)生細菌。

1.1.2 主要試劑 DMP（純度99.0%）、DEP（純度99.5%）、DEHP（純度99.0%）標準品購自上海麥克林生化科技有限公司，BBP（純度99.5%）、DnOP（純度98.0%）標準品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DBP（純度99.5%）標準品購自上海凌峰化學試劑有限公司，無水硫酸鎂（分析純）、氯化鈉（分析純）購自西隴化工股份有限公司，色譜純乙腈購自德國Merck公司；色譜級正己烷購自北京邁瑞達科技有限公司；16S rRNA序列擴增引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 無機鹽液體培養(yǎng)基（1 L）：0.40 g MgSO₄·7H₂O，0.20 g K₂HPO₄，0.20 g （NH₄）₂SO₄，0.08 g CaSO₄，去離子水定容至1 000 ml，pH值為7.2±0.2。

液體富集培養(yǎng)基（1 L）：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水定容至1 000 ml。

固體富集培養(yǎng)基：在上述液體富集培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g/L，pH值為7.0～7.2。以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下，高壓蒸汽滅菌20 min后備用。

1.1.4 儀器設(shè)備 SW-CJ-1D 凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品），F(xiàn)ive go便攜式pH 計（梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品），Millipore 超純水機（美國 Merck Millipore 公司產(chǎn)品），冷凍干燥機（德國 CHRIST 公司產(chǎn)品），高通量樣品磨樣機（CK-2000，北京托摩根生物有限公司產(chǎn)品），氣相色譜儀[島津企業(yè)管理（中國）有限公司產(chǎn)品]，掃描電子顯微鏡[卡爾蔡司光學（中國）有限公司產(chǎn)品]。

1.2 PAEs降解菌的篩選與純化

將被PAEs污染的上海青分為根和莖葉2部分，分別用自來水沖洗干凈后晾干。在超凈工作臺內(nèi)剪成1～2 cm的小段，在2.5% NaClO溶液中浸潤5 min，用無菌水清洗5次，清洗干凈后，用75%的乙醇浸沒樣品5 min，用無菌水沖洗5次。表面消毒完成后，取最后一次清洗液100 μl，至液體富集培養(yǎng)基中，用搖床在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng) 24 h，LB培養(yǎng)液未出現(xiàn)渾濁則認為表面消毒徹底。將表面消毒后的樣品置于滅菌的研缽中研磨，吸取研磨后的組織液100 μl，轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，菌液經(jīng)6 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，用無菌無機鹽培養(yǎng)液清洗3次后重懸于MSM培養(yǎng)液中，取50 μl菌懸液，在含有20 mg/L 6種PAEs的無機鹽平板上均勻涂布，30 ℃避光培養(yǎng)1～3 d。挑取培養(yǎng)皿中生長良好的單菌落，在以PAEs為碳源的無機鹽固體培養(yǎng)基上劃線進行分離純化，篩選獲得1株能連續(xù)5次以PAEs為碳源生長的菌株并命名為W34，保存于固體富集培養(yǎng)基斜面上，供進一步研究。

1.3 內(nèi)生菌W34的鑒定

菌落形態(tài)：將菌株在固體富集培養(yǎng)基上劃線，置于培養(yǎng)箱30 ℃的條件下培養(yǎng)1～3 d，觀察菌株形態(tài)特征。

細菌形態(tài)：將菌株W34接種于液體富集培養(yǎng)基中，置于搖床30 ℃、180 r/min條件下富集12 h，6 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集菌體，用 20 mmol/L的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH 7.2）清洗菌體3次，每次10 min。向菌體中加入終含量2.5%的戊二醛，混勻后室溫下浸泡過夜，7 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集菌體，依次用50%、70%、80%、90%的乙醇清洗1次，每次浸泡10 min，最后用100%乙醇浸泡3次，每次30 min。通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察W34的形態(tài)特征。

細菌16S rRNA 測序與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：使用試劑盒提取細菌的DNA，以DNA為模板，用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，正向引物為27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′），反向引物為1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應(yīng)體系（30 μl）：1 μl模板、1 μl正向引物（10 μmol/L）、1 μl反向引物（10 μmol/L）、22 μl的1.1×T3 Super PCR Mix和5 μl ddH₂O。PCR反應(yīng)程序：98 ℃? 3 min；98 ℃ 10 s，55～58 ℃? 10 s，72 ℃ 10 s，35個循環(huán)；72 ℃ 2～5 min。PCR產(chǎn)物的純化和測序由南京擎科生物科技有限公司完成，測序方式為雙向測序。測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的基因序列進BLAST比對，選取相似性較高（≥99%）的菌株序列，用 MEGA 6.0軟件進行多序列比對和遺傳距離計算，用鄰接法構(gòu)建W34的系統(tǒng)進化樹。

1.4 菌株生長曲線的測定

挑取活化后的菌株至液體富集培養(yǎng)基中，搖床30 ℃、180 r/min的條件下富集30 h ，每隔2～4 h取樣測OD₆₀₀，以O(shè)D₆₀₀值為縱坐標、生長時間為橫坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.5 菌株P(guān)AEs降解特性研究

1.5.1 共代謝降解試驗 實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，向MSM培養(yǎng)基中添加D-纖維二糖等外源碳源可促進多類細菌共代謝降解PAEs。以W34為供試菌株，以D-纖維二糖為生長基質(zhì)，以PAEs為共代謝底物，開展共代謝降解試驗。取純化后的菌株至液體富集培養(yǎng)基中，用搖床在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)30 h，菌液經(jīng)6 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，菌體用MSM溶液清洗3次，將菌懸液加入50 ml滅菌的玻璃錐形瓶中（含20 ml MSM液體培養(yǎng)基），調(diào)節(jié)菌液初始OD₆₀₀=0.1，依次添加終濃度為0.1%吐溫-80（助溶劑）和10 mmol/L的D-纖維二糖，最后加入6種PAEs的混標溶液使MSM中PAEs終質(zhì)量濃度為20 mg/L，以不加D-纖維二糖的處理為對照組。將50 ml的玻璃錐形瓶密封后置于搖床中，30° C、180 r/min培養(yǎng)，3 d后取樣檢測MSM中PAEs的質(zhì)量濃度變化。

1.5.2 共代謝降解條件優(yōu)化

1.5.2.1 吐溫-80添加量對PAEs降解率的影響 設(shè)置單因素試驗，考察共代謝條件下，吐溫-80添加量對W34生長及PAEs降解的影響。W34在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，將菌液離心獲得菌體后，用無菌MSM溶液清洗3次，菌液重懸后轉(zhuǎn)入20 ml的MSM液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液初始OD₆₀₀為0.1，加入6種PAEs標準品，使其終質(zhì)量濃度為20 mg/L，加入終濃度為10 mmol/L的D-纖維二糖，添加不同量的吐溫-80（添加量為0.010%、0.025%、0.050%和0.100%）。錐形瓶密封后置于搖床30 ℃、180 r/min培養(yǎng)，以不加菌液的MSM培養(yǎng)基為對照，每個處理重復3次。培養(yǎng)3 d后取樣測定培養(yǎng)液中6種PAEs的含量。

1.5.2.2 碳源種類對PAEs降解率的影響 菌株W34經(jīng)富集培養(yǎng)、MSM清洗后重懸于MSM液體培養(yǎng)基中，用酶標儀調(diào)整菌液初始OD₆₀₀為0.1，依次加入終質(zhì)量濃度為 20 mg/L的6種PAEs、終含量為0.025%的吐溫-80，添加終濃度為10 mmol/L的不同碳源（D-葡萄糖、D-果糖、D-纖維二糖、麥芽糖和蔗糖）。置于搖床30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d，以不加菌液的MSM培養(yǎng)基為對照，每個處理重復3次。在培養(yǎng)3 d時取樣測定6種PAEs的含量。

1.5.2.3 碳源添加量對PAEs降解率的影響 將菌液重懸于無機鹽培養(yǎng)基中，調(diào)整OD₆₀₀=0.1，加入終質(zhì)量濃度為 20 mg/L的6種PAEs標準品，加入終含量為0.025%的吐溫-80，設(shè)置不同的蔗糖添加濃度（0 mmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和50 mmol/L），錐形瓶置于搖床中30 ℃、180 r/min培養(yǎng)，以不加菌的MSM培養(yǎng)基作為空白對照，每個處理重復3次，于培養(yǎng)3 d時取樣測定6種PAEs的含量。

1.5.2.4 接菌量對PAEs降解率的影響 將W34菌液重懸于無機鹽培養(yǎng)基中，設(shè)置不同的初始OD₆₀₀值（0.05、0.10、0.20、0.30、0.40和0.50）。然后依次加入終含量為0.025%吐溫-80，終質(zhì)量濃度為20 mg/L的6種PAEs，添加20 mmol/L的蔗糖，置于搖床30 ℃、180 r/min培養(yǎng)，每個處理重復3次，培養(yǎng)3 d后取樣測定6種PAEs的含量。

1.5.2.5 不同初始濃度下W34對6種PAEs的降解率 在最優(yōu)條件下，研究了W34在不同初始PAEs濃度下的降解率。菌株W34經(jīng)富集培養(yǎng)、用MSM培養(yǎng)基清洗后轉(zhuǎn)入MSM培養(yǎng)基，調(diào)整初始OD₆₀₀=0.3，加入0.025%吐溫-80、20 mmol/L蔗糖，向MSM培養(yǎng)基中添加6種PAEs混合標準溶液使初始PAEs質(zhì)量濃度分別為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L，將錐形瓶置于搖床30 ℃、180 r/min培養(yǎng)。每個處理重復3次，分別在8 h、1 d、3 d、5 d和7 d時取樣測定6種PAEs的殘留量并計算半衰期。PAEs降解率計算公式為：（對照組PAEs含量-試驗組PAEs含量）/對照組PAEs含量。PAEs半衰期計算方法參考Cheng等^[22]的方法。

1.6 PAEs代謝途徑分析

1.6.1 菌株W34質(zhì)粒的PAEs降解特性 為探明W34降解PAEs的基因位置（質(zhì)?；蚣毦蚪M），提取W34的質(zhì)粒并將質(zhì)粒DNA導入DH5α，驗證含細菌質(zhì)粒的DH5α對PAEs的降解特性。

質(zhì)粒提?。簩34菌株轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，取2 ml菌液，采用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取質(zhì)粒，設(shè)置4組平行，取8 μl質(zhì)粒，加入2 μl的5×Loading buffer，混勻。在1.0%的瓊脂糖凝膠條件下進行電泳檢測，電壓設(shè)定為130 V。通過凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，與Marker比較確定質(zhì)粒大小。

質(zhì)粒DNA導入大腸桿菌：取100 μl感受態(tài)細胞（DH5α），加入質(zhì)粒，輕輕搖勻，在0 ℃冰浴中靜置25 min，42 ℃水浴熱激42 s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，靜置2 min，向2 ml的離心管中加入500 μl的無菌培養(yǎng)基，混勻后37 ℃、200 r/min復蘇1 h，吸取50 μl的復蘇液，均勻涂布于PAEs質(zhì)量濃度為20 mg/L的MSM固體平板上，將平板倒置，用37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后挑取單菌落，保存于固體富集培養(yǎng)基斜面上備用。

PAEs降解試驗：將含質(zhì)粒的DH5α單菌落和未導入質(zhì)粒的DH5α（對照）分別接于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，菌液離心獲得菌體后，用MSM培養(yǎng)基清洗3次，將不含質(zhì)粒和含質(zhì)粒的DH5α分別重懸于20 ml的MSM培養(yǎng)基中，調(diào)整OD₆₀₀=0.1，加入0.025%吐溫-80、終質(zhì)量濃度為20 mg/L 的6種PAEs，設(shè)置加糖（20 mmol/L蔗糖）和不加糖2組處理，以不加菌液的MSM培養(yǎng)基為CK，在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3 d，取樣測定MSM培養(yǎng)液中的PAEs含量。

1.6.2 粗酶液對6種PAEs的降解 胞內(nèi)粗酶液制備：將W34菌株接種于200 ml的LB中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)16 h。離心收獲菌體，用MSM培養(yǎng)基清洗3遍，重懸于75 ml MSM培養(yǎng)基中，添加終含量為0.025%的吐溫-80、20 mmol/L的蔗糖，不加糖的處理為對照組。搖床30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3 d，離心后獲得菌體，-20 ℃冰箱中保存 2 h后，取出菌體于滅菌研缽中，依次加入液氮和20 mmol/L的PBS進行研磨，獲得胞內(nèi)粗酶液并轉(zhuǎn)入5 ml容量瓶中用PBS定容，置于冰浴中保存?zhèn)溆谩?/p>

胞外粗酶液制備：同批次試驗中，待菌株W34在MSM培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d后，取50 ml的MSM培養(yǎng)液，離心去除菌體，0.45 μm過濾除菌后，將菌液置于-20 ℃冰箱凍存2 h，然后于冷凍干燥機中凍干。凍干物用5 ml 20 mmol/L PBS復溶，即制備獲得胞外酶液。

PAEs體外降解試驗：分別取2 ml胞內(nèi)和胞外粗酶液，轉(zhuǎn)入10 ml玻璃試管中，添加使PAEs終質(zhì)量濃度為 10 mg/L 的6種 PAEs標液（1 000 mg/L，溶劑為乙腈）20 μl。用無菌橡膠塞密封后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h后，向試管中添加2 ml正己烷提取PAEs，使用氣相色譜儀分析粗酶液中PAEs殘留量。

1.7 PAEs的提取和檢測分析

采用島津GC-2030氣相色譜儀檢測6種PAEs含量。PAEs提取方法：參考Feng等^[23]的方法，并略作修改。在玻璃管中加2 ml菌液，加入2 ml正己烷，樣品充分渦旋10 min后40 Hz超聲10 min，3 000 r/min離心5 min后，取上清液，通過氣相色譜儀測定 6種PAEs的濃度。

島津GC-2030方法條件：色譜柱DB-5 MS（30.0 m×250 μm×0.25 μm），氫火焰離子化檢測器（FID）。載氣為高純氮氣。進樣口溫度為280 ℃，流速為1.0 ml/min，進樣量為1 μl。色譜柱升溫程序為：100 ℃保持1 min，20 ℃/min升至220 ℃ 保持1 min，20 ℃/min升至280? ℃ 保持 3 min。

質(zhì)量控制：為確認方法準確度，向MSM液體培養(yǎng)基中添加6種 PAEs 的標準溶液，使PAEs的終質(zhì)量濃度分別為1 mg/L和20 mg/L，每個質(zhì)量濃度3次重復，按照上述提取方法進行回收率試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種PAEs的平均加標回收率為96.2%～105.3%，相對標準偏差為2.4%～6.7%，結(jié)果表明，該提取方法回收率和穩(wěn)定性較好，適用于試驗樣品中 PAEs 的提取和測定。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和GraphPad Prism 8.0繪制圖表。用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，不同試驗組間差異比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或Tukeys 多重比較法進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAEs降解菌的分離篩選與鑒定

經(jīng)分離純化獲得1株能以6種優(yōu)控PAEs（DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP）為碳源和能源生長的植物內(nèi)生菌，命名為W34。由圖1a可知，菌株菌落為傘狀，菌落表面粗糙、不透明、有褶皺。由圖1b可知，通過掃描電鏡，觀察到該菌株的形態(tài)為短桿狀，菌體長1.0～1.5 μm。通過16S rRNA基因測序，獲得1.4 kb的16S rRNA基因片段，將測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST比對，結(jié)果顯示該菌株（登錄號為OM232111）的基因序列與芽孢桿菌屬的基因序列有 99% 的相似性。用鄰接（NJ）法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1c），發(fā)現(xiàn)菌株 W34與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） DSM 10、B.subtilis JCM 1465和B.subtilis NBRC 13719親緣關(guān)系最近。因此，W34鑒定為枯草芽孢桿菌。如圖1d所示，在液體富集培養(yǎng)基中菌株W34在6 h后進入對數(shù)生長期并持續(xù)約8 h，14 h后生長速率下降；16 h后菌株達到最大生長速率，開始進入穩(wěn)定期。因此，選擇12 h菌齡的W34開展PAEs降解特性研究。

2.2 菌株W34對6種PAEs的降解特性

2.2.1 菌株W34的降解譜 為確定菌株W34對6種PAEs的降解特性，向MSM培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為20 mg/L的PAEs，脅迫培養(yǎng)3 d后檢測培養(yǎng)液中6種PAEs的殘留量并計算W34對PAEs的降解率。如圖2所示，菌株W34對DBP和BBP的降解效果較好，降解率均為100%；W34對DMP、DEP、DEHP和DnOP也有一定的降解能力，降解率分別為23%、42%、30%和34%。此外，不加菌的CK組，3 d后6種PAEs的自然降解率均低于6.7%，說明加菌組MSM中PAEs的降解主要來自W34的生物降解作用。

2.2.2 D-纖維二糖對W34 降解PAEs的影響 以不接菌的處理為對照，研究接種W34（W34）和接種W34并添加D-纖維二糖（W34+D-纖維二糖）處理條件下，菌株W34對6種PAEs的降解率及差異。如圖3所示，20 mg/L的PAEs脅迫培養(yǎng)3 d后，W34和W34+D-纖維二糖處理組，DBP和BBP的降解率均為100%；與對照比，W34處理組DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率為26.2%～41.8%，添加D-纖維二糖后這4種PAEs的降解率均顯著提高。

2.3 共代謝降解條件的優(yōu)化

2.3.1 吐溫-80對菌株W34降解率的影響 如圖4所示，不同吐溫-80添加量處理對DBP和BBP的降解率均為100%；對DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率隨著吐溫-80含量增加，均呈先上升后下降的趨勢。當吐溫-80含量為0.025%時，W34對6種PAEs 降解率達最大值（降解率分別為26.8%、63.8%、100.0%、100.0%、65.4%和68.3%），因此吐溫-80最佳添加量為0.025%。

2.3.2 碳源種類對菌株W34降解率的影響 在吐溫-80最優(yōu)濃度條件下，研究不同碳源種類對6種PAEs降解率的影響。如圖5所示，添加不同碳源后，W34均能完全降解DBP和BBP。此外，碳源種類對DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率有顯著影響。添加蔗糖時，DEP、DEHP和DnOP的降解率分別為60.6%、60.2%和63.1%，顯著高于其他4種碳源，因此選擇蔗糖為最優(yōu)碳源種類。

2.3.3 碳源添加量對菌株W34降解率的影響 在吐溫-80最優(yōu)添加濃度和最優(yōu)碳源種類條件下，研究不同蔗糖添加量對6種PAEs降解率的影響。如圖6所示，隨著蔗糖濃度的升高，W34對DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率先上升后降低。當蔗糖添加濃度為20 mmol/L時DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率分別達40.6%、65.4%、72.6%和80.7%，且顯著高于其他蔗糖濃度下PAEs的降解率。 本研究發(fā)現(xiàn)，0 mmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和50 mmol/L蔗糖濃度下，培養(yǎng)3 d后的菌液OD₆₀₀分別為0.091、0.198、0.574、0.782、0.995和1.332，說明隨著蔗糖添加量增加，菌株W34的繁殖速度呈增加趨勢。

2.3.4 接菌量對菌株W34降解率的影響 在吐溫-80最優(yōu)添加量、最優(yōu)碳源種類和最優(yōu)碳源濃度條件下，研究不同接菌量對6種PAEs降解率的影響。如圖7所示，6種PAEs的降解率整體上隨著初始接菌量的增加而升高，說明細菌生物量增加可促進PAEs降解。當接菌OD₆₀₀值為0.30時，6種PAEs的降解率均達較大值，其中，DMP和DEP的降解率分別為55.3%和90.5%，而DBP、BBP、DEHP和DnOP均被完全降解。因此，選擇OD₆₀₀=0.3為最優(yōu)初始接菌量。

2.3.5 不同初始PAEs質(zhì)量濃度下菌株W34的PAEs降解效率 在最優(yōu)降解條件下，研究不同濃度PAEs培養(yǎng)3 d后W34對6種PAEs的降解能力。如圖8所示，所有處理組的DBP和BBP被完全降解。隨著PAEs處理質(zhì)量濃度增加，DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率降低。此外，除DBP和BBP外的其他4種PAEs在MSM液體培養(yǎng)基中的降解動態(tài)均符合一級動力學方程C_t=C₀e^-kt[22]。如表1所示，W34菌株對DBP和BBP的降解能力較強，20 mg/L處理質(zhì)量濃度下DBP和BBP的降解半衰期均小于0.33 d。隨著PAEs質(zhì)量濃度增加，DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解半衰期呈增加趨勢，暗示隨著PAEs脅迫質(zhì)量濃度增加，W34對PAEs的降解效率下降。

2.4 PAEs的降解途徑分析

2.4.1 菌株W34質(zhì)粒對PAEs的降解 如圖9所示，W34菌株存在質(zhì)粒，其基因片段約為2 000 bp。將W34的質(zhì)粒導入大腸桿菌DH5α，以未導入質(zhì)粒DNA的DH5α為對照，研究加糖（20 mmol/L蔗糖）和不加糖處理條件下DH5α對6種PAEs的降解能力。如圖10所示，與不加蔗糖的對照比，添加蔗糖作為共代謝碳源后，DH5α（含質(zhì)粒）和DH5α（不含質(zhì)粒）處理組DBP和BBP的質(zhì)量濃度均顯著下降，說明加糖可能促進DH5α對PAEs的降解或通過增加細菌生物量促進DH5α對PAEs的吸附。然而，在加糖條件下，DH5α（含質(zhì)粒）和DH5α（不含質(zhì)粒）處理組中DBP和BBP的含量無顯著差異，說明W34質(zhì)粒DNA中不含PAEs降解基因，該菌的PAEs降解基因位于細菌染色體上。

2.4.2 W34粗酶液對6種PAEs的降解作用 分別研究加糖（20 mmol/L蔗糖）與不加糖處理組，W34的胞外和胞內(nèi)粗酶液對6種PAEs的降解特性。與不加糖的對照比，加糖處理組W34胞外粗酶液中DBP、BBP、DEHP和DnOP質(zhì)量濃度顯著高于不加糖組（圖11A），說明加糖處理組胞外粗酶液中的降解酶含量或活性顯著低于不加糖組；與此相反，加糖處理組W34胞內(nèi)粗酶液中6種PAEs質(zhì)量濃度顯著低于不加糖處理（圖11B），說明加糖處理組胞內(nèi)粗酶液的合成量或活性顯著增加或胞內(nèi)降解酶向胞外分泌量顯著下降。此外，不加糖處理條件下，W34的胞外酶對DBP和BBP的降解率顯著高于胞內(nèi)酶，而加糖處理組則相反，說明糖類作為共代謝碳源可能減少了胞內(nèi)降解酶系向胞外分泌，從而加速了PAEs的胞內(nèi)降解過程。

3 討論

PAEs是中國土壤中的主要有機污染物之一，其對生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品安全均構(gòu)成了嚴重威脅^[1，15]。研究結(jié)果表明，細菌是土壤PAEs消減的主要驅(qū)動力^[9]，向土壤中添加PAEs降解菌可明顯加速土壤PAEs降解，從而緩解PAEs對農(nóng)作物的脅迫并降低農(nóng)產(chǎn)品被PAEs污染的風險^[1]。因此，探索細菌對不同PAEs的降解特性對于修復被其污染的土壤有重要意義。目前，關(guān)于PAEs降解菌的降解特性研究主要以PAEs為單一碳源開展^[12]。然而，自然環(huán)境中碳源種類繁多，細菌等微生物對PAEs的降解代謝可能因其他碳源存在而發(fā)生顯著變化^[19，23]。本研究從PAEs污染植物中篩選獲得1株植物內(nèi)生菌W34，經(jīng)過16S rRNA同源性比較分析并結(jié)合細菌平板菌落形態(tài)和電鏡形態(tài)特征，鑒定該菌為枯草芽孢桿菌，研究了外源碳源存在條件下，菌株W34對6種優(yōu)控PAEs的降解特性和差異，并初步探索了糖類對該菌降解PAEs途徑的影響。

本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌W34對DBP和BBP的降解效率較高，20～50 mg/L的PAEs處理3 d后該菌可完全降解DBP和BBP。此外，該菌對DMP、DEP、DEHP和DnOP也有一定的降解能力，并且這4種PAEs在無機鹽培養(yǎng)基中的消解動態(tài)均符合一級動力學方程。以往的研究也發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌HB-T2對DBP和BBP的降解能力較強，10 mg/L的PAEs處理3 d，DBP和BBP的降解率分別達100.0%和90.5%^[24]。添加D-纖維二糖可顯著提高DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率，說明D-纖維二糖作為共代謝基質(zhì)可促進W34對PAEs的降解。類似的，郭江楓等^[25]發(fā)現(xiàn)添加琥珀酸鈉和檸檬酸鈉作為共代謝底物可顯著促進黏質(zhì)沙雷氏菌TF-1降解氯苯。本研究結(jié)果說明，菌株W34具有同時降解環(huán)境中6種PAEs的潛力，而糖類可以提高該菌對PAEs污染的修復效率。

通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)吐溫 -80添加量對PAEs降解有顯著影響，DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率均隨吐溫-80添加量增加呈先上升后下降趨勢。吐溫-80作為常用的增溶劑，可以促進培養(yǎng)介質(zhì)中PAEs的溶解，進而提高其生物可利用度^[26]。然而，當吐溫-80添加液含量為0.050%～0.100%時，這4種PAEs的降解率逐漸下降，這可能與吐溫-80的臨界膠束濃度（CMC）有關(guān)。研究結(jié)果表明，有機污染物的降解率與表面活性劑的CMC關(guān)系密切^[27]，當吐溫-80濃度超過1 CMC時，其對芘降解的促進作用下降，當吐溫-80濃度為4～8 CMC時則抑制芘的降解^[28]。此外，研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、果糖、D-纖維二糖、麥芽糖和蔗糖均可促進W34對PAEs的降解，這可能與添加共代謝碳源后細菌的生物量增加促進了PAEs降解有關(guān)。接菌量試驗結(jié)果證明，初始接菌量增加可顯著促進W34對PAEs的降解。然而，細菌生物量增加也可能抑制W34對PAEs的降解。本研究發(fā)現(xiàn)，當蔗糖濃度由20 mmol/L提高至50 mmol/L，雖然細菌的生物量顯著增加，但W34對DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率均顯著下降，這可能與高濃度蔗糖條件下W34降解酶含量或活性被抑制有關(guān)。以往的研究結(jié)果表明，細菌對PAEs的降解主要由各類酶催化完成，比如DBP可在水解酶作用下發(fā)生酯鍵斷裂，形成鄰苯二甲酸單丁酯（MBP）和鄰苯二甲酸（PA），而PA又可在鄰苯二甲酸 3，4-雙加氧酶或鄰苯二甲酸 4，5-雙加氧酶作用下脫氫生成3，4-二羥基鄰苯二甲酸或4， 5-二羥基鄰苯二甲酸，并進一步降解為原兒茶酸和苯甲酸（BA），最終進入三羧酸循環(huán)^[14]。然而，糖類作為共代謝碳源對菌株W34的PAEs降解途徑產(chǎn)生的影響尚不清楚，需要進一步研究。

研究結(jié)果表明，細菌對PAEs、PAHs和農(nóng)藥等有機污染物的降解主要依賴其降解酶的催化作用^{[15，29-30]}，而編碼降解酶的基因可能位于其基因組上，也可能位于其質(zhì)粒上^[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)菌株W34含有質(zhì)粒，但該質(zhì)粒不具有PAEs降解基因，并且加糖處理也不能誘導相關(guān)降解酶基因表達，暗示W(wǎng)34的PAEs降解基因位于其染色體上。進一步研究發(fā)現(xiàn)，W34的胞內(nèi)粗酶液對DBP和BBP有一定的降解能力，蔗糖可顯著提高胞內(nèi)降解酶的合成量或活性，從而顯著促進DBP和BBP的降解。此外，添加蔗糖后，W34的胞內(nèi)粗酶液對DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解能力顯著增強，這可能是蔗糖促進菌株W34降解這4種PAEs的重要原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，在不添加蔗糖的條件下，菌株W34對PAEs的降解以胞外酶為主，添加蔗糖后PAEs的降解以胞內(nèi)酶為主，說明蔗糖可能通過改變菌株W34細胞膜的透性，從而影響降解酶系的分泌和催化活性，相關(guān)機理尚不明確，需要進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從PAEs污染植物中分離獲得1株植物內(nèi)生菌W34，鑒定為枯草芽孢桿菌。該菌株可同時降解DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP 6種PAEs，其中對DBP和BBP的降解效率較高，20～50 mg/L質(zhì)量濃度下，這2種PAEs的降解半衰期均小于0.33 d。糖類作為共代謝基質(zhì)可顯著促進菌株W34對6種PAEs的降解。優(yōu)化了共代謝降解條件，最佳吐溫-80添加量為0.025%，最佳碳源為蔗糖（濃度為20 mmol/L），最佳接種菌液OD₆₀₀為0.3。初步探索了菌株W34的PAEs降解途徑，發(fā)現(xiàn)W34的PAEs降解基因位于該菌的染色體上，W34的粗酶液對6種PAEs均有催化降解活性，蔗糖可顯著提高菌株W34降解酶的催化活性，這是蔗糖作為共代謝物促進菌株W34降解PAEs的重要原因。研究結(jié)果初步揭示了共代謝物對PAEs降解和代謝途徑的影響，為未來利用植物與內(nèi)生菌協(xié)同修復環(huán)境PAEs污染提供技術(shù)支持。

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（責任編輯：陳海霞）