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    利用可視基因膜芯片技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)分析肉制品中動(dòng)物源性成分

    2023-06-08 14:00:45邵彪高利亭徐陳紅張霞陳剛汪少蕓
    肉類研究 2023年3期
    關(guān)鍵詞:肉制品源性定量

    邵彪 高利亭 徐陳紅 張霞 陳剛 汪少蕓

    摘 要:為調(diào)查了解肉制品中動(dòng)物源性成分,以幫助判別摻假情況,應(yīng)用可視基因膜芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)市售的肉松、香腸、肉卷、預(yù)制調(diào)理肉、肉干及肉脯等23 份樣品動(dòng)物源性成分進(jìn)行篩查分析,同時(shí),針對(duì)篩查結(jié)果采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法進(jìn)一步確證。結(jié)果表明:可視基因膜芯片檢測(cè)法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果一致,提高了未知樣品的篩查效率;在本次隨機(jī)分析的樣品中,動(dòng)物源性成分檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽標(biāo)示不一致的情況占比高達(dá)21.7%,肉制品摻假虛標(biāo)情況不容忽視。

    關(guān)鍵詞:可視基因膜芯片;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);肉制品;動(dòng)物源性成分;摻假

    Analysis of Animal Derived Ingredients in Meat Products by using Optical Gene Thin-Film Biosensor Chips and Real-Time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

    SHAO Biao1, GAO Liting1, XU Chenhong1, ZHANG Xia1, CHEN Gang1, WANG Shaoyun2,*

    (1.Nantong Products Quality Supervision and Inspection Institute, Nantong 226011, China;

    2.College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China)

    Abstract: For the purse of investigating animal derived ingredients in meat products in order to help in identifying adulteration in meat products, optical gene thin-film biosensor chip technology was used to screen and analyze the animal derived components of 23 samples of meat floss, sausage, meat roll, pre-processed meat and dried meat sold on the market. The obtained results were consistent with those of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The biosensor chip enabled more efficient screening of unknown samples. When random samples were analyzed using the biosensor chip, the results for 21.7% of these samples were inconsistent with the label information, so adulteration and false labeling of meat products should not be ignored.

    Keywords: optical gene thin-film biosensor chips; real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction; meat products; animal derived ingredients; adulteration

    DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20221027-143

    中圖分類號(hào):TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1001-8123(2023)03-0007-07

    引文格式:

    邵彪, 高利亭, 徐陳紅, 等. 利用可視基因膜芯片技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)分析肉制品中動(dòng)物源性成分[J].

    肉類研究, 2023, 37(3): 7-13. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20221027-143.? ? http://www.rlyj.net.cn

    SHAO Biao, GAO Liting, XU Chenhong, et al. Analysis of animal derived ingredients in meat products by using optical gene thin-film biosensor chips and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)[J]. Meat Research, 2023, 37(3): 7-13. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20221027-143.? ? http://www.rlyj.net.cn

    肉類是人類飲食結(jié)構(gòu)中不可或缺的組成部分。隨著我國(guó)居民消費(fèi)水平的提高,對(duì)肉類的需求量逐年增加,據(jù)統(tǒng)計(jì),2021年國(guó)內(nèi)畜禽肉總產(chǎn)量達(dá)9 645 萬(wàn)t,居世界之首。肉制品是以畜禽肉為主要原料,經(jīng)調(diào)味后采用不同加工工藝制作的熟肉制成品或半成品,因風(fēng)味獨(dú)特、口感多樣、便于加工、貯藏等特點(diǎn)深受人們喜愛(ài),常見(jiàn)的如香腸、火腿、肉松、肉干、肉鋪、肉串、培根、腌臘肉、醬鹵肉、燒烤肉和肉罐頭等。然而,由于不同動(dòng)物來(lái)源的肉類價(jià)格差異較大,在利益的驅(qū)動(dòng)下,肉制品中摻假摻雜現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮,不法商人利用加工過(guò)程絞碎、成形、腌制、熱處理等工藝對(duì)原有形狀的改變,并借助調(diào)味料、食品添加劑的掩飾,將價(jià)格低廉的肉類冒充或摻入到價(jià)格較高的肉類中,達(dá)到以假亂真的目的。肉制品摻假不僅直接損害消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益,而且?guī)?lái)潛在的安全風(fēng)險(xiǎn),如存在不明來(lái)源肉類藥物殘留超標(biāo)、疫病風(fēng)險(xiǎn)、過(guò)敏原危害及添加劑危害等問(wèn)題,此外,還涉及民族信仰與宗教倫理問(wèn)題[1-3]。因此,對(duì)肉制品摻假實(shí)施監(jiān)管非常必要。

    圍繞肉類摻假甄別,國(guó)內(nèi)外已開(kāi)發(fā)出很多種分析檢測(cè)方法,包括:波譜分析法,如紅外光譜法[4-5]、拉曼光譜法[6-7]、核磁共振法[8-9]、高光譜成像法[10-11]等;蛋白質(zhì)分析法,如電泳法[12]、色譜法[13]、酶聯(lián)免疫法[14]、

    質(zhì)譜法[15-16];分子生物學(xué)分析法,如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法[17-18]、熒光定量PCR法[19-20]、等溫?cái)U(kuò)增法[21-22]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法[23-24]、DNA條形碼鑒別技術(shù)[25-26]、數(shù)字

    PCR法[27-29]等。由于肉制品加工工藝復(fù)雜,通常涉及調(diào)味、熱處理等工序,導(dǎo)致干擾因素增多、蛋白質(zhì)變性等情況發(fā)生,在一定程度上制約了波譜分析法、蛋白質(zhì)分析法的使用。遺傳物質(zhì)DNA分子具有高度的穩(wěn)定性和物種特異性,因此,以DNA為檢測(cè)對(duì)象的分子生物學(xué)法無(wú)疑成為肉制品動(dòng)物源性成分分析最為理想的選擇方案。其中,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法因靈敏度高、特異性好、操作便捷且具有一定的定量功能,是當(dāng)前分子生物學(xué)檢測(cè)最常用的手段,然而其對(duì)于未知成分的檢測(cè)需要設(shè)計(jì)不同的引物、探針逐一排查,增加了檢測(cè)成本??梢暬蚰ば酒夹g(shù)是一種利用特異探針雜交產(chǎn)生可見(jiàn)信號(hào)的基因芯片技術(shù),該方法利用反向斑點(diǎn)雜交原理,將核苷酸探針順序排列于支持膜表面,形成探針陣列,采用多重PCR技術(shù)將待檢測(cè)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增后,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)變性后形成的單鏈DNA與膜芯片上的探針雜交,經(jīng)底物顯色形成可視的檢測(cè)結(jié)果[30-32]。一般情況下,芯片上固定多個(gè)基因靶點(diǎn),可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因。因此,該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、通量高、成本低和結(jié)果肉眼可見(jiàn)的特點(diǎn),已在微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、過(guò)敏原檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域使用[33-35]。

    本研究利用可視基因膜芯片對(duì)市售肉制品進(jìn)行篩查分析,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行確認(rèn),以證實(shí)2 種方法的一致性和可行性,同時(shí),對(duì)目前肉制品中動(dòng)物源性成分與標(biāo)簽不一致而涉嫌摻假行為進(jìn)行調(diào)查,為行業(yè)監(jiān)管提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    肉松(6 份)、香腸(6 份)、肉卷(4 份)、預(yù)制調(diào)理肉(4 份)、肉干(2 份)、肉脯(1 份)均購(gòu)自南通地區(qū)市場(chǎng)及超市。

    深加工食品DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)

    有限公司;TaqProbe 2×qPCR-Low-ROX預(yù)混液 生工生物工程(上海)股份有限公司;膜芯片動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒 四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司;三氯甲烷(純度≥99.0%) 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇(純度≥99.7%) 上海振興化工一廠;異丙醇(色譜級(jí),純度99.8%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MFS-24膜芯片雜交儀 四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司;7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司;C1000 Touch梯度PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司;H1650R高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;移液器(2.5、10、200、1 000 μL) 德國(guó)Eppendorf公司;DEAOU-US 200超微量分光光度計(jì) 廣州迪澳生物科技有限公司;GC-100恒溫干浴器、MINI-6K離心機(jī) 杭州佑寧儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 DNA提取

    選擇代表性樣品,粉碎、碾磨均勻后,按照深加工食品DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,整個(gè)過(guò)程應(yīng)避免交叉污染。DNA提取完成后,使用核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定,確保A260 nm/A280 nm為1.8~2.0。

    1.3.2 膜芯片檢測(cè)

    1)多重PCR擴(kuò)增體系配制。反應(yīng)體系總體積為20 μL,其中多重PCR反應(yīng)預(yù)混液(2×Multiplex PCR Master Mix)10 μL,加入一定體積的樣品,確保反應(yīng)體系中樣品DNA含量為50~400 ng,用無(wú)核酸酶水補(bǔ)充至20 μL。

    2)多重PCR擴(kuò)增。包括3 個(gè)步驟:50 ℃預(yù)處理2 min,95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸15 s,30 個(gè)循環(huán);68 ℃延伸30 min,4 ℃保持。

    3)膜芯片雜交。產(chǎn)物變性:將PCR產(chǎn)物95 ℃變性5 min后立即置于冰上放置備用;按要求配制好相關(guān)試劑,加入雜交液后執(zhí)行雜交顯示程序,包括雜交(45 ℃、10 min)、雜交清洗(52 ℃、3 min)2 次、酶孵育標(biāo)記(42 ℃、10 min)、酶標(biāo)清洗Ⅰ(42 ℃、3 min)、酶標(biāo)清洗Ⅱ(37 ℃、3 min)2 次、顯色液顯色(37 ℃、10 min)、顯色清洗(37 ℃、1 min)2 次。

    1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物及探針(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL):TaqProbe qPCR Mastermix 10 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、TaqMan探針0.5 μL、DNA模板2 μL、無(wú)核糖核酸酶ddH2O 5.5 μL。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù):95 ℃變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸60 s并收集熒光信號(hào),循環(huán)40 次。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    基因膜芯片結(jié)果由膜芯片雜交儀自動(dòng)拍照并經(jīng)

    MFS-24自動(dòng)分析軟件(版本號(hào)MFS24.V.1.0.5.21.03)處理;實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果圖片由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配套7500軟件(版本號(hào)V2.3)處理而成。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 可視基因膜芯片點(diǎn)陣圖及陽(yáng)性質(zhì)控結(jié)果

    本研究所采用的11 種動(dòng)物源性成分膜芯片點(diǎn)陣如

    圖1所示,依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū),對(duì)11 種動(dòng)物源性成分的檢出限為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。利用試劑盒所帶的11 種動(dòng)物源性成分多重PCR陽(yáng)性質(zhì)控進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果如圖2所示。

    由圖1~2可知,膜芯片上PC點(diǎn)、內(nèi)參點(diǎn)及11 種動(dòng)物源性成分陽(yáng)性質(zhì)控點(diǎn)均顯色,而NC點(diǎn)及空白對(duì)照均不顯色,符合預(yù)期要求。

    2.2 樣品的可視基因膜芯片檢測(cè)結(jié)果

    根據(jù)11 種動(dòng)物源性成分膜芯片點(diǎn)陣圖與膜芯片顯色結(jié)果,可以判別測(cè)試結(jié)果的有效性及樣品中所含的動(dòng)物源性成分。由表2~6可知,PC點(diǎn)均顯色,而NC點(diǎn)及空白對(duì)照均未顯色,表明測(cè)試結(jié)果均有效。由表2可知,6 份肉松樣本中有1 份(6#)配料表中標(biāo)識(shí)為豬肉,實(shí)際檢出豬和雞成分。由表3可知,6 份香腸樣本中有2 份標(biāo)識(shí)與實(shí)際分析結(jié)果不一致,其中香腸1#標(biāo)識(shí)為牛肉,實(shí)際檢出牛、豬和雞成分,香腸5#標(biāo)識(shí)為雞肉、豬肉,實(shí)際只檢出雞成分。由表4可知,4 份肉卷樣本中有2 份標(biāo)識(shí)與實(shí)際分析結(jié)果不一致,其中肉卷2#標(biāo)識(shí)為牛肉,實(shí)際檢出豬、牛、雞成分,肉卷3#標(biāo)識(shí)為羊肉,實(shí)際不僅檢出羊成分,還檢出豬成分。由表5~6可知,4 份預(yù)制調(diào)理肉、2 份肉干及1 份肉脯樣本實(shí)際檢測(cè)結(jié)果均與標(biāo)識(shí)一致。

    由此可以看出,利用可視基因膜芯片技術(shù),通過(guò)一次多重PCR反應(yīng),在芯片所包含的11 種動(dòng)物源性成分范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)未知樣品成分的篩查,操作簡(jiǎn)單、快速,顯色結(jié)果肉眼可視。

    2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR確認(rèn)結(jié)果

    對(duì)于可視基因膜芯片檢測(cè)與標(biāo)識(shí)不符的5 個(gè)樣品,根據(jù)樣品篩查出的成分,分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)各組分進(jìn)行確認(rèn)。

    A. 肉松6#(A1、A2. 豬、雞目標(biāo)基因);B. 香腸1#(B1、B2、B3. 牛、豬、雞目標(biāo)基因);C. 香腸5#(C1、C2. 雞、豬目標(biāo)基因);D. 肉卷2#(D1、D2、D3. 豬、牛、雞目標(biāo)基因);E. 肉卷3#(E1、E2. 羊、豬目標(biāo)基因)。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR法是目前分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域使用最為普遍的方法,能夠通過(guò)對(duì)探針?biāo)鶚?biāo)記熒光信號(hào)的監(jiān)測(cè),實(shí)時(shí)顯示PCR擴(kuò)增結(jié)果,并可以通過(guò)循環(huán)閾(cycle threshold,Ct)值判斷樣本中目標(biāo)核酸起始濃度,具有定量功能。由圖3A可知,豬、雞目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。由圖3B可知,牛、豬、雞目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。由圖3C可知,雞目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線,而豬目標(biāo)基因無(wú)擴(kuò)增曲線;由圖3D可知,豬、牛、雞目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。由圖3E可知,羊、豬目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。上述所有擴(kuò)增曲線相應(yīng)的Ct值均小于30,表明各目標(biāo)組分檢出,通過(guò)與可視基因膜芯片檢測(cè)結(jié)果比較可以看出,2 種技術(shù)測(cè)定結(jié)果一致,證實(shí)了可視基因膜芯片篩查結(jié)果的可靠性。

    另外,對(duì)于本次用于分析檢測(cè)的23 份各類肉制品樣品,存在5 批次的摻假、虛標(biāo)情況,占比達(dá)21.7%,主要涉及在價(jià)格較高的牛、羊肉制品中摻加價(jià)格低廉的豬肉或雞肉,或在豬肉制品中摻加雞肉。

    3 結(jié) 論

    本研究利用可視基因膜芯片技術(shù)對(duì)南通地區(qū)市售的肉松、香腸、肉卷、預(yù)制調(diào)理肉、肉干和肉脯等肉類加工制品動(dòng)物源性成分進(jìn)行篩查,同時(shí)對(duì)于檢出成分與標(biāo)識(shí)不符的樣品采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,2 種方法所獲得的結(jié)果一致。可視基因膜芯片技術(shù)以多重PCR為基礎(chǔ)并在芯片上集成了多個(gè)目標(biāo)探針,能夠?qū)崿F(xiàn)1 次反應(yīng)、多個(gè)目標(biāo)組分同時(shí)定性檢測(cè),具有通量高、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn),同時(shí),相較于熒光定量PCR技術(shù),其對(duì)儀器的依賴程度不高,結(jié)果肉眼可見(jiàn),所使用引物及探針使用親和素和氨基標(biāo)記,成本相較于熒光探針標(biāo)記也更加低廉。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)更為靈敏且具有定量功能,對(duì)于食品摻假鑒別而言,過(guò)高的靈敏度沒(méi)有實(shí)際意義,反而增加了樣本接觸性污染結(jié)果的干擾識(shí)別難度;核酸定量分析雖然在食品成分分析中具有重要意義,能夠反映食品各組分比例關(guān)系,但由于受DNA提取效率及缺乏有效標(biāo)準(zhǔn)品等因素的影響,導(dǎo)致目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在動(dòng)物源成分鑒別中難以有效發(fā)揮其定量?jī)?yōu)勢(shì),國(guó)內(nèi)外報(bào)道的鑒別方法主要將其作為定性的手段。由此可見(jiàn),對(duì)于成分未知的樣品而言,使用可視基因膜芯片技術(shù)可以在芯片標(biāo)記的物種探針?lè)秶鷥?nèi)實(shí)現(xiàn)快速篩查,能夠避免直接使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法逐一分析帶來(lái)的繁瑣程序和高昂成本。

    本研究利用11 種常見(jiàn)動(dòng)物源性成分基因膜芯片隨機(jī)分析的23 份樣品中,檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)識(shí)不符的占比達(dá)21.7%,表明肉制品中虛標(biāo)比例較高,涉嫌產(chǎn)品摻假問(wèn)題需要引起監(jiān)管部門(mén)和社會(huì)的關(guān)注,應(yīng)加大力度打擊生產(chǎn)加工過(guò)程弄虛作假,維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益,確保食品質(zhì)量與安全。

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    收稿日期:2022-10-27

    基金項(xiàng)目:南通市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JC2020108);江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目(KJ204137);

    國(guó)家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1905202)

    第一作者簡(jiǎn)介:邵彪(1983—)(ORCID: 0000-0001-8749-889X),男,高級(jí)工程師,博士,研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全分析。

    E-mail: shaobiao1983@sina.com

    *通信作者簡(jiǎn)介:汪少蕓(1970—)(ORCID: 0000-0003-1244-8964),女,教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。

    E-mail: shywang@fzu.edu.cn

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