誘導(dǎo)多能干細胞在骨關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用進展

張運恒 王軒 李毅

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種由關(guān)節(jié)軟骨退行性變引起的疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特點。關(guān)節(jié)軟骨分解和磨損常引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬等癥狀，通常累及膝關(guān)節(jié)、手腕、髖關(guān)節(jié)和脊柱，嚴(yán)重影響65 歲及以上老年人的生活質(zhì)量。由于軟骨無血供且再生能力差，早期OA 治療包括自體軟骨細胞植入(ACI)[1]、自體骨軟骨移植(OATS)及微骨折手術(shù)[2]等，中晚期OA 治療包括截骨矯形、關(guān)節(jié)融合及關(guān)節(jié)置換。目前尚未有早期關(guān)節(jié)軟骨損傷有效的治療方法。近年來再生醫(yī)學(xué)成為了OA 治療研究的熱點。2006 年，Takahashi等[3]首次報道了誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC），通過體外導(dǎo)入4 種特定的轉(zhuǎn)錄因子將小鼠皮膚成纖維細胞重編程為類胚胎干細胞形態(tài)。iPSC 具有很強的向軟骨細胞分化的潛能，且具有可通過對體細胞重編程獲得、來源較多、不涉及倫理問題等特點。大量研究表明，iPSC 在OA 早期治療和軟骨修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。本文對iPSC 的特點及其在OA 軟骨再生療法中的應(yīng)用進行綜述，以期望在臨床上為OA 軟骨修復(fù)提供新的思路。

1 iPSC 特點

iPSC 與胚胎干細胞十分類似，呈圓形，在顯微鏡下可見其細胞群由高核質(zhì)體積比的細胞組成，具有清晰的邊緣和較高的堿性磷酸酶活性[4]。它的細胞表面特征為存有階段特異性胚胎抗原（SSEA）3、SSEA4、糖蛋白t 細胞受體α 位點(TRA 1-60)等，可表達CD30、CD9、CD50、CD200 和CD90[5]。此外，iPSC 的免疫原性在一定程度上可被調(diào)控。Xu 等[6]研究表明，可使用新型CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)來生成由人類白細胞抗原（HLA）編輯的iPSC，這些iPSC 可避免受到T 細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的攻擊。

自體軟骨細胞、胚胎干細胞（ESC）和間充質(zhì)干細胞（MSC）已應(yīng)用于軟骨再生治療中。ACI 技術(shù)可治療的軟骨細胞有限，在體外增殖傳代也會導(dǎo)致其在培養(yǎng)過程中去分化。ESC 在臨床應(yīng)用中有畸胎瘤形成的風(fēng)險，且存在倫理問題。MSC 能特定地分化為軟骨、骨等，且可來源于脂肪、骨髓、臍帶等多種組織，因此大量應(yīng)用于OA 治療中，但其體外傳代能力有限，而且合成及增殖能力也隨著年齡增長而下降。

iPSC 不僅能無限自我更新，還有分化成機體任意細胞的能力[7]。iPSC 可來源于豐富的成熟體細胞，通過重編程手段[8]獲取并用于治療，能無創(chuàng)操作且無醫(yī)學(xué)倫理問題。隨著對iPSC 研究的不斷深入，c-Myc基因被證實可從iPSC 制備過程中剔除，其余轉(zhuǎn)錄因子也分別有了替代品，逆轉(zhuǎn)錄病毒被證實可替換為質(zhì)粒載體、仙臺病毒等。這些都讓iPSC 的生產(chǎn)變得安全，也使iPSC 的臨床應(yīng)用成為可能。

2 iPSC 誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨形成

OA 最早且最主要的病理變化發(fā)生在關(guān)節(jié)軟骨。軟骨的主要功能是減震和潤滑，軟骨損傷會導(dǎo)致關(guān)節(jié)在頻繁的活動中逐漸發(fā)生磨損和降解，產(chǎn)生OA。因此，OA 治療的關(guān)鍵在于對軟骨進行修復(fù)。誘導(dǎo)真皮成纖維細胞、脂肪干細胞、臍帶血單核細胞等來源的iPSC 向軟骨分化是解決此問題的新途徑。

目前學(xué)者們進行iPSC 向軟骨分化的體外實驗有以下4 種方法。①將iPSC 培養(yǎng)為間充質(zhì)前體細胞（MPC）、誘導(dǎo)多能干細胞來源的間充質(zhì)干細胞（iPSC-MSC）等間充質(zhì)細胞樣細胞，再誘導(dǎo)其向軟骨細胞分化。此方法可獲得相對均一的軟骨細胞，適用于軟骨發(fā)育不良的治療[9]。②將iPSC 培養(yǎng)在纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿中以獲得神經(jīng)嵴細胞，再經(jīng)此中間體分化為間充質(zhì)細胞樣細胞，進而產(chǎn)生軟骨細胞。但研究發(fā)現(xiàn)其在植入軟骨缺損處后不會在體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生軟骨[10]，必須在植入前將其分化為成軟骨譜系。③通過將iPSC 培養(yǎng)成擬胚體（EB），使iPSC 轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細胞樣細胞，并通過細胞分選等方式將其獲得，最終完成向軟骨細胞的分化。這種采用EB 中間體的方法十分常用，不過其產(chǎn)生的間充質(zhì)細胞樣細胞較少，且需使用專門的生物反應(yīng)培養(yǎng)體系。④由于iPSC 有向三胚層分化的潛能，可以通過化學(xué)試劑及一些小分子物質(zhì)將其持續(xù)向中胚層分化并減少其他分化方向，最后采用3D 培養(yǎng)使其轉(zhuǎn)化為軟骨細胞[11]。此方法較為節(jié)省時間且軟骨成熟度高[12]。值得注意的是，后兩種方法都涉及了中胚層譜系定向分化。Adkar等[13]通過一些細胞因子和化學(xué)分子等的調(diào)控作用，實現(xiàn)了iPSC 向軟骨細胞的轉(zhuǎn)化，且該軟骨細胞在體外成熟后還顯示出一定的異質(zhì)性。相比于體外實驗，體內(nèi)實驗更能證實iPSC 修復(fù)缺陷的能力。

大多數(shù)體內(nèi)實驗研究基本可以理解為iPSC 在體外進行分化再移植到體內(nèi)，目前較多使用的方法是通過培養(yǎng)EB 的方式或利用其他刺激來改善特定胚層細胞，也可采用通過iPSC 獲取軟骨細胞的方法，還可運用細胞支架以及化學(xué)試劑等。Zhu 等[14]通過誘導(dǎo)EB 的形成使人類iPSC 分化為軟骨細胞并用于大鼠OA 模型中，結(jié)果顯示OA 得到改善且有關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)生成。在此基礎(chǔ)上，Rim 等[15]提出了使用編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2 或轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β3 的微環(huán)載體，同樣可將人類iPSC 分化為軟骨細胞，并導(dǎo)入大鼠模型中修復(fù)軟骨缺損，這樣可降低EB 方法的細胞培養(yǎng)成本。此外，有學(xué)者提出了在EB 方法中添加Rho 相關(guān)蛋白激酶（ROCK）抑制劑(Y27632)，提高了EB 方法的安全性，可在無血清條件下完成人類iPSC 向關(guān)節(jié)軟骨細胞分化，證明其具有應(yīng)用于臨床的潛力[16]。

除了利用EB 方法外，還有一種使人類iPSC轉(zhuǎn)變?yōu)橥该鬈浌堑姆椒āＴ谝隑MP-2、TGF-β1和生長分化因子（GDF）-5 等后，通過懸浮培養(yǎng)純化并產(chǎn)生軟骨顆粒，再將其移植到免疫缺陷小鼠和大鼠中，可發(fā)現(xiàn)表達Ⅱ型膠原蛋白的透明軟骨生成。Chang 等[17]建立了兔OA 模型，通過移植iPSC 進行治療并評估其模型中獲得的軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)分化的軟骨細胞可在體內(nèi)有效地修復(fù)OA 導(dǎo)致的軟骨損傷且具有抗炎、抗分解的作用。

近期在大鼠、小型豬、兔等動物上進行的相關(guān)體內(nèi)實驗大部分在體外實驗的基礎(chǔ)上完成。在不同的實驗研究中，iPSC 分化出的軟骨細胞不論在治療結(jié)果，還是在后期評估中都有不錯的表現(xiàn)，且iPSC 來源的細胞能夠在體內(nèi)再生透明軟骨，表達Ⅱ型膠原蛋白，這些也為今后運用于臨床治療提供了參考。

2 iPSC 用于OA 軟骨再生治療

在OA 的軟骨再生治療中，iPSC 常與MSC 進行比較。在iPSC 發(fā)現(xiàn)之前，MSC 一直作為細胞治療的首選，因為其可來源于多種組織、無倫理道德問題且有旁分泌的功能。但MSC 增殖代數(shù)有限，難以獲得滿足組織工程技術(shù)的細胞用量。iPSC 的出現(xiàn)恰恰可以彌補這一缺點，產(chǎn)生足量的MSC 以達到對關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。而眾多研究也表明，iPSC的衍生細胞體外軟骨分化很成功，可生成Ⅱ型膠原蛋白高表達的透明軟骨且少出現(xiàn)細胞肥大[18]，與原生關(guān)節(jié)軟骨細胞功能相似度極高。后期的體外實驗還發(fā)現(xiàn)，細胞生長環(huán)境顯著影響其向軟骨細胞分化的效率[19]，三維培養(yǎng)方法可提高細胞在孵化期間的接觸，在軟骨形成中至關(guān)重要。

Yamashita 等[20]、Zhu 等[14]及Rim 等[21]將體外培養(yǎng)的iPSC 衍生軟骨細胞移植到OA 動物模型體內(nèi)，再對缺損部位的再生軟骨進行評估，均證實了由iPSC 分化產(chǎn)生的軟骨細胞對體內(nèi)軟骨缺損的修復(fù)潛力。iPSC-MSC 較其衍生的軟骨細胞在移入體內(nèi)后可獲得更好的結(jié)果。Xu 等[22]以iPSC-MSC為基礎(chǔ)，在實驗中驗證了iPSC 具有修復(fù)體內(nèi)軟骨缺損的能力。

雖然iPSC 的衍生細胞在體內(nèi)外均表現(xiàn)出不錯的軟骨再生潛能，且在多項研究中有半數(shù)以上未顯示任何類型的畸胎瘤或腫瘤形成，但是應(yīng)用于臨床仍有諸多挑戰(zhàn)。首先，是存在于軟骨誘導(dǎo)的方法上，將iPSC 與軟骨細胞共培養(yǎng)，盡管軟骨細胞分泌的細胞因子可使iPSC 向軟骨細胞分化，但獲得的軟骨細胞數(shù)量較少且太過依賴與此共培養(yǎng)體系。同樣地，體外形成EB 后獲得的可產(chǎn)生軟骨細胞的中胚層細胞不足，很難滿足再生醫(yī)學(xué)的需要，如何高效地取得分化良好的間充質(zhì)細胞樣細胞困擾著許多研究團隊。其次，iPSC 來源影響著其軟骨分化能力，相較于其他來源的iPSC，臍帶血單核細胞來源的iPSC 分化后可表達更多的軟骨特異性標(biāo)記，但產(chǎn)生分化能力差異的原因至今未有研究探究，為臨床試驗增加了不確定因素。再者，全球iPSC 庫的開發(fā)正在進行，而缺乏統(tǒng)一藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）標(biāo)準(zhǔn)的鑒別方案（即鑒別是否為符合GMP 級的用于臨床治療的iPSC 衍生人體細胞的方案）是其應(yīng)用障礙之一。iPSC 的遺傳安全性問題也逐漸暴露出來，體細胞自身因素及培養(yǎng)iPSC 的不同階段均可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)改變，這些遺傳變異阻礙了它們在新療法中的應(yīng)用。

3 結(jié)語

盡管iPSC 有諸多優(yōu)點，其臨床應(yīng)用依然是漫長的過程，主要的限制原因是其致瘤性[23-24]。iPSC類似于ESC，理論上可以分化為三胚層的任意細胞，因此具備在未分化狀態(tài)下形成畸胎瘤的潛力。相信隨著越來越多優(yōu)秀的體內(nèi)試驗和誘導(dǎo)方案的建立，iPSC 向骨或軟骨分化的技術(shù)也會日趨成熟。