骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞鐵死亡的研究進(jìn)展

吳亞洲 趙海燕 王文己

骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)病機(jī)制迄今未完全闡明，學(xué)者們一般認(rèn)為，OA 發(fā)病是機(jī)械負(fù)荷、炎癥和代謝因素共同作用的復(fù)雜過程，其中關(guān)節(jié)軟骨退變起決定性作用。鐵死亡是一種新型程序性細(xì)胞死亡方式，其特點(diǎn)是鐵依賴性及高水平的脂質(zhì)過氧化發(fā)生，與已知的其他細(xì)胞死亡方式均不同。自鐵死亡的概念被提出后，學(xué)者們已發(fā)現(xiàn)其參與了多種退行性疾病和癌癥的發(fā)生發(fā)展。闡明OA 發(fā)生發(fā)展過程中軟骨細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制，對預(yù)防和治療OA 具有重要意義。

1 OA 與鐵死亡概述

OA 是一種非炎癥性慢性關(guān)節(jié)疾病，軟骨退變在OA 的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。軟骨細(xì)胞是軟骨中唯一的細(xì)胞類型，其對細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和維持至關(guān)重要，當(dāng)軟骨細(xì)胞的合成能力被基質(zhì)的降解能力壓倒時，軟骨內(nèi)會發(fā)生穩(wěn)態(tài)失衡，從而有助于OA 的發(fā)生發(fā)展[1]。

在OA 病程中，軟骨細(xì)胞受到機(jī)械性因素、局部炎癥及全身代謝改變等多種因素作用而受損，并發(fā)生細(xì)胞死亡。既往的研究認(rèn)為，壞死和凋亡是 OA 發(fā)生發(fā)展中軟骨細(xì)胞死亡的主要方式，隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)自噬性細(xì)胞死亡、細(xì)胞焦亡和鐵死亡等多種細(xì)胞死亡方式參與到OA 的病理進(jìn)展中[2]。

2012 年，鐵死亡的概念被首次提出。鐵死亡是一種鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化和活性氧過量產(chǎn)生所致的細(xì)胞死亡類型，其在形態(tài)學(xué)、生化和遺傳學(xué)上均與其他的細(xì)胞死亡方式不同[3]。學(xué)者們在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，鐵死亡會導(dǎo)致細(xì)胞線粒體變小，線粒體膜密度增高，線粒體嵴減少，而細(xì)胞核中的形態(tài)變化則不明顯。在細(xì)胞成分方面，鐵死亡表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化增高，活性氧升高，同時也有一些特征性的基因改變[4]。

2 相關(guān)研究

活性氧過量產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化可以導(dǎo)致軟骨細(xì)胞損傷，而鐵死亡的特征是鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物積累，這提示軟骨細(xì)胞鐵死亡可能參與OA 的發(fā)生發(fā)展中[5-6]。

2.1 臨床研究

一些研究發(fā)現(xiàn)，OA 患者存在軟骨細(xì)胞的鐵代謝失衡。Yazar 等[7]發(fā)現(xiàn)，OA 患者炎癥部位的關(guān)節(jié)液中鐵離子（Fe3+）水平較健康受試者明顯升高。有研究發(fā)現(xiàn)，OA 患者關(guān)節(jié)液中Fe3+水平與OA 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，OA 損傷區(qū)軟骨中亞鐵離子（Fe2+）、Fe3+和總鐵含量均明顯高于未損傷區(qū)，這提示OA 進(jìn)展過程中軟骨處有鐵元素積累[8-9]。Nugzar 等[10]對膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（KOA）患者血清鐵蛋白水平與軟骨損傷程度進(jìn)行評估，他們發(fā)現(xiàn)，血清鐵蛋白水平隨軟骨損傷程度升高而增高，且與患者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)和C 反應(yīng)蛋白水平無關(guān)，提示鐵蛋白可能參與癥狀性KOA 患者軟骨損傷的進(jìn)展。Kennish 等[11]發(fā)現(xiàn)，OA 患者中血清鐵蛋白水平升高與影像學(xué)Kellgren-Lawrence 分級的惡化程度呈正相關(guān)，尤其在男性患者中更明顯。此外，鐵攝入量似乎也與OA 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，鐵攝入量與KOA 的進(jìn)展呈“U”型相關(guān)，適當(dāng)?shù)蔫F攝入量可能有助于防止OA 進(jìn)展，而攝入過量或攝入不足均可增加OA 進(jìn)展的風(fēng)險[12-13]。

另一些研究發(fā)現(xiàn)，OA 患者存在軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的增高。Grigolo 等[14]用比色法評估OA患者與健康人關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的過氧化程度，他們發(fā)現(xiàn)，OA 患者的滑膜細(xì)胞丙二醛（MDA）和4-羥基壬烯酸（4-HNE）水平均高于健康人，且滑液中4-HNE 也較健康人高。Shah 等[15]使用免疫組化染色法檢測OA患者關(guān)節(jié)炎癥組織中的MDA和4-HNE水平，結(jié)果顯示，與正常軟骨切片相比，OA 患者切片的軟骨表面呈弱免疫染色。Gavriilidis 等[16]進(jìn)行硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)測定發(fā)現(xiàn)，OA 患者軟骨中MDA 水平高于健康人。Miao 等[8]發(fā)現(xiàn)，OA患者軟骨中谷胱甘肽過氧化酶（GPX）、谷胱甘肽（GSH）的水平及GSH 與還原型谷胱甘肽（GSSG）的比值均降低。此外，作為鐵死亡的特征性改變，在OA 患者軟骨細(xì)胞中通過透射電鏡可觀察到線粒體的形態(tài)學(xué)改變，這表明鐵死亡與OA 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17]。

2.2 動物實驗研究

研究發(fā)現(xiàn)，OA 動物模型中存在鐵代謝失衡和脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，而鐵螯合劑或抗氧化劑可以阻止OA 發(fā)展。Lv 等[18]報道，大鼠OA 模型中可見關(guān)節(jié)滑液的MDA 和Fe2+水平均升高，軟骨中GPX4 表達(dá)降低。Miao 等[8]制作OA 小鼠模型開展研究，發(fā)現(xiàn)小鼠軟骨細(xì)胞中GPX4 和鐵蛋白重鏈1 的表達(dá)均減少，這與鐵死亡的實驗結(jié)果一致。他們進(jìn)一步使用鐵螯合劑或鐵死亡特異性抑制劑Ferrostatin-1 對OA 模型小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，結(jié)果顯示，通過抑制軟骨細(xì)胞鐵死亡可以延緩小鼠OA 的發(fā)展。他們也發(fā)現(xiàn)，于造模手術(shù)前2 周在小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射腺相關(guān)病毒中克隆的GPX4短發(fā)夾RNA 片段會加速OA 進(jìn)展。該研究結(jié)果表明，抗氧化系統(tǒng)活化下調(diào)與OA 發(fā)展呈正相關(guān)。Yao 等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，OA 模型小鼠軟骨細(xì)胞中GPX4 表達(dá)下降，而在關(guān)節(jié)內(nèi)注射細(xì)胞鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 可以逆轉(zhuǎn)其軟骨退變。Guo 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射鐵死亡特異性誘導(dǎo)劑Erastin，可以誘導(dǎo)小鼠軟骨中Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）丟失，并顯著增加細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13的水平。該研究結(jié)果表明，Erastin 可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生OA 樣改變，促進(jìn)OA 發(fā)展。

2.3 體外細(xì)胞研究

近年來大量體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，OA 的軟骨細(xì)胞中存在的鐵代謝失衡與脂質(zhì)過氧化有關(guān)。Jing等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素（IL）-1β 和腫瘤壞死因子-α 通過上調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR）1 和下調(diào)鐵泵蛋白的表達(dá)能夠破壞軟骨細(xì)胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)，使用IL-1β 聯(lián)合檸檬酸鐵銨可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-13 和血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶-5 的表達(dá)增強(qiáng)，而使用鐵螯合劑或N-乙酰-L-半胱氨酸則可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。Yao 等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，由IL-1β 或檸檬酸鐵銨誘導(dǎo)的OA 樣軟骨細(xì)胞內(nèi)，活性氧和脂質(zhì)過氧化水平均升高，而GPX4 和SLC7A11 的表達(dá)均降低。Mo 等[21]的文獻(xiàn)報道，經(jīng)IL-1β 處理的小鼠成軟骨細(xì)胞（ATDC5）內(nèi)，F(xiàn)e2+和MDA 水平以及TFR1 表達(dá)均增加，而GSH、GPX4 和SLC7A11 表達(dá)均降低。

由于OA 發(fā)病機(jī)制中存在多種軟骨細(xì)胞的死亡類型，因此可能無法將鐵死亡與其他的細(xì)胞死亡方式完全分開，未來需要開展進(jìn)一步的研究來揭示OA 發(fā)病機(jī)制中不同軟骨細(xì)胞死亡方式之間的相互作用[22]。

3 鐵死亡發(fā)生機(jī)制

鐵死亡發(fā)生過程中有很多關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)：第一，TFR1 可以控制Fe2+進(jìn)入細(xì)胞的速度和數(shù)量，從而避免細(xì)胞出現(xiàn)鐵過載狀態(tài)以及隨后可能發(fā)生的脂質(zhì)過氧化[23]。第二，細(xì)胞膜上存在胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白system Xc-，其與合成細(xì)胞內(nèi)的重要抗氧化劑GSH 和GSSG 密切相關(guān)，抑制system Xc-的SLC7A11 亞基會發(fā)生細(xì)胞鐵死亡[24]。第三，GPX4可利用其催化活性將磷脂氫過氧化物還原為無毒的磷脂醇，以維持細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層穩(wěn)態(tài)，從而抑制鐵死亡[25]。此外，鐵死亡抑制蛋白（FSP）1在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中均可抑制有毒的脂質(zhì)過氧化物活性，從而避免細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損。以往的研究表明，GPX4 是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，而最新研究表明，F(xiàn)SP1 和GPX4 可協(xié)同作用，抑制細(xì)胞的磷脂過氧化和鐵死亡[26]。

3.1 GPX4 的核心調(diào)節(jié)作用

GPX4 是存在于細(xì)胞膜和多個有膜細(xì)胞器的抗氧化酶，被公認(rèn)為鐵死亡的中樞和最下游的調(diào)節(jié)因子。GPX4 在OA 發(fā)病機(jī)制中具有雙重作用，它既可以調(diào)節(jié)鐵死亡或氧化應(yīng)激過程，也可以通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子-κB（NF-κB）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的降解[8]。

3.1.1 SLC7A11-GPX4 軸

SLC7A11-GPX4 軸是調(diào)控細(xì)胞鐵死亡的經(jīng)典信號通路。SLC7A11 是system Xc-蛋白的特有亞基，抑制SLC7A11 可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH 耗竭和鐵依賴性脂質(zhì)過氧化發(fā)生。而抑癌基因P53、核因子E2 相關(guān)因子（NrF）2 和缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）都被證實是SLC7A11 的上游調(diào)節(jié)因子，對SLC7A11 的調(diào)節(jié)是抑制鐵死亡治療策略的核心[25]。細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 就是通過抑制system Xc-蛋白發(fā)揮作用的。體外細(xì)胞實驗研究顯示，蝦青素不但可以抑制Erastin 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞鐵死亡，還可以減輕細(xì)胞外基質(zhì)降解，減輕炎癥反應(yīng)，從而減緩OA 發(fā)展[27]。此外，D-甘露糖通過抑制HIF-2α 對SLC7A11 的抑制作用，可降低軟骨細(xì)胞對鐵死亡的敏感性，減輕OA 進(jìn)展[28]。

3.1.2 NrF2

NrF2 一方面可直接上調(diào)GPX4表達(dá)，另一方面還能誘導(dǎo)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸膦酸（NADPH）、血紅素氧合酶（HO）-1 等靶基因的表達(dá)，而NADH、NADPH、HO-1 都是重要的細(xì)胞抗氧化酶，故NrF2可通過多種途徑抗氧化，發(fā)揮軟骨保護(hù)作用[29]。體外細(xì)胞實驗顯示，柚皮素可通過NrF2/HO-1 途徑降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕鐵過載對軟骨細(xì)胞的損傷。而在6 周齡雄性小鼠實驗中，柚皮素可減輕OA 小鼠的滑膜炎，減輕軟骨損傷和軟骨下骨增生[30]。鐵螯合劑可用于治療鐵過載相關(guān)疾病，有研究表明，鐵螯合劑對OA 中軟骨細(xì)胞退化有較好的抑制作用，其通過激活NrF2 通路并促進(jìn)NrF2 和HO-1向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)揮軟骨保護(hù)作用[20]。

3.1.3 熱休克蛋白A5 和辣椒素受體

在體外細(xì)胞實驗中，軟骨細(xì)胞的熱休克蛋白（HSP）A5 可與GPX4 蛋白直接結(jié)合并正向調(diào)節(jié)其表達(dá)，而葡萄球菌核酸酶樣結(jié)構(gòu)蛋白（SND）1 在3’端非翻譯區(qū)（3'UTR）處與HSPA5結(jié)合，可使HSPA5 mRNA失穩(wěn)，在OA 大鼠模型中敲除SND1可上調(diào)大鼠軟骨組織中HSPA5和GPX4表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞的炎性損傷和鐵死亡，減輕OA 進(jìn)展[18]。

一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，OA 鐵死亡軟骨細(xì)胞中（尤其是損傷區(qū)域）積累了鐵死亡標(biāo)志物[31]。他們對人OA 軟骨細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA 測序分析，發(fā)現(xiàn)鐵死亡的軟骨細(xì)胞群中存在優(yōu)先表達(dá)的鐵死亡特征基因，并篩選出辣椒素受體（TRPV1）作為體外和體內(nèi)抗鐵死亡的靶點(diǎn)。TRPV1 通過上調(diào)GPX4 的表達(dá)避免發(fā)生鐵死亡現(xiàn)象，這在小鼠腸道缺血再灌注損傷的研究中已被證實[32]，而在新的研究中發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞中也存在TRPV1 被激活后GPX4表達(dá)上調(diào)的情況，這避免了軟骨細(xì)胞鐵死亡發(fā)生。上述推理在原代軟骨細(xì)胞、人OA 軟骨外植體和內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù)誘導(dǎo)的OA 小鼠模型中均得到驗證。綜上，TRPV1 具有明顯的抗鐵死亡作用，這提示其有可能成為OA 治療的調(diào)控靶點(diǎn)[33]。

3.2 FSP1 的潛在調(diào)控作用

通常，當(dāng)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生超過細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的緩沖能力時，細(xì)胞鐵死亡會被觸發(fā)[34]。既往的研究認(rèn)為，GPX4是細(xì)胞鐵死亡的主要調(diào)節(jié)因子，敲除GPX4基因可引起活性氧自由基在細(xì)胞膜上的積累，誘發(fā)細(xì)胞鐵死亡。2019 年的一項研究證明，F(xiàn)SP1-輔酶Q10（CoQ10）-NAD(P)H 通路作為獨(dú)立的平行系統(tǒng)存在，其與GPX4 和GSH 協(xié)同能夠抑制磷脂過氧化和鐵死亡發(fā)生[35]。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SP1 是非線粒體輔酶Q 抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，該系統(tǒng)與典型的基于GSH 的GPX4 途徑呈平行作用[26]。FSP1 定位于細(xì)胞膜，作為一種NAD(P)H 依賴的氧化還原酶，能夠還原CoQ10，捕獲脂質(zhì)過氧化自由基，從而抑制脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。這些研究結(jié)果提示，可以探究OA 軟骨細(xì)胞發(fā)生的鐵死亡是否存在FSP1-CoQ10 軸的作用，是否可以利用抑制FSP1 來降低軟骨細(xì)胞對鐵死亡的敏感性，從而干預(yù)OA 進(jìn)展[36]。

4 結(jié)語

OA 軟骨細(xì)胞鐵死亡的研究主要集中于GPX4的核心調(diào)節(jié)作用，而FSP1 途徑可能與GPX4 途徑同等重要，對此還需開展進(jìn)一步研究。目前，探索OA 軟骨細(xì)胞鐵死亡的研究主要集中于分子機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面，未來需要在基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)層面探究OA 軟骨細(xì)胞鐵死亡的具體發(fā)生機(jī)制，為臨床治療指明更準(zhǔn)確的方向。