脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型制造方法研究進(jìn)展

孟董超 劉海峰 趙軼波 趙斌

脊柱側(cè)凸是一種強(qiáng)基因相關(guān)性、多種外部因素共同參與的全身性疾病，目前的研究仍不能完全明確疾病的復(fù)雜機(jī)制，還需要繼續(xù)在動(dòng)物模型上進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)探索。根據(jù)疾病的發(fā)病原因，脊柱側(cè)凸既可以是原發(fā)疾病，也可以是神經(jīng)、肌肉疾病伴隨的繼發(fā)癥狀，目前尚無一種動(dòng)物模型可以完全模仿人類脊柱側(cè)凸完整的發(fā)病過程，因此在實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)具體的研究目的選擇脊柱側(cè)凸造模方法[1]。隨著對(duì)脊柱側(cè)凸這一疾病認(rèn)識(shí)的不斷加深，造模方法越來越成熟細(xì)致，結(jié)果也越來越接近臨床層面的脊柱側(cè)凸。藥物性誘導(dǎo)方法是在動(dòng)物胚胎或幼年期時(shí)通過體內(nèi)或體外采用化學(xué)藥物、激素等方法使動(dòng)物脊索、未成熟脊柱發(fā)育失衡誘導(dǎo)脊柱側(cè)凸，這種方法多用于研究致病因素及其機(jī)制，操作簡便，致畸效果明確，但許多藥物會(huì)引起全身其他系統(tǒng)功能障礙，目前可穩(wěn)定使用的造模方法有限。外部操作性誘導(dǎo)方法多為采用長時(shí)間畸形固定方法誘導(dǎo)發(fā)育期動(dòng)物脊柱偏向生長，許多操作的核心是重現(xiàn)脊柱側(cè)凸的外觀表現(xiàn)，因此對(duì)自發(fā)性脊柱側(cè)凸復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制涉及較少[2]，但此方法成功率高，適用物種廣泛，對(duì)脊柱形態(tài)學(xué)及生物力學(xué)研究意義重大。近年來，由于基因相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，通過基因編輯技術(shù)可以得到對(duì)疾病分子水平精準(zhǔn)定位的基因編輯動(dòng)物模型，它們?cè)诩膊⊙芯恐芯哂袠O其重要的地位。本文對(duì)近年來較為成熟的數(shù)種脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型制造方法進(jìn)行了總結(jié)，為研究者們提供了新的參考。

1 內(nèi)部藥物性誘導(dǎo)方式

1.1 激素水平異常模型

褪黑素作為生物節(jié)律的調(diào)節(jié)激素一直被認(rèn)為與脊柱側(cè)凸發(fā)生密切相關(guān)[3]。近來研究表明，褪黑素可以通過結(jié)合細(xì)胞表面廣泛存在的褪黑素受體2（MT2）調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路等一系列途徑，參與間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）向成骨細(xì)胞分化、成骨細(xì)胞增殖以及軟骨內(nèi)成骨等發(fā)育過程，與脊柱生長發(fā)育密切相關(guān)[4]。因此，學(xué)者們希望通過調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)褪黑素或MT2 水平誘導(dǎo)脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型，以此研究脊柱側(cè)凸的形態(tài)學(xué)改變以及褪黑素相關(guān)致病機(jī)制。目前降低發(fā)育動(dòng)物血清褪黑素水平的造模方法多樣，如通過連續(xù)給雙足SD 大鼠腹腔內(nèi)注射褪黑素受體拮抗劑2-苯基-N-乙酰色胺（Luzindole）誘導(dǎo)伴隨椎體高度增加的脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型[5]。近來，由于基因編輯技術(shù)的成熟，逐漸實(shí)現(xiàn)了對(duì)激素表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控，如通過敲除C57BL/6 小鼠褪黑素轉(zhuǎn)化酶相關(guān)NAT基因誘導(dǎo)脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型[6]，這樣可避免使用藥物誘導(dǎo)的不良反應(yīng)。目前低水平褪黑素的發(fā)病機(jī)制未完全明確，仍需通過動(dòng)物模型進(jìn)行進(jìn)一步研究。

雌激素是存在于人體內(nèi)的性激素之一，與褪黑素具有協(xié)同作用，可調(diào)節(jié)女性第二性征及骨代謝相關(guān)的生長節(jié)律[7]，它的異常對(duì)女性椎體骨化與骨密度維持影響較大，可導(dǎo)致發(fā)育中的脊柱出現(xiàn)側(cè)凸畸形[8]。此外，在實(shí)驗(yàn)中選用雌性動(dòng)物，脊柱側(cè)凸的發(fā)病率會(huì)更高[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，瘦素、骨橋蛋白和鈣調(diào)蛋白等激素也參與椎體骨化過程，通過調(diào)節(jié)它們的表達(dá)水平可以影響脊柱側(cè)凸的嚴(yán)重程度和進(jìn)展[10]，在誘導(dǎo)動(dòng)物模型時(shí)可以酌情使用，縮短造模時(shí)間。

未來仍需對(duì)動(dòng)物模型中脊柱側(cè)凸機(jī)制激素體系具體影響途徑進(jìn)行進(jìn)一步研究，這對(duì)于人類脊柱側(cè)凸疾病的研究具有深遠(yuǎn)意義。在研究時(shí)可以結(jié)合基因組測序及基因編輯等方法，更精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)激素表達(dá)或研究激素相關(guān)作用位點(diǎn)及通路。

1.2 單側(cè)椎旁肌注模型

直立動(dòng)物的椎旁肌對(duì)維持脊柱平衡具有重要作用[11]，當(dāng)出現(xiàn)長期椎旁肌力量失衡后，脊柱由于彎曲壓迫會(huì)出現(xiàn)側(cè)凸畸形。在造模時(shí)可以模擬脊柱雙側(cè)力學(xué)失衡的原理，采用單側(cè)注射改變肌力的藥物方式誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)生脊柱側(cè)凸。肉毒素是由肉毒桿菌在繁殖過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，它通過抑制神經(jīng)肌肉接頭處乙酰膽堿釋放阻滯神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致肌肉麻痹[12]。在單側(cè)椎旁肌肉多點(diǎn)注射A 型肉毒素可以造成椎旁單側(cè)肌肉無力以及脊柱曲度改變。但此方法存在動(dòng)物安全性等問題而無法廣泛使用。長期使用地塞米松會(huì)導(dǎo)致肌肉萎縮[13]，因此單側(cè)椎旁肌肉注射地塞米松誘導(dǎo)雙側(cè)椎旁肌力失衡是更安全的方法，可以考慮作為脊柱側(cè)凸造模方法來使用。研究發(fā)現(xiàn)，注射轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）可以改變肌肉內(nèi)膠原蛋白含量，從而改變肌肉傳遞力量的能力，這也可以達(dá)到誘導(dǎo)椎旁肌力失衡的目的[14]。通過藥物注射改變雙側(cè)肌力，不損傷動(dòng)物的神經(jīng)、內(nèi)分泌功能，是研究繼發(fā)性脊柱側(cè)凸病理變化的良好選擇之一。

1.3 低氧誘導(dǎo)模型

研究發(fā)現(xiàn)，妊娠小鼠經(jīng)低氧處理后胚胎細(xì)胞內(nèi)Notch 信號(hào)通路遭受破壞，這會(huì)導(dǎo)致胚胎前體節(jié)中胚層發(fā)育障礙，脊柱發(fā)育引導(dǎo)受損，最終出現(xiàn)脊柱側(cè)凸畸形。例如，將懷孕C57/BL 小鼠置于低氧環(huán)境中，出生小鼠會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的脊柱側(cè)凸合并多個(gè)半椎體、融合椎體或分裂椎體等畸形，這符合先天性脊柱側(cè)凸的表現(xiàn)[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，幼鼠脊柱側(cè)凸嚴(yán)重程度會(huì)隨著環(huán)境氧含量的減低而加重，在懷孕不同時(shí)期進(jìn)行低氧處理，幼鼠側(cè)凸節(jié)段也不相同[16]。因此，低氧誘導(dǎo)方法具有致畸結(jié)果可控的獨(dú)特優(yōu)勢，是研究自發(fā)性脊柱側(cè)凸合適的造模方法。但需要注意的是，過度的低氧誘導(dǎo)模型一般還會(huì)合并嚴(yán)重的心血管及各種器官疾病，死亡率高，且此方法對(duì)低氧條件要求苛刻，操作具有一定難度。

2 外部操作性誘導(dǎo)方式

2.1 脊柱雙側(cè)力學(xué)失衡模型

隨著手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步和固定器械的發(fā)展，脊柱固定的方式多種多樣，適用范圍十分廣泛[1]。對(duì)于小型動(dòng)物，多采用脊柱周圍間接固定的方式，在不損傷脊柱結(jié)構(gòu)的前提下可獲得穩(wěn)定的側(cè)凸模型。例如，通過內(nèi)固定或外固定的操作栓系幼齡雙足大鼠的肩胛骨及同側(cè)骨盆，這樣可以誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)性脊柱側(cè)凸模型，它不論從椎體結(jié)構(gòu)上還是椎旁肌改變上都與特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者生理特性相似[17]。對(duì)于山羊、豬等大型動(dòng)物，多采用使脊柱受力更連續(xù)且固定更牢靠的多重固定的方法將脊柱和肋骨等周圍結(jié)構(gòu)復(fù)合固定，這種方式涉及了肋骨固定及單側(cè)胸廓變形，會(huì)造成動(dòng)物模型單側(cè)肺部體積減小和呼吸功能減低，更符合實(shí)際脊柱側(cè)凸患者的臨床表現(xiàn)，是研究手術(shù)治療效果的良好模型[18]。脊柱硬性固定方式會(huì)導(dǎo)致椎間盤退變及椎體間融合，椎間盤生物學(xué)功能將極大喪失，這不利于對(duì)脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型的觀察。若選用脊柱柔性固定方式，脊柱就可保留一定范圍的活動(dòng)能力，動(dòng)物模型會(huì)保持一定的椎間盤功能，這更符合人類脊柱側(cè)凸的實(shí)際情況，同時(shí)柔性固定還在最大程度上保留了椎體再次生長的潛能，更有利于固定后的脊柱生長塑形[19-20]。

2.2 神經(jīng)損傷模型

臨床上部分青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸（AIS）患者的大腦或小腦存在解剖上的不對(duì)稱，這可能與AIS 發(fā)生發(fā)展有關(guān)。腦和脊髓作為神經(jīng)系統(tǒng)的一部分對(duì)身體不同功能的肌肉組進(jìn)行著精細(xì)且快速的調(diào)節(jié)，這是維持人類脊柱平衡系統(tǒng)的重要保障。損傷神經(jīng)系統(tǒng)功能后，脊柱受力失衡并逐漸發(fā)生脊柱側(cè)凸，如破壞幼齡大鼠半側(cè)大腦感覺皮質(zhì)或腦干等結(jié)構(gòu)后，雙側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)整合失衡，多數(shù)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)側(cè)凸畸形[21]。內(nèi)耳前庭器官作為平衡覺的重要部分在發(fā)育型脊柱側(cè)凸中越來越被重視。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，破環(huán)內(nèi)耳前庭器官后，動(dòng)物出現(xiàn)脊柱側(cè)凸表現(xiàn)，這可能是平衡感覺異常后脊柱無法維持平衡導(dǎo)致[22]。近年來，隨著基因技術(shù)的快速發(fā)展，與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的重要基因可以被人為調(diào)控并制造出脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型，這對(duì)神經(jīng)功能異常導(dǎo)致的脊柱側(cè)凸研究十分重要。

2.3 兩側(cè)非脊柱結(jié)構(gòu)不對(duì)稱改變模型

胸椎周圍結(jié)構(gòu)的對(duì)稱與完整性保障了其對(duì)脊柱傳導(dǎo)的力的平衡，若改變這種對(duì)稱結(jié)構(gòu)，隨著持續(xù)的呼吸及生長發(fā)育，胸椎會(huì)逐漸產(chǎn)生側(cè)凸畸形，應(yīng)注意由于胸廓與脊柱真正傳導(dǎo)力的連接結(jié)構(gòu)是肋椎關(guān)節(jié)[23]，破壞單側(cè)肋骨時(shí)一定要包含肋椎關(guān)節(jié)才能保證造模成功。研究發(fā)現(xiàn)，在破壞同一處肋骨時(shí)，采用不同入路對(duì)胸廓完整的張力系統(tǒng)影響不同，如肋骨內(nèi)側(cè)后方橫斷術(shù)可以造成豬的明顯側(cè)凸畸形，而前側(cè)和后外側(cè)入路手術(shù)致畸效果卻不明顯[24]。此方式僅針對(duì)胸椎側(cè)凸模型的建立，適用的物種范圍也較窄。

神經(jīng)中央軟骨是發(fā)育中脊柱椎體與椎弓根相連處的生長軟骨版，受損后會(huì)影響椎骨及椎弓根的發(fā)育[25]。有學(xué)者利用單側(cè)神經(jīng)中央軟骨受損后椎體及椎弓根發(fā)育不對(duì)稱原理成功構(gòu)建了脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型，如對(duì)3 周齡幼豬的脊柱單側(cè)連續(xù)植入椎弓根螺釘破壞中央軟骨后，該側(cè)椎體發(fā)育會(huì)較對(duì)側(cè)停滯，隨著生長，最終會(huì)出現(xiàn)脊柱側(cè)凸并伴隨椎體旋轉(zhuǎn)，這符合臨床上早發(fā)性脊柱側(cè)凸患者的表現(xiàn)[26]。此方法不破壞胸廓等正常結(jié)構(gòu)，對(duì)神經(jīng)損傷小。在造模時(shí)應(yīng)注意使用足夠低齡的動(dòng)物以確保神經(jīng)中央軟骨的存在，應(yīng)選擇較大型號(hào)的椎弓根釘以保證神經(jīng)中央軟骨的完全破壞。

3 基因編輯誘導(dǎo)模型

脊柱側(cè)凸發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未完全明確，隨著基因測序方法的成熟，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)脊柱側(cè)凸與基因關(guān)系密切，多種信號(hào)通路和分子異常表達(dá)都可以誘導(dǎo)出脊柱曲度變化。有學(xué)者通過家族連鎖性分析和散發(fā)性病例的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)了許多與脊柱側(cè)凸可能相關(guān)的基因變異位點(diǎn)[27]，篩選出了相關(guān)候選基因群，這對(duì)于脊柱側(cè)凸的研究意義重大。為了明確脊柱側(cè)凸相關(guān)分子及其機(jī)制，學(xué)者們開始通過基因編輯技術(shù)對(duì)胚胎的這些基因位點(diǎn)進(jìn)行單獨(dú)干預(yù)或同時(shí)聯(lián)合其他類型造模方法一起干預(yù)來誘導(dǎo)研究需要的脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型。通過觀察模型的各種表型以及分子生物學(xué)的異同點(diǎn)，可以更深入、準(zhǔn)確地研究誘導(dǎo)疾病發(fā)生的有效基因起始點(diǎn)和調(diào)節(jié)疾病進(jìn)展的基因關(guān)鍵點(diǎn)，因此基因編輯也成為了目前制造脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型的熱點(diǎn)方法之一。

目前通過基因篩選技術(shù)選擇出的脊柱側(cè)凸相關(guān)基因涉及軟骨發(fā)育、骨化、神經(jīng)發(fā)育等許多致病機(jī)制，通過基因編輯技術(shù)可以獲得相關(guān)表型的動(dòng)物模型，如編輯軟骨代謝調(diào)節(jié)和凋亡相關(guān)基因后會(huì)導(dǎo)致脊柱側(cè)凸伴隨椎骨發(fā)育異?；蜍浌莾?nèi)骨化過程的代謝障礙[28-30]，這有助于更好地展開對(duì)脊柱側(cè)凸相關(guān)機(jī)制及分子、通路的研究，觀察脊柱側(cè)凸整體進(jìn)展。脊柱骨化過程的異常一直也是脊柱側(cè)凸?jié)撛跈C(jī)制之一，通過基因編輯技術(shù)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞數(shù)量和功能后，脊柱發(fā)育過程中椎骨將出現(xiàn)不均勻骨化發(fā)育并伴隨脊柱曲度改變[31-32]。在脊柱側(cè)凸的研究中，肌肉不對(duì)稱性也一直被認(rèn)為是繼發(fā)性脊柱側(cè)凸的病因之一[14,33]，以往改變動(dòng)物模型肌肉力量的方法多為神經(jīng)手術(shù)或藥物注射，現(xiàn)在可以用基因編輯的方法誘導(dǎo)肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育異常[34-35]，基因編輯方式創(chuàng)傷更小，也更適合對(duì)先天性肌肉疾病導(dǎo)致的脊柱形態(tài)改變的研究。神經(jīng)對(duì)于肌肉的支配具有重要作用，神經(jīng)功能異常會(huì)使脊柱喪失平衡調(diào)節(jié)能力，誘發(fā)脊柱側(cè)凸。神經(jīng)功能異常涉及的疾病眾多，手術(shù)方式雖然可以直接影響局部神經(jīng)結(jié)構(gòu)達(dá)到致畸效果，但由于神經(jīng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜精細(xì)，對(duì)某些導(dǎo)致脊柱側(cè)凸的神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如神經(jīng)脫髓鞘疾病、本體感覺障礙等）用手術(shù)方式難以精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)。此外，手術(shù)對(duì)技術(shù)要求高，一般極容易損傷神經(jīng)周圍結(jié)構(gòu)，動(dòng)物死亡率高，并發(fā)癥多，這都極大限制了對(duì)疾病的研究，即使微創(chuàng)手術(shù)也不能完全避免無用損傷。采用基因編輯方法可以彌補(bǔ)手術(shù)造模方式創(chuàng)傷過大的不足，直接干預(yù)神經(jīng)發(fā)育，以便于更精細(xì)地研究脊柱側(cè)凸及某些特殊的神經(jīng)疾病，如NGLY1基因敲除大鼠模型會(huì)發(fā)生感覺、運(yùn)動(dòng)障礙等神經(jīng)表現(xiàn)并發(fā)生脊柱側(cè)凸[36]，Piezo2基因敲除可以導(dǎo)致動(dòng)物本體感覺喪失并出現(xiàn)脊柱側(cè)凸畸形，相關(guān)研究擴(kuò)大了本體感覺對(duì)骨骼系統(tǒng)發(fā)育的潛在影響[37]。脊索是脊柱形成前期在胚胎中起支撐和引導(dǎo)作用的細(xì)胞條索，在胚胎發(fā)育過程中脊索對(duì)于維持胚胎的對(duì)稱性發(fā)育至關(guān)重要[38-39]，也是脊柱形成保持平衡對(duì)稱的基礎(chǔ)，脊索發(fā)育異常與脊柱側(cè)凸關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，DSTYK基因改變可以導(dǎo)致斑馬魚胚胎的脊索液泡發(fā)生缺陷，胚胎對(duì)稱性生長狀態(tài)被破壞，脊柱發(fā)育生長出現(xiàn)畸形[40]。相關(guān)研究為先天性脊柱側(cè)凸的發(fā)病提供了新視角。

許多與脊柱側(cè)凸相關(guān)的位點(diǎn)已被先前的GWAS 確定為脊柱側(cè)凸的候選基因，部分基因編輯動(dòng)物脊柱側(cè)凸表型與人類相似，如調(diào)節(jié)TBX6家族基因?qū)е碌淖刁w畸形及脊柱側(cè)凸改變，是合適的疾病研究對(duì)象[41]。但不可忽視的是，由于目前大部分基因位點(diǎn)的生物學(xué)意義仍不完全明確，基因編輯的動(dòng)物模型仍存在許多缺陷，還需要進(jìn)行大量驗(yàn)證，許多基因編輯動(dòng)物除了脊柱側(cè)凸表現(xiàn)外還會(huì)出現(xiàn)各種基因相關(guān)聯(lián)合病變，如骨化調(diào)節(jié)Phospho1等基因異常動(dòng)物除了脊柱畸形外，還常伴有自發(fā)性骨折及全身軟骨發(fā)育異常等表現(xiàn)[42]，這種全身性表現(xiàn)在一般的脊柱側(cè)凸患者中并不常見，說明某些基因動(dòng)物模型僅適合特殊基因疾病的研究，并不能應(yīng)用于脊柱側(cè)凸一般研究中。此外，基因動(dòng)物價(jià)格昂貴、可應(yīng)用物種較少，還無法廣泛應(yīng)用。

目前，第三代測序技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)等遺傳研究方法的出現(xiàn)有助于更準(zhǔn)確、方便地檢測脊柱側(cè)凸相關(guān)染色體變異和基因突變，上述困難也在逐漸被克服。鑒于基因編輯方法的優(yōu)勢和潛力，這種精準(zhǔn)的造模方式必將受到越來越多的關(guān)注，成為未來實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模方法的新趨勢，結(jié)合基因編輯技術(shù)制造的動(dòng)物模型在今后數(shù)年內(nèi)必將幫助脊柱側(cè)凸的研究。

4 結(jié)語

人類脊柱側(cè)凸的病因及機(jī)制復(fù)雜多樣，目前的動(dòng)物模型大多是模擬已知的某種單一致病機(jī)制誘導(dǎo)動(dòng)物致畸，雖然越來越接近人類脊柱側(cè)凸的表現(xiàn)，但沒有一種動(dòng)物模型可以完全模仿人類脊柱側(cè)凸完整的發(fā)病過程。因此，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)在確定研究目標(biāo)后選擇最合理的建模方法去制造動(dòng)物模型，才能更好地完成對(duì)疾病機(jī)制的探索。