微滴式數(shù)字PCR技術(shù)定量檢測發(fā)酵乳中醋化醋桿菌

張雅倫，王 贊，張 瑞，陳勃旭，周 巍*，張 巖*

（河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（特殊食品監(jiān)管技術(shù)），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北 石家莊 050227）

發(fā)酵乳因含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類等多種營養(yǎng)物質(zhì)，備受人們喜愛[1-4]，但發(fā)酵乳因其產(chǎn)品獨(dú)特條件限制，極易在制備流程、流通過程、貯藏環(huán)境等中受到其他因素影響而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降，其中微生物污染對其帶來的影響最為嚴(yán)重且難以控制[5-7]。醋化醋桿菌常被發(fā)現(xiàn)于腐爛的水果和產(chǎn)酸的食品中，其導(dǎo)致食品變質(zhì)酸敗的作用也逐漸為人熟知[8]。醋化醋桿菌同時(shí)也會造成發(fā)酵乳的污染，使其益生菌群結(jié)構(gòu)改變，在酸乳表面形成菌膜，產(chǎn)生脹包和酸澀味等不良現(xiàn)象[9]。當(dāng)今發(fā)酵乳等乳制品的質(zhì)量和安全問題受到人們廣泛關(guān)注，一旦受微生物污染的發(fā)酵乳流入市場，不但會對生產(chǎn)企業(yè)聲譽(yù)造成損害，帶來經(jīng)濟(jì)效益的巨大損失，還會對消費(fèi)者的身體健康造成影響，危及生命安全。因此，不同環(huán)節(jié)的精準(zhǔn)、定量掌控發(fā)酵乳中的污染情況，對發(fā)酵乳的質(zhì)量至關(guān)重要[10-11]。

2.2 家系Ⅱ 檢出致病基因?yàn)镃DH23基因的c.7240-1G>A和c.7252G>A兩個(gè)位點(diǎn)復(fù)合雜合突變；2名耳聾患者(Ⅱ2、Ⅱ3)視力、視野、眼底檢查未見異常。CDH23基因c.7252G>A位點(diǎn)突變?yōu)閲鴥?nèi)首報(bào)新突變位點(diǎn)，結(jié)果、家系圖及測序突變。見表1、表2、圖1、圖2。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)自發(fā)明以來，已被廣泛應(yīng)用于微生物檢驗(yàn)，推動了檢驗(yàn)領(lǐng)域快速發(fā)展。第1代普通PCR技術(shù)通過凝膠電泳方式進(jìn)行分析，但只能用于樣品定性檢驗(yàn)和半定量研究[12-17]。第2代熒光PCR技術(shù)通過反應(yīng)體系熒光信號進(jìn)行分析，雖然與第1代技術(shù)相比提升了檢驗(yàn)速度，減少了非特異性擴(kuò)增，增加了精準(zhǔn)性，但其定量計(jì)算是相對的，受到很大應(yīng)用限制，不能達(dá)到定量分析要求[18-21]。隨著定量分析需求日益增加，第3代數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)和熒光PCR技術(shù)相比具有高靈敏度、高精確度、高耐受性、絕對定量等特性，可以將一個(gè)傳統(tǒng)PCR反應(yīng)激發(fā)成數(shù)萬個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)，極大降低了其他因素影響，并且ddPCR方法無需依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線和循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值，直接計(jì)算出樣品的拷貝數(shù)，從而達(dá)到精準(zhǔn)定量[22]。基于以上特點(diǎn)，ddPCR方法能夠滿足精準(zhǔn)定量檢測發(fā)酵乳中醋化醋桿菌的需求，該方法具有廣泛應(yīng)用前景[23-25]。

本研究基于ddPCR技術(shù)建立發(fā)酵乳中醋化醋桿菌的檢測方法，并對其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，對其特異性和靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證，采用定量方法進(jìn)行計(jì)算，為發(fā)酵乳中污染菌的定量檢測提供一定的理論依據(jù)，為發(fā)酵乳生產(chǎn)企業(yè)的過程把控提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳購于當(dāng)?shù)爻?，?shí)驗(yàn)用菌株來自于有編號保存菌株，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Table 1 Strains used in the study

2×ddPCR技術(shù)探針檢測法混勻體系、微滴專用激發(fā)油和專用分析油 美國Bio-Rad公司；正向（反向）引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（磁珠式）、Reagent D 德國Biotecon Diagnostics公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、醋酸菌培養(yǎng)基、乳桿菌培養(yǎng)基、彎曲菌培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、雙歧桿菌培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、3.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基、牛肉膏微量元素培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

3.綜上所述，提高濕地保護(hù)科學(xué)性，還要加大濕地保護(hù)投入，創(chuàng)新濕地保護(hù)載體，注重法制化的開展?jié)竦乇Ｗo(hù)相關(guān)工作，在標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范化的原則下建立完善的濕地保護(hù)框架，從而系統(tǒng)化的解決濕地保護(hù)中的現(xiàn)實(shí)問題。

1.2 儀器與設(shè)備

QX200 ddPCR檢測分析系統(tǒng)（包括微滴激發(fā)生成儀、微滴檢測分析儀、DG8 cartridge微滴生成卡）、C1000 Touch Thermal Cycler PCR基因擴(kuò)增設(shè)備 美國Bio-Rad公司；NanoDrop Lite核酸測定儀、711基因組全自動提取儀 美國Thermo公司；DK-98-1恒溫水浴鍋東方電工儀器廠；BHC-300IIA/B3生物安全檢驗(yàn)柜 蘇州凈化儀器設(shè)備有限公司；3K15臺式高速離心機(jī) 美國Sigma公司。

1.3 方法

將市售發(fā)酵乳進(jìn)行121 ℃、30 min高壓滅菌，無菌操作進(jìn)行醋化醋桿菌人工污染，分別將其按照不同濃度梯度添加到發(fā)酵乳中，使其含量維持在101～107CFU/g，并通過上述方法進(jìn)行基因組DNA提取和ddPCR法檢測，得出該方法的檢出限。

1.3.1.1 Reagent D處理細(xì)菌培養(yǎng)液

對試題的知識點(diǎn)分布明細(xì)統(tǒng)計(jì)可反映命題決策者對考試大綱標(biāo)準(zhǔn)的理解和判斷.實(shí)際對7套真題中知識點(diǎn)分布明細(xì)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)：

在小區(qū)門前，杜一朵碰見了一個(gè)熟人。熟人問她一大早忙什么去？杜一朵隨口說，打牌去。都曉得杜一朵愛打牌，且打得一手好牌。熟人也沒多想，點(diǎn)點(diǎn)頭就過去了。后來熟人又遇見一個(gè)熟人，熟人慣性地問，你也打牌去？那人兩眼通紅大著嗓門說，清晨八早打個(gè)屁！打炮！

1.3.1.2 FoodProof磁珠提取法

ddPCR反應(yīng)體系：2×ddPCR探針混勻體系10 μL、1.2 μL正向和反向引物及0.4 μL探針（濃度均為10 μmol/L），加入4.4 μL樣品DNA，使用ddH2O將體系補(bǔ)至20 μL。將反應(yīng)體系充分混勻轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生板中，并加入70 μL微滴專用激發(fā)油后放到微滴發(fā)生器中進(jìn)行激發(fā)。將生成的微滴通過PCR反應(yīng)，初始條件：95 ℃、10 min，94 ℃、1 min，58 ℃、45 s，共計(jì)40 次循環(huán)；98 ℃、10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后放入QX200 Droplet Reader采集熒光信號，最終通過微滴QuantaSoft分析軟件計(jì)算得出結(jié)果。

將傳代培養(yǎng)3 次的菌株培養(yǎng)液充分混勻，吸取100 μL增菌液和400 μL Reagent D到2 mL無菌離心管中，在室溫條件下避光靜置5 min；在500 W鹵素?zé)粝路?5～20 cm處放置離心管，曝光5 min后，8 000 r/min離心5 min，去除上清液；加入100 μL無菌水充分混勻，用于后續(xù)DNA提取。

1.3.2 醋化醋桿菌特異性引物設(shè)計(jì)

通過分析醋化醋桿菌的基因序列，從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取保守性強(qiáng)且特異性強(qiáng)的基因序列，最終選定醋化醋桿菌ITS基因?yàn)榘袠?biāo)序列，通過Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物序列，并通過Oligo 7.37進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)實(shí)驗(yàn)后獲得醋化醋桿菌特異性檢測引物，如表2所示。

“互聯(lián)網(wǎng)+教育”打破傳統(tǒng)的