磷脂酶D 的大腸桿菌表達系統(tǒng)及其轉(zhuǎn)?；呋钚?/h1>
2023-06-07 11:17:12程青謝志鵬
浙江大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版) 2023年3期
程青，謝志鵬
（浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥物生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058）
磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是生物膜磷脂的重要組成成分［1］，可以調(diào)控細胞膜中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)［2］、平衡情緒［3］、改善記憶力［4］和緩解阿爾茨海默氏病癥狀［5］、增強運動員的恢復(fù)能力［6］。目前，PS 的制備方法主要有化學(xué)提取法和生物酶催化法。化學(xué)提取法成本高、產(chǎn)率低，且動物原料存在安全隱患［7］。生物酶催化法，以磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和L-絲氨酸為原料，以磷脂酶D（phospholipase D，PLD）為催化劑，簡單高效，反應(yīng)溫和，更適合PS的規(guī)?；a(chǎn)［8］。
PLD（EC 3.1.4.4）可催化2 種反應(yīng)：（1）水解反應(yīng)，催化PC 的磷酸二酯鍵水解，生成磷脂酸和膽堿；（2）轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，將PC 的磷脂頭部轉(zhuǎn)移至其他受體醇［9-10］。PLD 廣泛存在于動植物以及微生物的生物膜中［11］。相對于動植物來源的PLD，微生物來源的PLD，尤其是鏈霉菌屬（Streptomyces）來源的PLD，具有更強的轉(zhuǎn)磷脂能力和更廣泛的底物專一性［12］。
野生鏈霉菌表達PLD 發(fā)酵周期長且酶活水平低，目前獲得PLD 的常用手段是對PLD 進行分子改造，將其異源表達到其他工程菌。大腸桿菌具有生長周期短、培養(yǎng)成本低、易于操作等優(yōu)點，是PLD 的主要異源表達系統(tǒng)，也有研究利用其他宿主菌表達PLD，如畢赤酵母、變鉛鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌等。LIU 等［13］在畢赤酵母表面展示PLD，當誘導(dǎo)108 h 時，轉(zhuǎn)?；盍_到最大，為315 U·g-1（細胞干重），但與大腸桿菌表達PLD 相比，發(fā)酵周期過長。NAKAZAWA 等［14］通過構(gòu)建大腸桿菌-變鉛鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，在變鉛鏈霉菌中分泌表達PLD，培養(yǎng)60 h 后酶活高達30 U·mL-1，但需經(jīng)硫酸銨沉淀，從培養(yǎng)基上清中分離PLD 蛋白。HUANG 等［15］利用枯草芽孢桿菌WB600 分泌表達PLD，但需將發(fā)酵液經(jīng)過鎳柱洗脫得到純PLD。HOU 等［16］首次使用谷氨酸棒桿菌分泌表達PLD，但從培養(yǎng)基上清中獲得的PLD 粗酶液，需使用較為昂貴的腦浸出液培養(yǎng)基。由于PLD 的表達對大腸桿菌宿主有毒害作用，在不誘導(dǎo)時，PLD 的微量滲漏表達也會導(dǎo)致其細胞死亡或質(zhì)粒丟失［17］，從而令PLD 產(chǎn)量降低。XIONG 等［18］將大腸桿菌作為PLD 表達宿主，在質(zhì)粒中加入穩(wěn)定基因，使用嚴謹型啟動子，質(zhì)粒穩(wěn)定性在傳代5 次后仍為100%，5 L 發(fā)酵罐中的酶活達120 U·mL-1，但需經(jīng)硫酸鹽沉淀、鎳柱洗脫等復(fù)雜純化過程。ZHANG 等［19］通過自轉(zhuǎn)運蛋白ADIA-I，在大腸桿菌表面展示PLD，雖然避免了PLD 的純化，但誘導(dǎo)48 h后，酶活僅為0.074 U·mL-1。目前，已有的PLD 表達方式存在細胞發(fā)酵周期長、分離純化步驟煩瑣、培養(yǎng)成本較高等問題。
本研究旨在通過系統(tǒng)性地對比研究大腸桿菌胞內(nèi)表達、分泌表達和表面展示3 種方式對PLD 酶活及其PS 催化合成效率的影響，探索全細胞催化制備PS 的可行性及最適方式，以期大幅縮短PLD 高效活性表達所需的發(fā)酵時長，優(yōu)化操作煩瑣、耗時、成本高昂的PLD 分離純化工序。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 株
大腸桿菌表達宿主Escherichia coli BL21（DE3）和克隆宿主Escherichia coli DH5α 菌株均為實驗室保藏。
1.1.2 主要酶與試劑
膽堿氧化酶購于上海源葉生物科技有限公司，辣根過氧化物酶購于上海生工公司，磷脂酰膽堿（98%）、磷脂酰絲氨酸（99%）購于Sigma-Aldrich 公司，L-絲氨酸（99%）購于上海麥克林生化科技公司。
1.2 方 法
1.2.1 重組菌株的構(gòu)建
構(gòu)建胞內(nèi)表達、分泌表達和表面展示3 種方式的PLD 表達重組菌株，見表1。
表1 表達PLD 的菌株Table 1 The strains for expression of PLD
胞內(nèi)表達菌株BL-PLD。基于大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化Streptomyces halstedii 來源的pld 基因（AB062136.1），由擎科生物公司合成，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株而得。
采用限制性內(nèi)切酶Hind III 和BamH I 對合成的pET28a（+）-PLD 載體和pET22b（+）空載體進行雙酶切，連接后得到重組質(zhì)粒pET22b（+）-PLDp。以pET22b（+）-PLDp 為模板，將pelB 信號肽分別替換為FhuD、OmpA、DsbA 信號肽，得到分泌表達載體pET22b（+）-PLDo、pET22b（+）-PLDd、pET22b（+）-PLDf，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株，得到分泌表達菌株P(guān)LD-PelB、PLD-OmpA、PLDDsbA、PLD-FhuD。所用信號肽及其序列如表2所示。
表2 分泌表達載體及其信號肽Table 2 Secreted expression vectors and their signal peptides
表面展示菌株P(guān)LD-EhaA。N 端CtxB 信號肽序列、EhaA 自轉(zhuǎn)運蛋白連接子區(qū)域、β 折疊區(qū)域由擎科生物公司合成，插入pET28a（+）-PLD 載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）進行蛋白表達。
1.2.2 水解酶活檢測
由于PLD 的轉(zhuǎn)?；富顧z測方法煩瑣、耗時，而PLD 的水解酶活與轉(zhuǎn)酰基酶活存在正相關(guān)性［20］，且水解酶活檢測方法簡便、快速，故在進行條件優(yōu)化時用水解酶活表征轉(zhuǎn)?；富?。采用酶連比色法［21］，通過檢測膽堿的物質(zhì)的量測定水解酶活。PLD 的一個水解酶活單位（U）定義為每分鐘催化底物PC 水解產(chǎn)生1 μmol 膽堿所需的酶量。
分別取胞內(nèi)表達菌株和分泌表達菌株的發(fā)酵液1 mL，離心后，用Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液重懸菌體，超聲破碎，得到PLD 粗酶液。稀釋一定倍數(shù)后，取100 μL 進行水解酶活檢測。取表面展示菌株發(fā)酵液1 mL，離心后用緩沖液重懸稀釋菌體，取100 μL 細胞懸液檢測酶活。
1.2.3 PLD 轉(zhuǎn)?；磻?yīng)合成PS
在水-乙酸乙酯兩相體系中，分別以全細胞和來源于胞內(nèi)表達菌株、分泌表達菌株的粗酶液為催化劑，催化PC 和L-絲氨酸合成PS［22］。兩相反應(yīng)體系混合液包括3 mL 含10 mg·mL-1PC 的乙酸乙酯溶液、1 mL 含90 mg·mL-1L-絲氨酸和15 mmol·L-1CaCl2的乙酸鈉緩沖液（100 mmol·L-1，pH 5.5）、0.5 mL 粗酶液或全細胞懸液。將混合液置于40 ℃、200 r·min-1搖床中振蕩12 h，加入4.5 mL Floch 溶液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），離心后取有機相，采用高效液相色譜（HPLC）法測定磷脂。
在純水相體系中，在LIU 等［13］方法的基礎(chǔ)上略做了修改。純水相反應(yīng)體系混合液包括1 mL 含10 mmol·L-1PC 的5% Triton X-100 溶液、1 mL 含40 mmol·L-1L-絲氨酸的100 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）、150 μL 含10 mmol·L-1CaCl2水溶液及1 mL 粗酶液或全細胞懸液。將混合液置于40 ℃、200 r·min-1搖床中振蕩12 h。采用HPLC 法測定磷脂。
1.2.4 高效液相色譜檢測
采用配備紫外檢測器的安捷倫1260 高效液相色譜儀，選用安捷倫ZORBAX Rx-SIL 硅膠色譜柱（5 μm，150 mm×4.6 mm），以乙腈、甲醇、85% 磷酸混合液（V∶V∶V=100∶10∶0.8）為流動相，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長205 nm。
1.2.5 掃描電鏡制樣及觀察
（1）固定：將細菌樣品懸浮于0.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定過夜。倒掉固定液，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗樣品3 次，每次15 min。再用1%鋨酸溶液固定樣品1～2 h，小心取出鋨酸廢液，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗樣品3 次，每次15 min。
（2）脫水：依次用體積分數(shù)為30%，50%，70%，80%，90%和95%的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15 min。最后用無水乙醇脫水處理20 min，并將細胞樣品保存于無水乙醇中。
（3）干燥：在Hitachi HCP-2 型臨界點干燥儀中干燥。
（4）觀察：鍍膜，將處理好的樣品置于Hitachi SU-8010 型掃描電鏡中觀察。
1.2.6 重組PLD 的表達及發(fā)酵條件優(yōu)化
LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1。將重組菌BL-PLD 接種至50 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r·min-1搖床過夜培養(yǎng)，得種子液。
MTB（Modified Terrific Broth）培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g·L-1，酵母提取物24 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，K2HPO472 mmol·L-1，KH2PO472 mmol·L-1。將1%種子液接種至150 mL MTB 培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至菌濃（發(fā)酵液在600 nm 處的吸光度）為0.4～0.6，添加IPTG 至濃度為0.1 mmol·L-1，于25 ℃、220 r·min-1繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
采用單因素法，分別探究誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時的OD600、IPTG 濃度、誘導(dǎo)時長等對PLD 表達量的影響。
2 結(jié)果與討論
2.1 重組菌株
2.1.1 胞內(nèi)表達菌株
經(jīng)過優(yōu)化，胞內(nèi)表達菌株的密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）從0.71 提升至0.96，DNA 序列中鳴嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的堿基對的占比（GC 含量）從71%降至52%。
2.1.2 分泌表達菌株
信號肽是用于指導(dǎo)目的蛋白跨膜轉(zhuǎn)移或定位的氨基酸序列。通過將適當?shù)男盘栃蛄腥诤现涟械鞍谆虻腘 端，如大腸桿菌宿主，令異源蛋白分泌至周質(zhì)空間，從而增強其溶解度并避免形成包涵體。不同信號肽分泌蛋白的途徑不同，參照文獻［23］，選擇PelB、OmpA、FhuD 和DsbA 4 種信號肽，研究不同信號肽對PLD 分泌表達的差異。
2.1.3 表面展示菌株
ZHANG 等［19］通過自轉(zhuǎn)運蛋白AIDA-I 將PLD成功展示在大腸桿菌細胞表面［19］，說明將大腸桿菌作為PLD 展示菌株是可行的，但誘導(dǎo)48 h 后酶活僅為0.074 U·mL-1，可能是因為自轉(zhuǎn)運蛋白AIDA-I的轉(zhuǎn)運效率較低。另外，TOZAKIDIS 等［24］借助自轉(zhuǎn)運蛋白EhaA 成功將酯酶展示在大腸桿菌細胞表面，且獲得較高的酶活，故選擇自轉(zhuǎn)運蛋白EhaA 在大腸桿菌表面進行展示。
EhaA 是來自大腸桿菌O157：H7 EDL933 基因組的一種自轉(zhuǎn)運蛋白，其與PLD 融合的自轉(zhuǎn)運系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1（a）所示，包括三部分：（1）N 端的CtxB信號肽［25］；（2）C 末端的自轉(zhuǎn)運蛋白EhaA，包含連接子和β-折疊區(qū)域［26］；（3）PLD 作為“乘客”蛋白，位于N 端與C 端之間。PLD 轉(zhuǎn)運過程如圖1（b）所示，CtxB 信號肽通過Sec 引導(dǎo)PLD 蛋白穿過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運［27］至周質(zhì)空間，同時信號肽被裂解。通過形成孔狀結(jié)構(gòu)，將β-折疊結(jié)構(gòu)域整合至細胞外膜，而連接子結(jié)構(gòu)域穿過β-折疊結(jié)構(gòu)域并充當連接結(jié)構(gòu)，以允許PLD 蛋白暴露在細胞外部。
圖1 EhaA 自轉(zhuǎn)運載體示意Fig.1 Schematic of EhaA autotransporter
2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化
圖2 展示了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時的OD600、誘導(dǎo)物濃度對大腸桿菌表達PLD 的影響。
圖2 PLD 發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of the fermentation conditions
首先，在16～32 ℃條件下誘導(dǎo)PLD 表達，發(fā)酵結(jié)束后檢測PLD 的水解酶活。圖2（a）表明，在20 ℃時，PLD 水解酶活最高。隨著溫度上升，酶活急劇下降，說明PLD 更傾向于較低溫度的誘導(dǎo)表達，溫度對PLD 的誘導(dǎo)表達較為關(guān)鍵。
其次，為探究誘導(dǎo)時的最佳細胞量，分別在OD600為0.4～1 時進行誘導(dǎo)。圖2（b）表明，當OD600=0.7時，PLD 水解酶活最高。若過早誘導(dǎo)PLD 表達，則不利于菌體生長，PLD 最終表達量較低，說明在誘導(dǎo)PLD 表達前需積累足夠多的細胞量。當OD600＞0.7 時，隨著OD600的增加，酶活反而降低，這可能是由于菌體生長已經(jīng)偏離了對數(shù)生長期，菌體活力下降，導(dǎo)致PLD 表達量下降。
最后，為探究PLD 表達的最佳IPTG 濃度，設(shè)置IPTG 濃度為0.05～1.50 mmol·L-1。圖2（c）表明，0.3 mmol·L-1的IPTG 可獲得最佳PLD 酶活。當IPTG 濃度超過0.4 mmol·L-1時，隨著濃度的升高，酶活反而降低，這可能是由于濃度過高導(dǎo)致PLD 形成沒有活性的包涵體，且過高濃度的IPTG 對細胞具有毒害作用，影響細胞生長，從而降低酶活。
2.3 誘導(dǎo)時長對酶活的影響
圖3 展示了不同PLD 表達菌株的誘導(dǎo)時長與PLD 水解酶活的關(guān)系。隨著誘導(dǎo)時長的增加，PLD 水解酶活不斷升高。當誘導(dǎo)達8 h 時，胞內(nèi)表達菌株BL-PLD 的水解酶活最高，為0.35 U·mL-1；分泌表達菌株中的PLD-PelB 水解酶活次之，為0.23 U·mL-1；表面展示菌株P(guān)LD-EhaA 的水解酶活較低，為0.11 U·mL-1。這可能是由于胞內(nèi)表達菌株和分泌表達菌株的細胞經(jīng)超聲破碎后，粗酶液中的PLD與底物PC 的接觸更加充分，故在檢測酶活的較短時間內(nèi)，其水解酶活較全細胞的PLD-EhaA 更高。
圖3 誘導(dǎo)時長對PLD 水解酶活的影響Fig.3 Effect of induction time on PLD hydrolysis activity
在分泌表達菌株中，PLD-PelB的水解酶活最高；其次是PLD-FhuD，其酶活為0.17 U·mL-1；PLDOmpA 和PLD-DsbA 的酶活均在0.10 U·mL-1左右。所以，選擇PelB信號肽做進一步研究。
總之，在PLD 的N 端連接信號肽后，其酶活反而比未連接信號肽的菌株更低。這與MISHIMA等［28］的研究結(jié)果類似，由于PLD 蛋白被信號肽轉(zhuǎn)移至周質(zhì)空間后不斷積累，可能對宿主細胞有害，也可能導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定甚至丟失，從而降低酶活。
收集誘導(dǎo)表達PLD 8 h 的大腸桿菌細胞，用掃描電鏡觀察3 種方式下大腸桿菌細胞的形態(tài)變化，如圖4 所示。無質(zhì)粒的對照菌株細胞結(jié)構(gòu)完整，呈短桿狀，兩端鈍圓形，如圖4（a）所示。在3 種表達方式下大腸桿菌細胞結(jié)構(gòu)均受到一定程度的破壞，如出現(xiàn)不同程度的變形、斷裂、塌陷等，有的細胞表面形成孔洞，有的細胞裂解出內(nèi)容物，如圖4（b）～（d）所示。其中，分泌表達菌株P(guān)LD-PelB 的細胞變形塌陷情況最為嚴重。與對照菌株相比，分泌表達菌株和胞內(nèi)表達菌株的細胞表面更光滑。此外，表達PLD 蛋白之后的細胞更長，這可能是由于PLD 會影響細胞的有絲分裂，促進細胞增殖［29］。
圖4 大腸桿菌的掃描電鏡結(jié)果Fig.4 Scanning electron microscope images of E.coli.
綜上，誘導(dǎo)PLD 表達的最佳條件為溫度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 濃度0.3 mmol·L-1，誘導(dǎo)時長8 h。
2.4 PLD 轉(zhuǎn)?；磻?yīng)合成PS
2.4.1 反應(yīng)介質(zhì)對酶促合成PS 產(chǎn)率的影響
菌株BL-PLD 誘導(dǎo)8 h 后，以1 mL 發(fā)酵液破碎后的粗酶液為催化劑，在40 ℃下反應(yīng)12 h 制備PS。比較了純水相和兩相體系的PS 產(chǎn)率，如圖5（a）所示。在純水相體系中，PS 產(chǎn)率僅為13.71%，是兩相體系中PS 產(chǎn)率的40%。這是因為在PLD 與底物PC 反應(yīng)過程中，存在生成磷脂酸的副反應(yīng)，而純水相體系會促進磷脂酸的生成［30］，導(dǎo)致PS 產(chǎn)率下降。故選擇用兩相體系制備PS。
圖5 PS 產(chǎn)率液相檢測結(jié)果Fig.5 HPLC analysis of PS yield
2.4.2 不同PLD 表達方式對PS 產(chǎn)率的影響
為進一步獲取PLD-EhaA、PLD-PelB 和BLPLD 3 種菌株的PS 產(chǎn)率，在誘導(dǎo)8 h 后離心收集菌體，按1 g 細胞加15 mL 緩沖液的比例，分別添加對應(yīng)體積的Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液，重懸菌體，取1 mL 細胞懸液催化PC；另取1 mL 超聲破碎粗酶液催化PC，結(jié)果如圖5（b）所示。可知，無論是使用粗酶液還是全細胞催化PC，PLD-EhaA 的PS 產(chǎn)率均較高，其中全細胞催化的PS 產(chǎn)率可達59.1%；PLDPelB 和BL-PLD 的PS 產(chǎn)率均在30%左右。
對于PLD-PelB 和BL-PLD 菌株，細胞經(jīng)超聲破碎后，PLD 粗酶液與底物PC 接觸更加充分，反應(yīng)效率更高，故粗酶液催化的PS 產(chǎn)率比全細胞催化高。在兩相體系反應(yīng)前期，可能粗酶液催化底物PC產(chǎn)生PS 的速率較快，但在反應(yīng)后期，有機溶劑影響了酶的結(jié)構(gòu)，進而影響PLD 酶活［31］。故反應(yīng)12 h后，粗酶液催化與全細胞催化PS 產(chǎn)率相差不大。
對于PLD-EhaA 菌株，大腸桿菌細胞通過EhaA 轉(zhuǎn)運蛋白，將PLD 轉(zhuǎn)移至細胞外膜。全細胞催化PC 能避免有機溶劑與酶液直接接觸，從而保持PLD 酶活。故PLD-EhaA 菌株全細胞催化PC的PS 產(chǎn)率較細胞破碎粗酶液催化的高。
在大腸桿菌細胞表面展示PLD 的優(yōu)勢在于，大腸桿菌產(chǎn)生的酶被連接并固定在細胞表面，避免了費時費力且昂貴的酶分離純化步驟［32］，且底物或產(chǎn)物均不需穿過細胞膜屏障［33］，大大降低了傳質(zhì)阻力。此外，PLD 表面展示方式還可用于PLD 固化，更適合規(guī)?；苽銹S?？傊?，PLD 表面展示是降低生物催化轉(zhuǎn)化過程成本的一種非常有效的方法。
3 結(jié)論
利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，研究了胞內(nèi)表達、分泌表達和表面展示3 種方式對PLD 酶活及其磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）催化合成效率的影響。結(jié)果表明，大腸桿菌表達PLD 的最佳誘導(dǎo)條件為溫度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 濃度0.3 mmol·L-1。在最適條件下，3 種方式的PLD 水解酶活均在誘導(dǎo)表達8 h 時達最高值，分別為0.35，0.23，0.11 U·mL-1。進一步比較了胞內(nèi)表達菌株、分泌表達菌株以及表面展示菌株的PS 產(chǎn)率，結(jié)果表明，在水-乙酸乙酯兩相體系中，PLD 表面展示菌株的PS 產(chǎn)率最高，為59.1%。采用自轉(zhuǎn)運蛋白EhaA 對PLD 進行表面展示，用全細胞催化底物，后期不需要對蛋白進行分離純化，大大降低了底物或產(chǎn)物穿過細胞膜屏障的傳質(zhì)阻力。研究對工業(yè)化利用大腸桿菌生產(chǎn)PS 具有一定的指導(dǎo)意義。
程青，謝志鵬
（浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥物生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058）
磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是生物膜磷脂的重要組成成分［1］，可以調(diào)控細胞膜中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)［2］、平衡情緒［3］、改善記憶力［4］和緩解阿爾茨海默氏病癥狀［5］、增強運動員的恢復(fù)能力［6］。目前，PS 的制備方法主要有化學(xué)提取法和生物酶催化法。化學(xué)提取法成本高、產(chǎn)率低，且動物原料存在安全隱患［7］。生物酶催化法，以磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和L-絲氨酸為原料，以磷脂酶D（phospholipase D，PLD）為催化劑，簡單高效，反應(yīng)溫和，更適合PS的規(guī)?；a(chǎn)［8］。
PLD（EC 3.1.4.4）可催化2 種反應(yīng)：（1）水解反應(yīng)，催化PC 的磷酸二酯鍵水解，生成磷脂酸和膽堿；（2）轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，將PC 的磷脂頭部轉(zhuǎn)移至其他受體醇［9-10］。PLD 廣泛存在于動植物以及微生物的生物膜中［11］。相對于動植物來源的PLD，微生物來源的PLD，尤其是鏈霉菌屬（Streptomyces）來源的PLD，具有更強的轉(zhuǎn)磷脂能力和更廣泛的底物專一性［12］。
野生鏈霉菌表達PLD 發(fā)酵周期長且酶活水平低，目前獲得PLD 的常用手段是對PLD 進行分子改造，將其異源表達到其他工程菌。大腸桿菌具有生長周期短、培養(yǎng)成本低、易于操作等優(yōu)點，是PLD 的主要異源表達系統(tǒng)，也有研究利用其他宿主菌表達PLD，如畢赤酵母、變鉛鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌等。LIU 等［13］在畢赤酵母表面展示PLD，當誘導(dǎo)108 h 時，轉(zhuǎn)?；盍_到最大，為315 U·g-1（細胞干重），但與大腸桿菌表達PLD 相比，發(fā)酵周期過長。NAKAZAWA 等［14］通過構(gòu)建大腸桿菌-變鉛鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，在變鉛鏈霉菌中分泌表達PLD，培養(yǎng)60 h 后酶活高達30 U·mL-1，但需經(jīng)硫酸銨沉淀，從培養(yǎng)基上清中分離PLD 蛋白。HUANG 等［15］利用枯草芽孢桿菌WB600 分泌表達PLD，但需將發(fā)酵液經(jīng)過鎳柱洗脫得到純PLD。HOU 等［16］首次使用谷氨酸棒桿菌分泌表達PLD，但從培養(yǎng)基上清中獲得的PLD 粗酶液，需使用較為昂貴的腦浸出液培養(yǎng)基。由于PLD 的表達對大腸桿菌宿主有毒害作用，在不誘導(dǎo)時，PLD 的微量滲漏表達也會導(dǎo)致其細胞死亡或質(zhì)粒丟失［17］，從而令PLD 產(chǎn)量降低。XIONG 等［18］將大腸桿菌作為PLD 表達宿主，在質(zhì)粒中加入穩(wěn)定基因，使用嚴謹型啟動子，質(zhì)粒穩(wěn)定性在傳代5 次后仍為100%，5 L 發(fā)酵罐中的酶活達120 U·mL-1，但需經(jīng)硫酸鹽沉淀、鎳柱洗脫等復(fù)雜純化過程。ZHANG 等［19］通過自轉(zhuǎn)運蛋白ADIA-I，在大腸桿菌表面展示PLD，雖然避免了PLD 的純化，但誘導(dǎo)48 h后，酶活僅為0.074 U·mL-1。目前，已有的PLD 表達方式存在細胞發(fā)酵周期長、分離純化步驟煩瑣、培養(yǎng)成本較高等問題。
本研究旨在通過系統(tǒng)性地對比研究大腸桿菌胞內(nèi)表達、分泌表達和表面展示3 種方式對PLD 酶活及其PS 催化合成效率的影響，探索全細胞催化制備PS 的可行性及最適方式，以期大幅縮短PLD 高效活性表達所需的發(fā)酵時長，優(yōu)化操作煩瑣、耗時、成本高昂的PLD 分離純化工序。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 株
大腸桿菌表達宿主Escherichia coli BL21（DE3）和克隆宿主Escherichia coli DH5α 菌株均為實驗室保藏。
1.1.2 主要酶與試劑
膽堿氧化酶購于上海源葉生物科技有限公司，辣根過氧化物酶購于上海生工公司，磷脂酰膽堿（98%）、磷脂酰絲氨酸（99%）購于Sigma-Aldrich 公司，L-絲氨酸（99%）購于上海麥克林生化科技公司。
1.2 方 法
1.2.1 重組菌株的構(gòu)建
構(gòu)建胞內(nèi)表達、分泌表達和表面展示3 種方式的PLD 表達重組菌株，見表1。
表1 表達PLD 的菌株Table 1 The strains for expression of PLD
胞內(nèi)表達菌株BL-PLD。基于大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化Streptomyces halstedii 來源的pld 基因（AB062136.1），由擎科生物公司合成，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株而得。
采用限制性內(nèi)切酶Hind III 和BamH I 對合成的pET28a（+）-PLD 載體和pET22b（+）空載體進行雙酶切，連接后得到重組質(zhì)粒pET22b（+）-PLDp。以pET22b（+）-PLDp 為模板，將pelB 信號肽分別替換為FhuD、OmpA、DsbA 信號肽，得到分泌表達載體pET22b（+）-PLDo、pET22b（+）-PLDd、pET22b（+）-PLDf，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株，得到分泌表達菌株P(guān)LD-PelB、PLD-OmpA、PLDDsbA、PLD-FhuD。所用信號肽及其序列如表2所示。
表2 分泌表達載體及其信號肽Table 2 Secreted expression vectors and their signal peptides
表面展示菌株P(guān)LD-EhaA。N 端CtxB 信號肽序列、EhaA 自轉(zhuǎn)運蛋白連接子區(qū)域、β 折疊區(qū)域由擎科生物公司合成，插入pET28a（+）-PLD 載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）進行蛋白表達。
1.2.2 水解酶活檢測
由于PLD 的轉(zhuǎn)?；富顧z測方法煩瑣、耗時，而PLD 的水解酶活與轉(zhuǎn)酰基酶活存在正相關(guān)性［20］，且水解酶活檢測方法簡便、快速，故在進行條件優(yōu)化時用水解酶活表征轉(zhuǎn)?；富?。采用酶連比色法［21］，通過檢測膽堿的物質(zhì)的量測定水解酶活。PLD 的一個水解酶活單位（U）定義為每分鐘催化底物PC 水解產(chǎn)生1 μmol 膽堿所需的酶量。
分別取胞內(nèi)表達菌株和分泌表達菌株的發(fā)酵液1 mL，離心后，用Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液重懸菌體，超聲破碎，得到PLD 粗酶液。稀釋一定倍數(shù)后，取100 μL 進行水解酶活檢測。取表面展示菌株發(fā)酵液1 mL，離心后用緩沖液重懸稀釋菌體，取100 μL 細胞懸液檢測酶活。
1.2.3 PLD 轉(zhuǎn)?；磻?yīng)合成PS
在水-乙酸乙酯兩相體系中，分別以全細胞和來源于胞內(nèi)表達菌株、分泌表達菌株的粗酶液為催化劑，催化PC 和L-絲氨酸合成PS［22］。兩相反應(yīng)體系混合液包括3 mL 含10 mg·mL-1PC 的乙酸乙酯溶液、1 mL 含90 mg·mL-1L-絲氨酸和15 mmol·L-1CaCl2的乙酸鈉緩沖液（100 mmol·L-1，pH 5.5）、0.5 mL 粗酶液或全細胞懸液。將混合液置于40 ℃、200 r·min-1搖床中振蕩12 h，加入4.5 mL Floch 溶液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），離心后取有機相，采用高效液相色譜（HPLC）法測定磷脂。
在純水相體系中，在LIU 等［13］方法的基礎(chǔ)上略做了修改。純水相反應(yīng)體系混合液包括1 mL 含10 mmol·L-1PC 的5% Triton X-100 溶液、1 mL 含40 mmol·L-1L-絲氨酸的100 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）、150 μL 含10 mmol·L-1CaCl2水溶液及1 mL 粗酶液或全細胞懸液。將混合液置于40 ℃、200 r·min-1搖床中振蕩12 h。采用HPLC 法測定磷脂。
1.2.4 高效液相色譜檢測
采用配備紫外檢測器的安捷倫1260 高效液相色譜儀，選用安捷倫ZORBAX Rx-SIL 硅膠色譜柱（5 μm，150 mm×4.6 mm），以乙腈、甲醇、85% 磷酸混合液（V∶V∶V=100∶10∶0.8）為流動相，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長205 nm。
1.2.5 掃描電鏡制樣及觀察
（1）固定：將細菌樣品懸浮于0.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定過夜。倒掉固定液，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗樣品3 次，每次15 min。再用1%鋨酸溶液固定樣品1～2 h，小心取出鋨酸廢液，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗樣品3 次，每次15 min。
（2）脫水：依次用體積分數(shù)為30%，50%，70%，80%，90%和95%的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15 min。最后用無水乙醇脫水處理20 min，并將細胞樣品保存于無水乙醇中。
（3）干燥：在Hitachi HCP-2 型臨界點干燥儀中干燥。
（4）觀察：鍍膜，將處理好的樣品置于Hitachi SU-8010 型掃描電鏡中觀察。
1.2.6 重組PLD 的表達及發(fā)酵條件優(yōu)化
LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1。將重組菌BL-PLD 接種至50 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r·min-1搖床過夜培養(yǎng)，得種子液。
MTB（Modified Terrific Broth）培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g·L-1，酵母提取物24 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，K2HPO472 mmol·L-1，KH2PO472 mmol·L-1。將1%種子液接種至150 mL MTB 培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至菌濃（發(fā)酵液在600 nm 處的吸光度）為0.4～0.6，添加IPTG 至濃度為0.1 mmol·L-1，于25 ℃、220 r·min-1繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
采用單因素法，分別探究誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時的OD600、IPTG 濃度、誘導(dǎo)時長等對PLD 表達量的影響。
2 結(jié)果與討論
2.1 重組菌株
2.1.1 胞內(nèi)表達菌株
經(jīng)過優(yōu)化，胞內(nèi)表達菌株的密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）從0.71 提升至0.96，DNA 序列中鳴嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的堿基對的占比（GC 含量）從71%降至52%。
2.1.2 分泌表達菌株
信號肽是用于指導(dǎo)目的蛋白跨膜轉(zhuǎn)移或定位的氨基酸序列。通過將適當?shù)男盘栃蛄腥诤现涟械鞍谆虻腘 端，如大腸桿菌宿主，令異源蛋白分泌至周質(zhì)空間，從而增強其溶解度并避免形成包涵體。不同信號肽分泌蛋白的途徑不同，參照文獻［23］，選擇PelB、OmpA、FhuD 和DsbA 4 種信號肽，研究不同信號肽對PLD 分泌表達的差異。
2.1.3 表面展示菌株
ZHANG 等［19］通過自轉(zhuǎn)運蛋白AIDA-I 將PLD成功展示在大腸桿菌細胞表面［19］，說明將大腸桿菌作為PLD 展示菌株是可行的，但誘導(dǎo)48 h 后酶活僅為0.074 U·mL-1，可能是因為自轉(zhuǎn)運蛋白AIDA-I的轉(zhuǎn)運效率較低。另外，TOZAKIDIS 等［24］借助自轉(zhuǎn)運蛋白EhaA 成功將酯酶展示在大腸桿菌細胞表面，且獲得較高的酶活，故選擇自轉(zhuǎn)運蛋白EhaA 在大腸桿菌表面進行展示。
EhaA 是來自大腸桿菌O157：H7 EDL933 基因組的一種自轉(zhuǎn)運蛋白，其與PLD 融合的自轉(zhuǎn)運系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1（a）所示，包括三部分：（1）N 端的CtxB信號肽［25］；（2）C 末端的自轉(zhuǎn)運蛋白EhaA，包含連接子和β-折疊區(qū)域［26］；（3）PLD 作為“乘客”蛋白，位于N 端與C 端之間。PLD 轉(zhuǎn)運過程如圖1（b）所示，CtxB 信號肽通過Sec 引導(dǎo)PLD 蛋白穿過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運［27］至周質(zhì)空間，同時信號肽被裂解。通過形成孔狀結(jié)構(gòu)，將β-折疊結(jié)構(gòu)域整合至細胞外膜，而連接子結(jié)構(gòu)域穿過β-折疊結(jié)構(gòu)域并充當連接結(jié)構(gòu)，以允許PLD 蛋白暴露在細胞外部。
圖1 EhaA 自轉(zhuǎn)運載體示意Fig.1 Schematic of EhaA autotransporter
2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化
圖2 展示了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時的OD600、誘導(dǎo)物濃度對大腸桿菌表達PLD 的影響。
圖2 PLD 發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of the fermentation conditions
首先，在16～32 ℃條件下誘導(dǎo)PLD 表達，發(fā)酵結(jié)束后檢測PLD 的水解酶活。圖2（a）表明，在20 ℃時，PLD 水解酶活最高。隨著溫度上升，酶活急劇下降，說明PLD 更傾向于較低溫度的誘導(dǎo)表達，溫度對PLD 的誘導(dǎo)表達較為關(guān)鍵。
其次，為探究誘導(dǎo)時的最佳細胞量，分別在OD600為0.4～1 時進行誘導(dǎo)。圖2（b）表明，當OD600=0.7時，PLD 水解酶活最高。若過早誘導(dǎo)PLD 表達，則不利于菌體生長，PLD 最終表達量較低，說明在誘導(dǎo)PLD 表達前需積累足夠多的細胞量。當OD600＞0.7 時，隨著OD600的增加，酶活反而降低，這可能是由于菌體生長已經(jīng)偏離了對數(shù)生長期，菌體活力下降，導(dǎo)致PLD 表達量下降。
最后，為探究PLD 表達的最佳IPTG 濃度，設(shè)置IPTG 濃度為0.05～1.50 mmol·L-1。圖2（c）表明，0.3 mmol·L-1的IPTG 可獲得最佳PLD 酶活。當IPTG 濃度超過0.4 mmol·L-1時，隨著濃度的升高，酶活反而降低，這可能是由于濃度過高導(dǎo)致PLD 形成沒有活性的包涵體，且過高濃度的IPTG 對細胞具有毒害作用，影響細胞生長，從而降低酶活。
2.3 誘導(dǎo)時長對酶活的影響
圖3 展示了不同PLD 表達菌株的誘導(dǎo)時長與PLD 水解酶活的關(guān)系。隨著誘導(dǎo)時長的增加，PLD 水解酶活不斷升高。當誘導(dǎo)達8 h 時，胞內(nèi)表達菌株BL-PLD 的水解酶活最高，為0.35 U·mL-1；分泌表達菌株中的PLD-PelB 水解酶活次之，為0.23 U·mL-1；表面展示菌株P(guān)LD-EhaA 的水解酶活較低，為0.11 U·mL-1。這可能是由于胞內(nèi)表達菌株和分泌表達菌株的細胞經(jīng)超聲破碎后，粗酶液中的PLD與底物PC 的接觸更加充分，故在檢測酶活的較短時間內(nèi)，其水解酶活較全細胞的PLD-EhaA 更高。
圖3 誘導(dǎo)時長對PLD 水解酶活的影響Fig.3 Effect of induction time on PLD hydrolysis activity
在分泌表達菌株中，PLD-PelB的水解酶活最高；其次是PLD-FhuD，其酶活為0.17 U·mL-1；PLDOmpA 和PLD-DsbA 的酶活均在0.10 U·mL-1左右。所以，選擇PelB信號肽做進一步研究。
總之，在PLD 的N 端連接信號肽后，其酶活反而比未連接信號肽的菌株更低。這與MISHIMA等［28］的研究結(jié)果類似，由于PLD 蛋白被信號肽轉(zhuǎn)移至周質(zhì)空間后不斷積累，可能對宿主細胞有害，也可能導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定甚至丟失，從而降低酶活。
收集誘導(dǎo)表達PLD 8 h 的大腸桿菌細胞，用掃描電鏡觀察3 種方式下大腸桿菌細胞的形態(tài)變化，如圖4 所示。無質(zhì)粒的對照菌株細胞結(jié)構(gòu)完整，呈短桿狀，兩端鈍圓形，如圖4（a）所示。在3 種表達方式下大腸桿菌細胞結(jié)構(gòu)均受到一定程度的破壞，如出現(xiàn)不同程度的變形、斷裂、塌陷等，有的細胞表面形成孔洞，有的細胞裂解出內(nèi)容物，如圖4（b）～（d）所示。其中，分泌表達菌株P(guān)LD-PelB 的細胞變形塌陷情況最為嚴重。與對照菌株相比，分泌表達菌株和胞內(nèi)表達菌株的細胞表面更光滑。此外，表達PLD 蛋白之后的細胞更長，這可能是由于PLD 會影響細胞的有絲分裂，促進細胞增殖［29］。
圖4 大腸桿菌的掃描電鏡結(jié)果Fig.4 Scanning electron microscope images of E.coli.
綜上，誘導(dǎo)PLD 表達的最佳條件為溫度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 濃度0.3 mmol·L-1，誘導(dǎo)時長8 h。
2.4 PLD 轉(zhuǎn)?；磻?yīng)合成PS
2.4.1 反應(yīng)介質(zhì)對酶促合成PS 產(chǎn)率的影響
菌株BL-PLD 誘導(dǎo)8 h 后，以1 mL 發(fā)酵液破碎后的粗酶液為催化劑，在40 ℃下反應(yīng)12 h 制備PS。比較了純水相和兩相體系的PS 產(chǎn)率，如圖5（a）所示。在純水相體系中，PS 產(chǎn)率僅為13.71%，是兩相體系中PS 產(chǎn)率的40%。這是因為在PLD 與底物PC 反應(yīng)過程中，存在生成磷脂酸的副反應(yīng)，而純水相體系會促進磷脂酸的生成［30］，導(dǎo)致PS 產(chǎn)率下降。故選擇用兩相體系制備PS。
圖5 PS 產(chǎn)率液相檢測結(jié)果Fig.5 HPLC analysis of PS yield
2.4.2 不同PLD 表達方式對PS 產(chǎn)率的影響
為進一步獲取PLD-EhaA、PLD-PelB 和BLPLD 3 種菌株的PS 產(chǎn)率，在誘導(dǎo)8 h 后離心收集菌體，按1 g 細胞加15 mL 緩沖液的比例，分別添加對應(yīng)體積的Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液，重懸菌體，取1 mL 細胞懸液催化PC；另取1 mL 超聲破碎粗酶液催化PC，結(jié)果如圖5（b）所示。可知，無論是使用粗酶液還是全細胞催化PC，PLD-EhaA 的PS 產(chǎn)率均較高，其中全細胞催化的PS 產(chǎn)率可達59.1%；PLDPelB 和BL-PLD 的PS 產(chǎn)率均在30%左右。
對于PLD-PelB 和BL-PLD 菌株，細胞經(jīng)超聲破碎后，PLD 粗酶液與底物PC 接觸更加充分，反應(yīng)效率更高，故粗酶液催化的PS 產(chǎn)率比全細胞催化高。在兩相體系反應(yīng)前期，可能粗酶液催化底物PC產(chǎn)生PS 的速率較快，但在反應(yīng)后期，有機溶劑影響了酶的結(jié)構(gòu)，進而影響PLD 酶活［31］。故反應(yīng)12 h后，粗酶液催化與全細胞催化PS 產(chǎn)率相差不大。
對于PLD-EhaA 菌株，大腸桿菌細胞通過EhaA 轉(zhuǎn)運蛋白，將PLD 轉(zhuǎn)移至細胞外膜。全細胞催化PC 能避免有機溶劑與酶液直接接觸，從而保持PLD 酶活。故PLD-EhaA 菌株全細胞催化PC的PS 產(chǎn)率較細胞破碎粗酶液催化的高。
在大腸桿菌細胞表面展示PLD 的優(yōu)勢在于，大腸桿菌產(chǎn)生的酶被連接并固定在細胞表面，避免了費時費力且昂貴的酶分離純化步驟［32］，且底物或產(chǎn)物均不需穿過細胞膜屏障［33］，大大降低了傳質(zhì)阻力。此外，PLD 表面展示方式還可用于PLD 固化，更適合規(guī)?；苽銹S?？傊?，PLD 表面展示是降低生物催化轉(zhuǎn)化過程成本的一種非常有效的方法。
3 結(jié)論
利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，研究了胞內(nèi)表達、分泌表達和表面展示3 種方式對PLD 酶活及其磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）催化合成效率的影響。結(jié)果表明，大腸桿菌表達PLD 的最佳誘導(dǎo)條件為溫度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 濃度0.3 mmol·L-1。在最適條件下，3 種方式的PLD 水解酶活均在誘導(dǎo)表達8 h 時達最高值，分別為0.35，0.23，0.11 U·mL-1。進一步比較了胞內(nèi)表達菌株、分泌表達菌株以及表面展示菌株的PS 產(chǎn)率，結(jié)果表明，在水-乙酸乙酯兩相體系中，PLD 表面展示菌株的PS 產(chǎn)率最高，為59.1%。采用自轉(zhuǎn)運蛋白EhaA 對PLD 進行表面展示，用全細胞催化底物，后期不需要對蛋白進行分離純化，大大降低了底物或產(chǎn)物穿過細胞膜屏障的傳質(zhì)阻力。研究對工業(yè)化利用大腸桿菌生產(chǎn)PS 具有一定的指導(dǎo)意義。
