液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合QuEChERS測定牛百葉中五氯酚酸鈉的含量

潘明迪

（朝陽市檢驗檢測認(rèn)證中心，遼寧朝陽 122000）

五氯酚酸及其鈉鹽因低成本成為新的殺蟲劑、除草劑真菌滅除劑。生長在高有機(jī)質(zhì)含量的酸性土壤的植物可將其富集進(jìn)入食物鏈，產(chǎn)生內(nèi)分泌毒素干擾生物遺傳、細(xì)胞生長發(fā)育等。我國原農(nóng)業(yè)部于2002 年發(fā)布的235 號和250 號公告，將五氯酚酸鈉列為違禁藥物，不得使用。目前食品樣本中五氯酚酸及其鈉鹽的檢測方法主要有液相色譜[1]、氣相色譜[2]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[3]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[4-5]等技術(shù)?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中多采取固相萃取前處理方法，對于五氯酚酸鈉有很好的富集作用，但耗時長，需要專用裝置，分析效率低，不利于大量分析作業(yè)。

分散固相萃取與固相萃取原理相近，樣品中的雜質(zhì)與加入的吸附劑相互作用從而達(dá)到凈化樣品目的，常見于植物源性食品中多種農(nóng)藥殘留的檢測。當(dāng)前動物源性食品中的五氯酚酸鈉的分散固相萃取方法研究相對較少，本文擬建立一種簡單、便捷的分散固相萃取方法結(jié)合超高液相色譜三重四極桿聯(lián)用質(zhì)譜應(yīng)用于動物源性食品中五氯酚酸鈉定量，使前處理時間縮短、提高效率、降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛百葉購自本地麻辣燙店，火鍋店及農(nóng)副產(chǎn)品超市。

甲醇中五氯酚酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 00 μg·mL-1），陜西秦境標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)科技中心；甲醇、乙腈與甲酸（色譜級），美國賽默飛世爾科技有限公司；乙酸銨（色譜級），天津科密歐；三乙胺（優(yōu)級純），國藥集團(tuán)；實(shí)驗用一級水（美國賽多利斯超純水機(jī)）；方法驗證遵循《實(shí)驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）。

1290-6420 高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配ESI 源，美國Agilent 公司）；JXFSTPRP-192型高速組織研磨均質(zhì)儀（拓赫機(jī)電科技有限公司）；NEORUGE-23R 型低溫冷凍高速離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技有限公司）；QuEChERS 試劑包（含萃取管、鹽包及凈化管，北京普立泰科儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 提取

取200 g 可食用部分的牛百葉，剪成小塊后用高速組織研磨均質(zhì)儀進(jìn)行均質(zhì)，放入塑料干凈的容器中。稱取勻質(zhì)后試樣2.00 g 置于QuEChERS 樣品前處理包中附帶的50 mL 提取管中，加入80%乙腈溶液20 mL，渦旋振蕩3 min 后加入前處理提取鹽包，再次渦旋3 min，在2 ℃條件下，以6 500 r·min-1離心10 min，取10 mL 上清液置QuEChERS 凈化管中，渦旋3 min，2 ℃條件下，以6 500 r·min-1離心10 min后準(zhǔn)確移取10 mL 上清液轉(zhuǎn)移至QuEChERS 樣品前處理包中附帶的15 mL 離心管中待凈化。

1.2.2 凈化

QuEChERS 樣品前處理包中附帶的15 mL 離心管（下稱凈化管）中含有分散凈化劑，無需再加入其他試劑。將15 mL 凈化管渦旋振蕩3 min，在2 ℃條件下，以6 500 r·min-1離心10 min 后將管中上清液全部轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，在45 ℃低速氮?dú)庀聺饪s至近干，用50%的甲醇定容至1 mL，過0.22 μm 有機(jī)系微孔濾膜，上機(jī)測定。

1.2.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

吸取1 00 μg·mL-1五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.5mL于50.0 mL 容量瓶中，甲醇定容，配成1 μg·mL-1五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液。然后用50%甲醇配成以下濃度的五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，即0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1和800 ng·mL-1。 取2022年國家食品安全監(jiān)督抽檢已檢測過合格的陰性樣品8份，每份2.00 g，按照步驟1.2.1 提取、1.2.2 凈化（不需氮吹濃縮），得到空白基質(zhì)溶液8 份。吸取五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液系列點(diǎn)各100 μL 于干凈的15 mL 離心管中，分別用空白基質(zhì)溶液定容至1.0 mL，得到濃度為0 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和80.0 ng·mL-1的五氯酚酸鈉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，另用50%甲醇替代空白基質(zhì)，配制與五氯酚酸鈉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液同濃度的8 個點(diǎn)，作為五氯酚酸鈉溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.4 色譜質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A 為甲醇、B 為5 mmol·L-1乙酸銨溶液；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫：0 ～1.50 min，50%→100%A；1.51 ～3.00 min，100%A；3.01 ～5.00 min，50%A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：ESI-，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；裂解電壓：135 V；碰撞氣能量：-35 V；定量離子對（m/z）：264.7 ＞264.7；定性離子對（m/z）：264.7 ＞264.7、264.7 ＞262.7、264.7 ＞266.7，264.7 ＞268.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取、凈化條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

實(shí)驗分別選取純乙腈、80%乙腈溶液以及50%乙腈對樣品進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)80%乙腈與純乙腈的提取效率相近，分別為84.39%，86.17%，50%乙腈的提取效率較低，為45.72%，且考慮到純乙腈價格較貴，故選擇80%乙腈作為提取溶劑。為了進(jìn)一步提升提取效率且考慮到提取溶劑酸堿性對提取效率的影響，實(shí)驗向乙腈中加入1%甲酸與5%三乙胺進(jìn)行樣品提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80%乙腈、含有1%甲酸的乙腈溶液和含有5%三乙胺的乙腈溶液的提取效果相近，考慮到甲酸、三乙胺具有刺激性氣味，最終選擇80%乙腈溶液作為提取液。

2.1.2 凈化方式的選擇

通過查閱夏寶林等[3]、何雄等[4]、王連珠等[6]和孫金影等[7]文獻(xiàn)與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)[8]發(fā)現(xiàn)目前樣品凈化方式主要有SPE（固相萃?。┖蚎uEChERS 樣品前處理包兩種方式。因此，實(shí)驗在凈化部分主要對比了這兩種樣品凈化方式的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPE 小柱在吸附五氯酚酸鈉后需要對其進(jìn)行淋洗和洗脫，通過對SPE 小柱淋洗液的檢測發(fā)現(xiàn)部分目標(biāo)化合物會隨淋洗液流失，同時發(fā)現(xiàn)SPE 小柱洗脫液的洗脫效率未達(dá)到完全洗脫，而且對于部分樣品存在SPE 小柱被堵塞無法過柱的情況。而QuEChERS 凈化管中裝入的N-丙基乙二胺（Primary Secondary Amine，PSA）可有效去除脂肪等雜質(zhì)；C18對脂質(zhì)也有強(qiáng)吸附作用，二者可共同作用去除樣品中的干擾成分；同時凈化管中的無水硫酸鈉可去除提取過程中帶入的水相而保留有機(jī)相，利于氮吹濃縮。

2.2 流動相的選擇

實(shí)驗考察了以甲醇與0.1%甲酸水、甲醇與5 mmol·L-1乙酸銨為流動相時五氯酚酸鈉的峰形與保留時間，發(fā)現(xiàn)甲醇與5 mmol·L-1乙酸銨作為流動相時可提高離子化效率，增強(qiáng)響應(yīng)，峰形窄而尖銳，保留時間合適。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比稱之為基質(zhì)因子。當(dāng)基質(zhì)因子在0.8 ～1.2 可認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)影響較小。50%甲醇配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=288.005 196x+378.1578 54，基質(zhì)匹配曲線線性方程為y=257.182 437x+384.528 326，兩條曲線線性系數(shù)均大于0.995。基質(zhì)因子在0.8 ～1.2，可忽略基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化好的儀器條件下將基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和80.0 ng·mL-1）進(jìn)行進(jìn)樣分析，以五氯酚酸鈉響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五氯酚酸鈉在0 ～80.0 ng·mL-1具有良好線性關(guān)系。通過逐漸降低加標(biāo)濃度，檢出限（LOD）以3 倍信噪比（S/N=3）計，定量限（LOQ）以10 倍信噪比（S/N=10）計。檢出濃度下限為0.3 μg·kg-1，定量濃度下限為0.5 μg·kg-1，優(yōu)于國標(biāo)[8]。

2.5 精密度和回收率

取陰性樣品進(jìn)行0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1和5.0 μg·kg-1這3 個水平加標(biāo)，進(jìn)行回收率與精密度測定，結(jié)果見表1。由表1 可知，五氯酚酸鈉的回收率在90.2%～98.3%，精密度在1.3%～2.2%。

表1 五氯酚酸鈉的回收率和精密度（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測

對25 份市售牛百葉進(jìn)行檢測，均未檢出五氯酚酸鈉。

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了提取液種類、凈化方式以及色譜柱，建立了一種用于測定牛百葉中五氯酚酸鈉的方法。該方法定量限為0.5 μg·kg-1，回收率達(dá)到90%以上，重復(fù)性較好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%?；|(zhì)效應(yīng)影響較小，經(jīng)方法學(xué)驗證該方法可以滿足牛百葉中五氯酚酸鈉的檢驗分析要求。