超臨界CO2 萃取桑枝黃酮工藝的研究

李文馨，殷 勇，孫惠桉，陳 菊，陸 敏，王雪雅

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，貴州貴陽(yáng) 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)對(duì)外經(jīng)濟(jì)合作中心，貴州貴陽(yáng) 550001）

桑枝（Ramulus mori）屬于?？粕僦参锷＃∕orus albaL.）的一年生干燥嫩枝，屬于原衛(wèi)生部于2002 年發(fā)布的《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕51 號(hào)）中《可用于保健食品的物品名單》，收錄在《中國(guó)藥典》中，具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、益肺氣等作用[1-2]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，桑枝富含多種生物活性成分，如黃酮、香豆素、多糖以及生物堿等，其中黃酮類(lèi)成分是主要成分之一[3-4]。

根據(jù)其基本結(jié)構(gòu)黃酮可分為黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)、二氫黃酮醇類(lèi)以及其他黃酮類(lèi)等，廣泛分布于植物的葉片、花和果實(shí)中，部分與糖結(jié)合成苷類(lèi)形式存在，少部分以游離形式存在[5]。近幾年，黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究相對(duì)較多，對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等具有藥理作用[6-7]。

超臨界萃取技術(shù)是以超臨界流體的性質(zhì)為基礎(chǔ)，在高壓下，使需要萃取的溶質(zhì)溶解于超臨界流體中，再進(jìn)行降壓，或者升溫，降低溶質(zhì)的密度，從而降低在超臨界流體中的溶解度，使其從流體溶液中析出，實(shí)現(xiàn)萃取指定溶質(zhì)的技術(shù)[8]。近年來(lái)被普遍應(yīng)用于醫(yī)藥、生物、食品和化學(xué)等領(lǐng)域，具有處理溫度低、提取率高、對(duì)人體無(wú)害和安全穩(wěn)定等特點(diǎn)[9-11]。與其他提取方法相比，存在明顯優(yōu)勢(shì)[12]。目前，關(guān)于桑枝中總黃酮的提取方法主要是浸提法和超聲波提取法[13-14]。

本文以桑枝為研究對(duì)象，采用超臨界CO2萃取技術(shù)，以桑枝總黃酮得率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)確定桑枝黃酮萃取的工藝參數(shù)，可為桑枝黃酮的綜合利用和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

桑枝：市售，采收地為安徽省亳州地區(qū)，將干燥后的桑枝粉碎過(guò)篩，取30 ～40 目為桑枝粉，冷藏備用；CO2：純度≥99.9%；NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、無(wú)水乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SFE-4 超臨界CO2萃取儀：美國(guó)應(yīng)用分離公司；Multiskan GO 酶標(biāo)儀：Thermo Fisher Scientific 公司；Centrifuge 5424 離心機(jī)：Eppendorf 公司；BSA224SCW 電子分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；DHG-9240A 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海煜南儀器有限公司；FW135 粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超臨界CO2萃取

準(zhǔn)確稱(chēng)取桑枝粉2 g 裝入萃取釜中，達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，加壓調(diào)至設(shè)定值，設(shè)定CO2流速為3 L·min-1，以無(wú)水乙醇作為夾帶劑，調(diào)整夾帶劑流速，循環(huán)萃取。待萃取完畢，收集萃取液，過(guò)濾定容，待測(cè)。分別考察不同的萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間和夾帶劑流速對(duì)于桑枝總黃酮得率的影響。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

分別考察萃取溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃）、萃取壓力（40 MPa、45 MPa、50 MPa、55 MPa和60 MPa）、 萃取時(shí)間（30 min、45 min、60 min、75 min 和90 min）、 夾帶劑流速（0.500 mL·min-1、0.625 mL·min-1、0.750 mL·min-1、0.875 mL·min-1和1.000 mL·min-1）對(duì)桑枝總黃酮得率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

為全面考察超臨界CO2萃取中各因素的影響，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上開(kāi)展正交試驗(yàn)，以萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間和夾帶劑的流速為考察因素，以桑枝總黃酮的得率為指標(biāo)，采用4 因素3 水平正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，確定超臨界CO2萃取桑枝黃酮的最佳工藝條件，試驗(yàn)的各因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 總黃酮得率的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加入無(wú)水乙醇定容到50 mL，搖勻，即為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL，置于10 mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.5 mL，混合均勻后靜置5 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL，混合均勻后靜置5 min，再加入4% NaOH 溶液4 mL，以50%乙醇溶液定容，搖勻后放置15 min，測(cè)定OD510nm，橫坐標(biāo)為蘆丁濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

（2）桑枝總黃酮含量的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣品液1 mL，按照上述步驟測(cè)定吸光度值，總黃酮含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算。

（3）桑枝總黃酮得率的計(jì)算。根據(jù)總黃酮含量計(jì)算桑枝中總黃酮得率，計(jì)算公式為

式中：c為提取液總黃酮含量，mg·mL-1；v為提取液定容后的體積，mL；m為桑枝粉的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程與系數(shù)如圖1 所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 萃取溫度對(duì)桑枝總黃酮得率的影響

由圖2 可知，隨著溫度的升高，桑枝總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，桑枝總黃酮得率最大。在超臨界CO2萃取過(guò)程中，溫度的影響主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面。①隨著溫度的升高，CO2流體密度降低，溶解能力下降，不利于萃??；②在一定壓力條件下，溫度的升高可提高溶質(zhì)在CO2中的熱運(yùn)動(dòng)，從而增大相應(yīng)的溶劑蒸汽壓，使得萃取物的揮發(fā)性擴(kuò)散系數(shù)增強(qiáng)，有利于萃取[16-17]。因此，確定最佳萃取溫度為40 ℃。

2.2.2 萃取壓力對(duì)桑枝總黃酮得率的影響

由圖3 可知，隨著壓力的升高，桑枝總黃酮得率總體呈上升趨勢(shì)，且在50 MPa 時(shí)得率最高，一般認(rèn)為增加壓力，在增加CO2的密度的同時(shí)還會(huì)減少傳質(zhì)距離，有利于傳質(zhì)效率的增加[18]。當(dāng)壓力升高到55 MPa 時(shí)，總黃酮得率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨著壓力的升高，流體對(duì)流性和擴(kuò)散性下降，傳質(zhì)速率降低[19]。壓力的增大也會(huì)促進(jìn)基質(zhì)的溶脹，從而加快有效成分向外擴(kuò)散的速率，促進(jìn)萃取過(guò)程中的傳質(zhì)[20]。同時(shí)，萃取壓力較高，組織會(huì)發(fā)生形變、疏松，細(xì)胞壁受到破壞，通透性提高，使總黃酮溶出性增強(qiáng)，這也可能是壓力達(dá)到60 MPa 時(shí)，總黃酮得率出現(xiàn)小幅度上升的原因[21]。因此，確定最佳萃取壓力為50 MPa。

圖3 萃取壓力對(duì)桑枝總黃酮得率的影響圖

2.2.3 萃取時(shí)間對(duì)桑枝總黃酮得率的影響

由圖4 可知，桑枝總黃酮得率隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。萃取時(shí)間從30 min 增加到45 min，總黃酮得率增加得比較快，萃取時(shí)間大于45 min，得率增加得比較緩慢，這是因?yàn)檩腿傞_(kāi)始，CO2流體與桑枝粉顆粒接觸不充分，總黃酮得率較低，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，CO2流體與桑枝粉顆粒的混合越來(lái)越充分，傳質(zhì)速率提高，桑枝粉中被萃取的總黃酮含量快速增加，從而總黃酮得率增加較快；當(dāng)萃取達(dá)到一定時(shí)間后，由于桑枝粉顆粒中剩余的未被萃取的總黃酮含量較少，總黃酮得率不會(huì)隨著萃取時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)而明顯增加。因此，確定最佳萃取時(shí)間為45 min。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)桑枝總黃酮得率的影響圖

2.2.4 夾帶劑流速對(duì)桑枝總黃酮得率的影響

由圖5 可知，當(dāng)夾帶劑無(wú)水乙醇流速在0.750 mL·min-1時(shí)，桑枝總黃酮得率最高。夾帶劑流速在一定范圍內(nèi)的增快，有利于總黃酮得率的增加，可推斷是在此濃度范圍內(nèi)，夾帶劑流速的變快有利于桑枝粉中黃酮類(lèi)化合物的溶出。但當(dāng)夾帶劑流速達(dá)到一定數(shù)值后，會(huì)縮短桑枝粉與夾帶劑的接觸時(shí)間，影響黃酮類(lèi)化合物在溶劑中的溶解，降低夾帶劑的使用效率，從而降低了總黃酮得率。CO2是非極性物質(zhì)，這導(dǎo)致其在某些分離過(guò)程中存在很大的局限性[22]：對(duì)于烴類(lèi)物質(zhì)和弱極性的脂溶性物質(zhì)溶解能力較好，但對(duì)于具有強(qiáng)極性的有機(jī)化合物則需增大萃取壓力或使用夾帶劑來(lái)實(shí)現(xiàn)分離，因而單純的超臨界CO2萃取只適合極性較低的親脂性物質(zhì)，黃酮類(lèi)物質(zhì)一般極性較大[23]。實(shí)驗(yàn)表明，在不加夾帶劑的條件下只能得到少量易揮發(fā)性的小分子物質(zhì)，黃酮類(lèi)化合物的得率極低，因此針對(duì)黃酮類(lèi)化合物的提取，夾帶劑的添加十分必要[24]。綜上，確定最佳夾帶劑流速為0.750 mL·min-1。

圖5 夾帶劑流速對(duì)桑枝總黃酮得率的影響圖

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，每個(gè)因素對(duì)桑枝總黃酮得率的影響程度都有所差別，且影響程度大小分別為夾帶劑流速（D）＞萃取壓力（C）＞萃取溫度（A）＞萃取時(shí)間（B），根據(jù)各因素影響水平選取各因素的最佳水平A2B2C1D2，即萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間45 min、萃取壓力45 MPa 以及夾帶劑流速0.750 mL·min-1。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析表

由表3 可知，萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取壓力和夾帶劑流速對(duì)桑枝總黃酮得率均有極顯著影響，由F值可得出各因素對(duì)桑枝總黃酮得率顯著性影響的順序?yàn)閵A帶劑流速、萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間，這與極差分析的結(jié)果一致。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

按優(yōu)選的工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行操作3 次，桑枝總黃酮得率平均值為2.4817 mg·g-1，RSD 值為3.491%，高于表2 中的其他組合，表明該工藝能較好地提取桑枝總黃酮，為最佳萃取條件。

3 結(jié)論

本文選擇超臨界CO2萃取桑枝總黃酮，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，超臨界CO2萃取桑枝黃酮的最佳工藝條件為萃取時(shí)間45 min、萃取溫度40 ℃、萃取壓力45 MPa 和夾帶劑流速0.750 mL·min-1，在此條件下，桑枝總黃酮得率為2.481 7 mg·g-1，其中夾帶劑流速對(duì)桑枝總黃酮得率的影響最為顯著，萃取壓力次之，萃取溫度和萃取時(shí)間的影響相對(duì)較小。