UPLC-MS/MS 法同時(shí)快速測(cè)定保健食品中7 種非法添加藥物

吳芳海，許琨琨，盧文斌，王曉峰，蔡振世

（泉州市食品藥品檢驗(yàn)所，福建泉州 362000）

近年來(lái)，隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)保健食品的需求也越來(lái)越強(qiáng)烈，其中補(bǔ)腎壯陽(yáng)、降糖、減肥等熱門功效的保健食品尤其受到消費(fèi)者的追捧，雖然目前與保健食品相關(guān)的法律法規(guī)越來(lái)越完善，保健食品行業(yè)日常監(jiān)管也日趨規(guī)范，但由于保健食品行業(yè)有著高熱度、高需求、高利潤(rùn)等特點(diǎn)，在高額利益的驅(qū)使和誘惑下，保健食品中非法添加藥物的現(xiàn)象屢禁不止，如西地那非、他達(dá)拉非、西布曲明這些常見藥物在日常監(jiān)管中時(shí)有檢出。為了逃避監(jiān)管，甚至?xí)砑右恍┎⒉怀Ｒ姷乃幬锍煞只蛘咄瑫r(shí)添加多種不同功效的藥物，隱蔽性越來(lái)越高，嚴(yán)重危害廣大消費(fèi)者的身心健康，因此本文在西地那非、他達(dá)拉非、西布曲明等常見的藥物之外，補(bǔ)充開發(fā)了阿伐那非、米羅那非、烏地那非和沙格列汀等新型藥物的檢測(cè)方法[1-5]，擴(kuò)大了保健食品中非法添加物質(zhì)的檢測(cè)范圍，增加保健食品中非法添加物質(zhì)的檢測(cè)項(xiàng)目，提高檢測(cè)效率，為監(jiān)管部門整治行業(yè)亂象提供更多的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與對(duì)照品

乙腈（色譜純，德國(guó)merck）；甲酸（色譜純，美國(guó)ROE）；水為超純水（由超純水器制備）；阿伐那非對(duì)照品（批號(hào)：S076065，F(xiàn)ist Standard）；米羅那非對(duì)照品（批號(hào)：ALT800166，F(xiàn)ist Standard）；烏地那非對(duì)照品（批號(hào)：FS1610680，F(xiàn)ist Standard）；西地那非對(duì)照品（批號(hào)：510068-202102，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；他達(dá)拉非對(duì)照品（批號(hào)：510170-202102，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；沙格列汀對(duì)照品（批號(hào)：FS1621842，F(xiàn)ist Standard）；西布曲明對(duì)照品（批號(hào)：100624-201802，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；固體陰性供試品，某牌蛋白粉；液體陰性供試品：某牌鐵鋅鈣硒氨基酸口服液。

1.1.2 儀器

Triple Quad 5500 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)SCIEX 公司；3-15 臺(tái)式離心機(jī)，曦瑪離心機(jī)揚(yáng)州有限公司；Dirent-Pure UP UV30 超純水一體機(jī)，上海樂(lè)楓生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A 相為水（含0.1%甲酸），B 相為乙腈（含0.1%甲酸），采用梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；氣簾氣：20.0 psi；碰撞氣：9 psi；離子化電壓：5 500.0 V；溫度：500.0 ℃。噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；7 種分析物的詳細(xì)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 各分析物的質(zhì)譜參數(shù)

1.2.3 混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及測(cè)定

分別精密稱取適量阿伐那非、米羅那非、烏地那非、西地那非、他達(dá)拉非、沙格列汀和西布曲明對(duì)照品于同一容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成濃度為5 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，分別精密移取混合對(duì)照品溶液0.02 mL、0.04 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL 和1.00 mL 置于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得濃度為10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、300 ng·mL-1和500 ng·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 供試品溶液的制備與測(cè)定

精密稱取一次服用量供試品（固體樣品研細(xì)），置于50 mL 離心管中，加乙腈20 mL，渦旋振蕩1 min，超聲處理15 min，冷卻至室溫，5 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，向沉淀中再加入20 mL 乙腈，重復(fù)提取1 次，合并兩次提取上清液于同一50 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得供試品溶液。

不少保健食品中非法添加的藥物含量較高，為避免過(guò)高濃度的分析物組分污染質(zhì)譜系統(tǒng)，檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)先稀釋較大倍數(shù)溶液進(jìn)樣，然后根據(jù)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果調(diào)整至合適的稀釋倍數(shù)再進(jìn)行測(cè)定[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗(yàn)

分別取濃度為100 ng·mL-1的混合對(duì)照品溶液和加標(biāo)供試品溶液（濃度為100 ng·mL-1），按1.2 的條件測(cè)定，記錄7 種分析物的定量離子提取離子流色譜圖見圖1、圖2。結(jié)果顯示加標(biāo)供試品溶液中7 種組分的保留時(shí)間與混合對(duì)照品溶液一致，各組分分離效果和專屬性良好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子流色譜圖

圖2 加標(biāo)供試品提取離子流色譜圖

2.2 方法的線性范圍和檢出限

取某牌蛋白粉陰性供試品一次服用量（10 g），精確加入5 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液0.10 mL，按上述1.2.4 方法步驟處理，即得每毫升含1 0 ng 混合對(duì)照品的樣品溶液，再分別稀釋成各濃度檢測(cè)，以信噪比為3 的溶液濃度計(jì)算各分析物的方法檢出限，試驗(yàn)結(jié)果表明7 種分析物在10 ～500 ng·mL-1線性關(guān)系良好，檢出限能達(dá)到0.002 5 mg·kg-1，本方法可滿足其檢測(cè)分析的需求。各分析物的線性和檢出限結(jié)果見表3。

2.3 加樣回收率試驗(yàn)

分別取固體樣品（某牌蛋白粉）和液體樣品（某牌鐵鋅鈣硒氨基酸口服液）各6 份（每份10 g），精確加入5 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液1 mL，按上述1.2.4方法步驟處理，制備成添加量為0.5 mg·kg-1的添加回收試樣溶液，測(cè)定結(jié)果計(jì)算平均回收率，結(jié)果見圖3。

圖3 各分析物回收率結(jié)果

由圖3 可知米羅那非、烏地那非、西地那非、他達(dá)拉非、沙格列汀和西布曲明按本方法測(cè)定固體和液體兩種基質(zhì)樣品中的平均回收率結(jié)果為93.3%～118.4%，準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較好，阿伐那非的回收率達(dá)到了135%以上，計(jì)算100 ng·mL-1濃度的阿伐那非在固體和液體兩種陰性基質(zhì)溶液中的峰面積與純?nèi)軇┲械姆迕娣e比分別為114%和122%，均大于100%，存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[6]，可考慮采用配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來(lái)降低樣品基質(zhì)對(duì)阿伐那非的影響。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

記錄2.2 中加標(biāo)回收試樣溶液所測(cè)得的色譜峰面積，計(jì)算RSD 結(jié)果，在固體樣品（某牌蛋白粉）和液體樣品（某牌鐵鋅鈣硒氨基酸口服液）中7 種分析物的RSD 分別為1.9%～8.8%和1.6%～6.1%，表明本方法在固體樣品和液體樣品的檢測(cè)中具有良好的重復(fù)性，具體結(jié)果見表4。

表4 各分析物的精密度

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)71 批保健食品（泉州市食品藥品檢驗(yàn)所提供）進(jìn)行測(cè)定，其中8 批保健食品檢測(cè)出西地那非，含量差異較大，最低為25 mg/粒，最高為101 mg/粒，檢出率為11.3%，1 批保健食品檢出他達(dá)拉非，添加量為42 mg/粒，檢出率為1.4%，1 批保健食品檢出西布曲明，添加量為39 mg/粒，檢出率為1.4%，其余樣品未檢測(cè)出上述7 種成分。

3 結(jié)論

本法采用乙腈為提取溶劑，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，建立了能夠同時(shí)快速測(cè)定保健食品中阿伐那非、米羅那非、烏地那非、西地那非、他達(dá)拉非、沙格列汀和西布曲明等7 種非法添加藥物的測(cè)定方法，對(duì)方法的線性范圍、試樣加標(biāo)回收率、精密度和檢出限等進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，并對(duì)多種實(shí)際的保健食品樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確檢出了含有西地那非、他達(dá)拉非、西布曲明等多種類不同功效的非法添加藥物成分，方法操作簡(jiǎn)便、分離效能高、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，顯著縮短了分析時(shí)間，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室同時(shí)對(duì)上述7 種不同功效的保健食品非法添加藥物的快速測(cè)定工作，也為市場(chǎng)監(jiān)管部門對(duì)保健食品非法添加藥物監(jiān)督管理的快速響應(yīng)提供有力的技術(shù)支持。