ATP 生物發(fā)光技術用于食品接觸表面清潔效果評價的驗證研究

趙 嵩

（馬鞍山市食品藥品安全檢查中心，安徽馬鞍山 243000）

腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）又稱三磷酸腺苷。ATP 是一切生命體能量的直接來源，普遍存在于動植物、細菌、真菌細胞和食物殘渣中，而無生命的碎屑物質中不存在ATP[1]。生物活性物質中的ATP含量是相對恒定的，借助“熒光素-熒光素酶”發(fā)光反應可對ATP 進行定量測試，從而反映出生物細胞量的殘留。ATP 與熒光素反應發(fā)出的熒光強度（Relative Light Unit，RLU）與活細胞數量基本呈正比例關系[2]。熒光值越高，表明ATP 的量越多，也就意味著表面的殘留物越多，清潔狀態(tài)越差。因此，ATP 檢測法就被用來快速檢驗物品表面是否潔凈。

RLU 值越高代表存在微生物污染風險的可能性越大，但ATP 不能替代微生物涂抹檢測，一般ATP的靈敏度可達到10-15mol ATP 標準物質（有的品牌甚至更高），以細菌為例基本也要達到103才能達到ATP 的檢測靈敏度[3]。研究表明，只有純微生物培養(yǎng)物而沒有任何食物殘渣的情況下，熒光強度（RLU）和菌落數（Colony-Forming Units，CFU）呈很好的正相關關系[4]。

ATP 生物發(fā)光技術由于具有操作簡單、快速、方便的特點，能夠簡單快速驗證清潔消毒效果而被廣泛應用于食品、制藥、醫(yī)療和養(yǎng)殖等行業(yè)。隨著ATP 生物發(fā)光技術的普及，市場也涌現(xiàn)了大量的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)品牌，如3M、海凈納、龜甲萬、天隆、美正、巔峰、綠洲等品牌，其價格和性能差異較大，也造成了用戶選擇的困惑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

兩個品牌ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)（包括ATP 熒光檢測儀和表面ATP 采樣拭子）；Pipet-lite 移液槍（美國RAININ 公司）；sx500 高壓滅菌鍋（日本TOMY 公司）；ATP 標準品（Merck，貨號：A1852-1VL）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 25922）、啤酒酵母菌（ATCC 10231）。

1.2 使用方法

從2 ～8 ℃環(huán)境中取出ATP 表面采樣拭子，放置10 ～20 min 使其恢復至室溫狀態(tài)。撕開包裝袋，取出采樣拭子。拔出含有潤濕棉簽的手柄，若涂抹表面，則按Z 字形涂抹待測表面10 cm×10 cm 的區(qū)域；若檢測ATP 液體標準品，則將20 μL 待測標準品滴加至棉簽上。后將棉簽插回拭子內并按下，使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5 ～10 s，充分混勻后，插入對應品牌的ATP 熒光檢測儀，點擊快速檢測即可。

1.3 標準品驗證方法

1.3.1 靈敏度

靈敏度是驗證一個系統(tǒng)/方法的重要性能指標。先進行陰性值檢測，來確定ATP 的本底值。兩種品牌分別取6 支拭子，無需取出棉簽，直接按下手柄使棉簽與反應液接觸，按照1.2 進行操作。靈敏度驗證方法為取ATP 標準品，稀釋多個濃度梯度，取1×10-13mol和1×10-15mol 兩個濃度，按照1.2 進行分別檢測，重復8 次。對比不同ATP 標準品濃度檢測值與陰性值，與陰性有顯著差異的最低檢測濃度為其靈敏度。

1.3.2 衰減率

ATP 反應激發(fā)后，其熒光信號會隨時間的延長逐步衰減，考慮到檢測人員在現(xiàn)場檢測的過程中易受外界因素的影響，衰減過快可能會影響檢測結果。衰減率的驗證方法為測定拭子在5 min 內的熒光檢測值衰減率，吸取20 μL 不同濃度梯度ATP 標準品稀釋液，測定兩個品牌的ATP 在反應開始后5 min 內的熒光衰減率，分別在反應1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min 時進行讀值。

1.3.3 重復性

精密度是保證獲得良好準確度的先決條件，一般情況下，測量精密度不好，就不可能有良好的準確度，而重復性是精密度的一個重要度量方式。取一份高濃度（1×10-13mol）ATP 標準品稀釋液，分別檢測兩個品牌ATP 在同一濃度下的重復性，檢測方法參考1.2。同一濃度ATP 標準品重復測試10 次，計算10 次結果的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD），重復性用RSD 表示。

1.4 實際檢測效果驗證方法

1.4.1 標準菌株檢測

選取較為常見的革蘭氏陽性細菌（大腸埃希氏菌，ATCC 25922）、革蘭氏陰性細菌（金黃色葡萄球菌，ATCC 6538）和真菌（酵母菌，ATCC 10231），分別檢測兩個品牌ATP 對不同菌體的檢測靈敏度。

取新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯度，從兩個品牌的ATP 表面采樣拭子中取出棉簽，用移液槍準確移取20 μL 菌液滴于棉簽頭上，等待30 s，然后將棉簽插回檢測管內并按下，使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5 ～10 s，插入對應的ATP 熒光檢測儀，等待30 s，開始檢測。將得到的熒光值與菌落數一一對應。把不同濃度菌液的檢測熒光值與ATP 拭子自身陰性值進行對比，有顯著差異的最低濃度即為菌液的檢測靈敏度。

1.4.2 實際表面檢測

對桌面進行清潔消毒后，將桌面劃分為相鄰的20 塊10 cm×10 cm 的面積，分別用2 個品牌的ATP進行檢測，操作方法參照1.2。

2 結果與分析

2.1 靈敏度驗證結果

由表1 可知，在標準品濃度為1×10-15mol 的 ATP水平上，兩個品牌ATP 仍能檢出RLU 值，且結果與陰性有顯著差異；10-15mol ATP 濃度下，品牌一檢測值約是品牌二的1.8 倍，陰性值約為1.5 倍，倍數關系基本一致，由于在10-15mol ATP 濃度的熒光值與陰性熒光值有較大差異，故二者的檢測靈敏度一致，均為10-16mol ATP。

表1 品牌一ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)靈敏度驗證結果

2.2 衰減率驗證結果

采用兩個品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)檢測不同濃度ATP 標準溶液，由表2 可知，品牌一在濃度1×10-13mol 反應第5 min 時熒光值是最高熒光值的95%；在濃度1×10-15mol 反應第5 min 時，熒光值是最高熒光值的97%。品牌二在濃度1×10-13mol 反應第5 min 時熒光值是最高熒光值的94%；在濃度1×10-15mol 反應第5 min 時，熒光值是最高熒光值的89%。從數據上看，兩個品牌的衰退率都滿足實驗要求（25%以內）[5]，但品牌一的衰減率表現(xiàn)更佳。

表2 ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)衰退率驗證結果

2.3 重復性驗證結果

在同濃度ATP 水平下，兩個品牌ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)10 次檢測結果的RSD 均為9%，偏差值小于15%，均能滿足實驗要求，詳見表3。

表3 ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)重復性驗證結果

2.4 標準菌株驗證結果

采用金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸桿菌（ATCC25922）、白色念珠菌（ATCC10231）3 種常見菌株，在不同菌株濃度下進行ATP 的驗證。結果顯示，兩個品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)的檢測值顯示出穩(wěn)定的倍數關系，具體驗證結果見表4、表5、表6，且隨著菌株濃度的降低，檢測值均呈現(xiàn)較好的梯度關系。菌株在高濃度下，檢測值或存在偏低情況，與低濃度不完全呈線性關系，但影響較小。

表4 金黃色葡萄球菌（ATCC6538）測試結果

表5 大腸桿菌（ATCC25922）測試結果

表6 白色念珠菌（ATCC10231）測試結果

2.5 實際表面檢測結果

選取同一桌面的相鄰區(qū)域，分別用兩個品牌的ATP 表面采樣拭子進行涂抹取樣和檢測，并計算其RSD。從表7 結果可以看出，兩個品牌的檢測值及其趨勢表現(xiàn)基本一致。

表7 兩個品牌實際表面檢測結果

3 結論

通過上述驗證，兩個品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)靈敏度一致，均為1×10-16mol，在衰減率、重復性測試上表現(xiàn)基本一致，兩個品牌在菌株檢測和實際表面樣品檢測中，檢測結果與線性趨勢基本一致，說明兩個品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系在菌株裂解效力和檢測靈敏度上有很好的一致性。在實際驗證中，用戶可根據以上驗證方案，選擇重復性和衰減率更佳的品牌，至于靈敏度，可根據用戶對潔凈度要求情況來選擇，此外還需要結合性能和價格綜合考慮，最終篩選出最合適的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測系統(tǒng)。