膜芯片法快速篩查即食果蔬中常見致病微生物方法的建立及應(yīng)用

鄒雨虹，楊丹妮，張曉金

（常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，江蘇常州 213000）

水果和蔬菜富含各類營養(yǎng)物質(zhì)，有益于預防慢性疾病以及提高免疫力[1]。即食果蔬是指以新鮮水果和蔬菜為主要原料，經(jīng)過加工處理后，通過冷藏或低溫運輸并進入冷柜銷售的即食或即用的果蔬制品[2-3]。即食果蔬在流入市場前一般沒有經(jīng)過高溫加工等滅菌步驟，人們可以直接鮮切、涼拌食用，容易出現(xiàn)交叉污染繼而引發(fā)食源性疾病[4]，危害到人們的健康。其中，大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病微生物均在黃瓜、萵筍、苦苣、番茄、菠菜、瓜類、蘋果和梨等即食果蔬中檢出[5-6]。

目前針對即食果蔬中致病菌檢測的方法主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及生化鑒定、酶聯(lián)免疫吸附、聚合酶鏈式反應(yīng)（主要為熒光定量PCR 法）、基因芯片法等[7]，常規(guī)的分離培養(yǎng)基及生化鑒定檢測方法仍是我國食品中常見致病菌檢測的主要方式[8]。但此方法耗時長且步驟煩瑣，一般需要5 ～7 d 得出結(jié)果?？紤]到果蔬保質(zhì)期極短的特殊性，檢測周期過長會嚴重影響果蔬產(chǎn)品的快速流通，很大程度上加重了即食果蔬生產(chǎn)企業(yè)在儲藏及質(zhì)量管理上的負擔。

近年來出現(xiàn)的PCR 技術(shù)逐漸被應(yīng)用在食品中致病微生物的檢測中，該技術(shù)縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度及檢測效率[9]，但無法利用一次實驗操作同時對多種致病菌進行檢測，對于目前生鮮果蔬流通不暢的問題仍無法提供解決思路。因此，利用膜芯片檢測工作平臺開發(fā)一種針對多種致病菌同步快速檢測的方法，對于即食果蔬行業(yè)的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。

膜芯片技術(shù)基于反向斑點雜交原理開發(fā)，利用反向斑點雜交技術(shù)（Reverse Dot Blot，RDB）將待測基因中的特異性序列作為探針固定在尼龍膜上，并采用生物素標記的引物進行基因的擴增，同時將擴增產(chǎn)物與固定在尼龍膜上的探針進行雜交，經(jīng)化學顯色后可在雜交點上形成肉眼可見的信號，單次反應(yīng)即可同時篩查多種靶標[10]。該方法的特別之處在于將多重PCR 技術(shù)與反向斑點雜交（RDB）技術(shù)相結(jié)合形成檢測體系，可以同時提取細菌和病毒中的DNA和RNA，同步擴增特異性基因片段，在膜芯片上形成肉眼可見的檢測靶點，從而實現(xiàn)所有靶標的共同檢測。本文主要針對的即食果蔬中金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157、沙門氏菌、諾如病毒和輪狀病毒這6 種常見致病菌進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品來源

本實驗所用的樣本（即食生菜、即食黃瓜、鮮切牛油果、鮮切火龍果、蘋果、胡蘿卜、金橘、苦苣、鮮切菠蘿和鮮切羊角蜜）購自各市場中。

1.1.2 標準菌株

細菌采用實驗保存的陽性菌株：沙門氏菌（CICC號21513）、 大腸埃希氏菌O157:H7（CICC 號21530）、金黃色葡萄球菌（CICC 號10384）、單核細胞增生李斯特氏菌（CICC 號21633），在實驗室進行菌株復蘇備用。病毒樣本采用購買標準質(zhì)控品的形式進行。

1.1.3 儀器與試劑

MFS-24 基因膜芯片檢測工作站（四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司）；Fresco17 高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；膜芯片檢測試劑盒（貨號：HT114B，四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司）；細菌DNA 提取試劑盒（貨號：DP302，天根生化科技有限公司）；病毒DNA/RNA 提取試劑盒（貨號：DP315，天根生化科技有限公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 引物及探針設(shè)計

通過查看文獻并結(jié)合實際結(jié)果，最終選取以下基因序列。引物和探針的設(shè)計由Primer Premier 5.0軟件完成，具體對應(yīng)的特異性基因詳細信息見表1。

表1 PCR 引物、探針信息

1.2.2 樣本前處理

樣本的前處理階段選用致病菌共增菌培養(yǎng)基，將待測樣品與6 種陽性標準菌株進行前增菌。取共增菌培養(yǎng)基干粉5.96 g，加入蒸餾水至完全溶解，調(diào)節(jié)pH 值至7.2±0.2 并定容到100 mL，將滅菌鍋條件設(shè)置為121 ℃、20 min，滅菌后冷卻備用。無菌稱取10 g 待檢樣品，加入至100 mL 的增菌培養(yǎng)基中，設(shè)置恒溫振蕩培養(yǎng)箱參數(shù)為35 ℃和150 r·min-1，過夜培養(yǎng)。最后從共增菌液中取1 ～5 mL，提取DNA后進行PCR 反應(yīng)。

1.2.3 樣品核酸制備

采用多重PCR 技術(shù)擴增待檢靶標，以高純度的基因組DNA 為模板，核酸樣品純度A260/A280在1.8 ～2.0 可保證多重PCR 反應(yīng)的擴增效率；DNA樣品模板加入量≥200 ng 以保證檢測效果。使用細菌DNA 提取試劑盒或病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒分別進行提取。

1.2.4 多重PCR 擴增

（1）樣本核酸擴增PCR 反應(yīng)體系為2×Multiplex PCR Master Mix 10 μL，OneStep EnzymeMix 0.45 μL，Hela cell total RNA 1 μL，樣品DNA 20 ～400 ng，最后用無核酸酶滅菌水補足20 μL。

（2）PCR 擴增程序、溫度及反應(yīng)時間如表2 所示。

表2 PCR 擴增程序表

1.2.5 膜芯片雜交

產(chǎn)物變性階段：將上述實驗產(chǎn)物在95 ℃變性5 min 使其解鏈后立即置于冰上備用；雜交儀設(shè)置：雜交儀在開機前檢查瓶中的蒸餾水水位達到水位線，打開基因膜芯片檢測工作站的電源和開關(guān)，觀察廢液瓶是否空置，隨后打開軟件，等待工作站顯示自檢成功后，點擊確定按鈕；使用耗材和試劑的準備工作：使用前分別檢查試劑瓶BCDE 中的液體，如果存在結(jié)晶，則置于36 ℃水浴鍋中溶解至結(jié)晶消失后使用；將雜交試劑進行分裝，準備相應(yīng)數(shù)量的雜交管并將200 μL B 液加入至每個雜交管中；芯片和樣品的加載：將準備好的C ～J 試劑瓶開蓋，取已加入樣品的雜交管及膜芯片放入工作站指定位置并確保一一對應(yīng)，隨后關(guān)閉試劑盤和反應(yīng)盤的蓋板及儀器倉門，并再次檢查芯片與雜交管是否放置正確；運行程序：加載“基因膜芯片檢測工作站標準雜交流程”，根據(jù)檢測樣品放置的位置選中相應(yīng)的按鈕，點擊“運行”開始實驗。

1.2.6 結(jié)果判讀

實驗結(jié)果有效的前提是膜芯片上PC 點顯色，NC 點不顯色。反應(yīng)結(jié)果可用肉眼進行判讀，也可參照膜芯片核酸分子雜交儀成像分析系統(tǒng)得出的結(jié)果。膜芯片點陣圖及多重PCR 陽性質(zhì)控反應(yīng)結(jié)果如圖1和圖2 所示。

圖1 即食果蔬中常見致病微生物膜芯片點陣圖

圖2 即食果蔬中常見致病微生物多重PCR 陽性質(zhì)控反應(yīng)結(jié)果圖

2 市售樣本檢測結(jié)果與分析

對市場中購買的10 個即食果蔬樣本，提取其核酸，采用建立的膜芯片法進行檢測鑒定，結(jié)果芯片圖如圖3 所示，灰色點表示該點位陽性，無圓點則表示該點位陰性，同時還應(yīng)結(jié)合膜芯片點陣圖的基因序列進行肉眼判讀。

圖3 市售樣本檢測結(jié)果芯片圖

在3 份樣本（即食生菜、即食黃瓜、金橘）中檢出了金黃色葡萄球菌，而單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157、沙門氏菌及諾如病毒、輪狀病毒未檢出；另外7 份樣本均未檢出此6 種致病微生物。結(jié)果表明，市場中售賣的即食果蔬存在被致病微生物感染的風險，通過建立的膜芯片法能夠達到多種致病菌的同步檢測。

3 討論

本項目將多重PCR 技術(shù)與反向斑點雜交（RDB）技術(shù)相結(jié)合形成檢測體系，同時提取6 種致病微生物提取的DNA 和RNA，并同步擴增特異性基因片段，在膜芯片上顯示直觀的檢測靶點，從而實現(xiàn)對多種致病菌的同步檢測。本文建立的多重反應(yīng)體系中，利用特異性引物，可以在一次PCR 反應(yīng)體系中同時鑒別出金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細胞增生李斯特氏菌，以及諾如病毒、輪狀病毒這6 種致病菌，并且在48 h 內(nèi)能得出準確結(jié)果。此方法快捷便利，檢測條件限制不多，能滿足PCR 實驗環(huán)境的實驗室均可進行檢測，并可實現(xiàn)一次操作同步檢測多種致病微生物，大大提高了檢測效率。

膜芯片法作為一種具備優(yōu)勢的檢測新方法，應(yīng)用于食品的致病菌快速篩查中，可以提供更為快速且準確的實驗結(jié)果，且無需耗費大量人力資源。此方法有效解決了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)基法耗時過長的問題，有利于保障即食果蔬產(chǎn)品的順暢流通；有利于其他食品企業(yè)有效控制微生物污染風險，防止食源性疾病造成食品安全問題；有利于食品安全監(jiān)管抽檢工作高效地進行，為食品安全監(jiān)管工作提供了強有力的技術(shù)支撐。隨著基因膜芯片研究的不斷深入，相信膜芯片技術(shù)也會不斷發(fā)展，在食品致病性微生物的檢測中能得到更加廣泛的應(yīng)用。