基于分子動力學(xué)模擬與分子對接技術(shù)從分子層面預(yù)測活骨方對激素性股骨頭壞死的干預(yù)作用Δ

高 爽,赫 龍,申意偉,徐西林,張 鑫,張 寧,張曉峰,李小冬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,哈爾濱 150000;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨三科,哈爾濱 150001;3.黑龍江省中醫(yī)藥管理局,哈爾濱 150000)

股骨頭壞死是由于多種原因?qū)е鹿晒穷^血液供應(yīng)中斷,從而引發(fā)股骨頭內(nèi)成骨細(xì)胞壞死及骨小梁斷裂的一類疾病,若不加干預(yù),該病會導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)被破壞,最終引起股骨頭塌陷的發(fā)生[1]。在引起股骨頭壞死的諸多因素中,糖皮質(zhì)激素濫用是最常見的病因,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)患者占全部股骨頭壞死患者的40%,因此,對SONFH的研究有重要的現(xiàn)實(shí)意義[2-3]?；罟亲⑸湟菏轻t(yī)院制劑,為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院自1992年以來篩選具有舒筋活血、接骨續(xù)筋的中藥,配制成的純中藥制劑[4],后經(jīng)張曉峰教授根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)將此方進(jìn)行加減而成[5]。本研究為對活骨注射液的中藥成分進(jìn)行分析,將活骨注射液簡稱為活骨方?；罟欠街?骨碎補(bǔ)具備補(bǔ)腎強(qiáng)骨、療傷止痛之功,丹參具備活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛之能,川芎具備祛瘀活血、行氣開郁之效,三者相伍,既有補(bǔ)腎壯骨之力,又有化瘀行氣之功,達(dá)到治療股骨頭壞死的目的[6]。然而,由于中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的效應(yīng)特征,目前還未發(fā)現(xiàn)活骨方治療SONFH的確切分子機(jī)制。本研究依托分子對接技術(shù)、分子動力學(xué)模擬,對活骨方用于SONFH治療的分子機(jī)制展開初步分析,為該方劑的臨床廣泛應(yīng)用提供更可靠的支撐,進(jìn)而有效指導(dǎo)SONFH的臨床治療。

1 資料與方法

1.1 活骨方活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫,明確活骨方所含中藥的化合物組成。結(jié)合文獻(xiàn)檢索收集,并根據(jù)毒藥物動力學(xué)參數(shù)對所得成分進(jìn)一步篩選,以化合物適合藥物開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)[口服生物利用度(OB)≥30%,且類藥性(DL)≥0.18],在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中以截止值(Score cutoff)>40、P<0.01為條件篩選得到各味中藥的化學(xué)成分及靶點(diǎn)。

1.2 SONFH的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

在人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM,https：//omim.org)和GeneCards數(shù)據(jù)庫[7](http：//Gene-cards.org)中,以“steroid-induced necrosis of femoral head”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,找出SONFH疾病靶點(diǎn)。

1.3 活骨方治療SONFH的靶點(diǎn)篩選

對于活骨方中關(guān)鍵活性化合物作用靶點(diǎn)與SONFH潛在靶點(diǎn),得出交集靶點(diǎn),并在Uniprot數(shù)據(jù)庫中將交集靶點(diǎn)進(jìn)行名稱統(tǒng)一。

1.4 構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

通過在線軟件STRING(https：//string-db.org/),選擇“Homo sapiens”,以PPI綜合評分≥0.9為過濾條件實(shí)施篩選,同時去除游離未連接的節(jié)點(diǎn),完成最終PPI網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。

1.5 藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.8.0 Version軟件完成活骨方藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。通過插件Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣?包括度值、介數(shù)中心性,并進(jìn)行“關(guān)鍵活性成分”和“關(guān)鍵靶點(diǎn)”的篩選。

1.6 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫(http：//www.bioconductor.org/about/),使藥物疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)有效轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)名稱,利用R軟件查找每個關(guān)鍵靶點(diǎn)的功能,進(jìn)行GO和KEGG富集分析,以P<0.05,q<0.05開展過濾,借助氣泡圖實(shí)現(xiàn)可視化顯示。

1.7 核心化合物-核心靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證

在PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)內(nèi)進(jìn)行活性成分結(jié)構(gòu)式的下載,借助軟件AutoDockTools 1.5.6完成藥物有效成分與基因文件pdb.格式向pdbqt.格式的轉(zhuǎn)化,明確活性口袋,運(yùn)行Vina腳本進(jìn)行分子結(jié)合能計算以及分子對接結(jié)果展示,同時運(yùn)行Discovery Studio 2019尋找對接位點(diǎn)并計算柔性結(jié)合的LibDockScore,將分子對接結(jié)果錄入至PyMOL軟件,由此呈現(xiàn)分子對接構(gòu)象。

1.8 分子動力學(xué)模擬

將分子對接結(jié)果作為初始結(jié)構(gòu),采用Discovery Studio 2019軟件的Simulation和Standard Dynamics Cascade模塊得到立場參數(shù),模擬過程中配體的分子參數(shù)采用Charmm36力場進(jìn)行溶劑化。然后運(yùn)行分子動力學(xué)模擬。查看構(gòu)象變化動畫,顯示動力學(xué)模擬過程中的變化。分子動力學(xué)計算完成后,通過Analyze Trajectory模塊分析分子動力學(xué)軌跡的結(jié)構(gòu)特性。

2 結(jié)果

2.1 活骨方中活性成分的篩選

通過TCMSP及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲取活骨方中有效化合物成分共207個,其中19個來自骨碎補(bǔ),91個來自丹參,97個來自川芎,刪去重復(fù)值及無靶點(diǎn)的化合物,篩選獲得活骨方有效化合物成分和靶點(diǎn)分別為200和1 342個。

2.2 SONFH的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

在OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索疾病SONFH相關(guān)的靶點(diǎn),分別獲得1 152、254個結(jié)果(靶基因有重復(fù)現(xiàn)象)。

2.3 活骨方治療SONFH的靶點(diǎn)篩選

對于SONFH靶點(diǎn)與活骨方有效成分靶點(diǎn),借助R語言實(shí)施篩選去重處理,之后取雙方交集,雙方交集靶點(diǎn)合計119個,見表1。其中,與丹參、川芎和骨碎補(bǔ)有效成分相關(guān)的靶基因依次為98、88和53個。

表1 SONFH和活骨方有效成分的交集靶點(diǎn)Tab 1 Intersection targets of SONFH and active ingredient of Huogu formula

2.4 活骨方成分-SONFH靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將119個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING和Cytoscape軟件繪制在線數(shù)據(jù)平臺,選擇種屬為“Homo sapiens”,并設(shè)定置信度為0.90,制作PPI圖,見圖1。圖1中,節(jié)點(diǎn)、邊分別代表蛋白、蛋白與蛋白間的相互作用關(guān)系。采用R語言制作柱形圖,并分析得到前30個PPI核心基因,如癌組織基因(HSP90AA1)、酪氨酸激酶(SRC)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1、雌激素受體1(ESR1)、白細(xì)胞介素(IL)6、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)和腫瘤壞死因子(TNF)等,見圖2。

度值越高則圓圈面積越大;度值越低則圓圈面積越小the higher the degree value,the larger the circle area;the lower the degree value,the smaller the circle area圖1 活骨方-SONFH靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 1 PPI network of Huogu formula-SONFH targets

圖2 PPI核心蛋白關(guān)聯(lián)度排序Fig 2 Correlation ranking of PPI network core proteins

2.5 藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病分析

將活骨方成分與SONFH的119個交集靶點(diǎn),通過perl語言與Cytoscape軟件,完成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖的制作,見圖3。活骨方中,川芎活性成分度值最高(平均值為97)?；钚猿煞种?度值較高的有二氫卡拉酮、米替隆、新隱丹參酮Ⅱ、棕櫚酸和新隱丹參酮C等。關(guān)鍵靶點(diǎn)主要包括前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)、ESR1、雄激素及雄激素受體(AR)、瞬時受體電位香草酸3(TRPV3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶1(PTGS1)、胃蛋白酶原(PGR)、核受體共激活因子1(NCOA1)、乙酰膽堿M1型受體1(CHRM1)、視黃酸X受體(RXRA)和腎上腺素受體2(ADRB2)等。

圖3 藥物-有效成分-核心靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network of drug-active ingredients-core targets-disease

2.6 活骨方治療SONFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)GO生物學(xué)過程富集分析

為分析119個關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子功能、生物學(xué)過程,對于交集靶點(diǎn)開展GO分析,結(jié)果顯示,活骨方用于SONFH治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)富集于4 834個GO條目上,該方劑對治療SONFH的生物學(xué)過程與上皮細(xì)胞增殖、類固醇激素反應(yīng)、肽-酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、激酶活性正調(diào)控、MAPK級聯(lián)正調(diào)控、上皮細(xì)胞增殖調(diào)控和蛋白激酶活性正調(diào)控等相關(guān);以基因比進(jìn)行排序,排序越靠前則相關(guān)性越強(qiáng),圖中相應(yīng)的氣泡則越大;分子功能與受體配體活動、氧化還原酶活性、信號受體激活物的活性、生長因子活性、細(xì)胞因子活性和細(xì)胞因子受體結(jié)合等相關(guān),見圖4。

圖4 活骨方作用靶點(diǎn)GO功能富集分析(前30位)Fig 4 GO functional enrichment analysis of effect targets of Huogu formula (Top 30)

2.7 活骨方治療SONFH關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

活骨方治療SONFH關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG分析結(jié)果表明,關(guān)鍵靶點(diǎn)共富集在157條通路上,其中包括癌癥中乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和膀胱癌等癌癥相關(guān)通路,以及與IL-17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路和TNF信號通路等存在聯(lián)系,見圖5。

圖5 活骨方作用靶點(diǎn)KEGG功能富集分析(前20位)Fig 5 KEGG functional enrichment analysis of effect targets of Huogu formula (Top 20)

2.8 核心化合物-核心靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證

將活骨方關(guān)鍵活性成分二氫卡拉酮(dihydrokaranone)、新隱丹參酮C(neotanshinone C)和米替隆(miltionone Ⅰ)與關(guān)鍵靶點(diǎn)HSP90AA1(4BQG)、SRC(3DTT)和CTNNB1(6M90)分別做分子對接驗(yàn)證及3D圖展示,見表2、圖6。

表2 分子對接Vina、Discovery Studio 2019結(jié)果Tab 2 Results of molecular docking Vina and Discovery Studio 2019

2.9 活骨方關(guān)鍵活性成分及SONFH關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子動力學(xué)模擬驗(yàn)證

選擇結(jié)合能絕對值排序居前2位的化合物miltionone Ⅰ、neotanshinone C進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。本研究為系統(tǒng)分配了一個CHARMm力場。在200 ns的模擬采樣下,為了考察蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物在MD模擬過程中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,針對對接過程中形成的復(fù)合物計算了復(fù)合物在200 ns的MD模擬過程中的RMSD值,結(jié)果見圖7。為了分析復(fù)合物中各種氨基酸在MD模擬過程中的波動性,計算所有氨基酸在模擬過程中的RMSF值,結(jié)果見圖8。分子對接過程中的氫鍵熱圖(研究氫鍵相互作用在模擬過程中形成的持久性和變異性的有用工具)見圖9。由圖9可知,在所有構(gòu)象中都存在氫鍵的相互作用(尤其是紅色柱),表明了這些氫鍵非常持久穩(wěn)定。

A.ACE2-quercetin蛋白配體復(fù)合物分子對接模擬過程;B.3CL-baicalein蛋白配體復(fù)合物分子對接模擬過程A.simulation process of molecular docking of ACE2-quercetin protein ligand complex;B.simulation process of molecular docking of 3Cl-Baicalein protein ligand complex.圖7 MD模擬過程中體系的RMSDFig 7 RMSD of the system during MD simulation

A.SRC-米替隆蛋白配體復(fù)合物;B.HSP90AA1-新隱丹參酮C蛋白配體復(fù)合物A.SRC-miltiononeⅠ protein ligand complex;B.HSP90AA1-neotanshinone C protein ligand complex圖8 MD模擬過程中體系的RMSF值變化Fig 8 Variation of RMSF values of the system during MD simulation

3 討論

SONFH為骨科領(lǐng)域的常見病和疑難病,該病的發(fā)生存在年輕化趨勢,同時發(fā)生率持續(xù)升高。糖皮質(zhì)激素的大劑量或長期應(yīng)用必然引起陽亢,陽勝劫陰,陰液不足,從而氣血堵塞,瘀而致痹[8]。痰瘀互結(jié)對骨、經(jīng)脈不利,無法滋養(yǎng)筋骨,造成骨枯髓空,進(jìn)而引發(fā)SONFH[9]。

為深入探究活骨方治療SONFH的藥效基礎(chǔ)與潛在分子學(xué)機(jī)制,本研究依托網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,結(jié)果顯示,活骨方潛在活性成分有200個,其中最主要的成分有二氫卡拉酮、新隱丹參酮C、米替隆、棕櫚酸和新隱丹參酮Ⅱ等。二氫卡拉酮是一類黃酮類化合物,該物質(zhì)內(nèi)含2-苯基色原酮及1個酮式羰基,黃酮類化合物可使成骨細(xì)胞活性、分化提升,并對破骨細(xì)胞進(jìn)行抑制[10]?；衔锩滋媛　⑿码[丹參酮 Ⅱ與炎癥、脂肪酸氧化、TNF生成和細(xì)胞增殖等途徑的重要靶點(diǎn)有關(guān)[11]。新隱丹參酮Ⅱ、新隱丹參酮C是2類新隱丹參酮類化合物,通過中藥丹參提取得到,Wu等[12]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),新隱丹參酮可以抑制核因子κB(NF-κB)p65的磷酸化,同時抑制p-NF-κB p65的轉(zhuǎn)運(yùn),控制炎癥反應(yīng)。因此,活骨方可能通過抑制炎癥反應(yīng)、增加成骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞生成等方面發(fā)揮治療SONFH的作用。

通過“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖及PPI分析發(fā)現(xiàn),SONFH作用靶點(diǎn)主要涉及HSP90AA1、TNF、SRC、VEGFA、MAPK1、IL-6、FOS和ESR1等核心靶點(diǎn)。HSP90AA1是一類大范圍表達(dá)的分子伴侶,對惡性腫瘤細(xì)胞施以調(diào)節(jié),同時過表達(dá)信號蛋白,并提升過表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性。Xiao等[13]發(fā)現(xiàn),HSP90AA1是自噬的重要調(diào)節(jié)因子,化療藥可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞中HSP90AA1的表達(dá);HSP90AA1下調(diào),可以顯著提高M(jìn)G-63細(xì)胞中Akt和雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)的磷酸化水平,抑制PI3K-Akt-mTOR通路,對磷酸化Akt以及mTOR的表達(dá)進(jìn)行抑制,實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞凋亡的有效抑制。SFKs為SRC家族激酶,屬于非受體型酪氨酸(Tyr)激酶[14]。在被受體型Tyr激酶刺激后,SFKs發(fā)生活化,同時向自身下游各類途徑傳遞信號,該類信號通路涉及MAPK、JAK激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)和PI3K-Akt[15]。SRC是單肉豆蔻?；腟FK,穿梭于質(zhì)膜和溶酶體之間,在溶酶體融合中起到促進(jìn)作用,充分執(zhí)行自噬[16]。Li等[17]的研究結(jié)果表明,SRC通過肉毒桿菌毒素底物1的磷酸化,促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、血管化和骨修復(fù)。miR-22通過ESR1在p38 MAPK-JNK信號通路中直接靶向和間接失活來抑制成骨細(xì)胞活力[18]。這些蛋白可能是活骨方治療SONFH作用的關(guān)鍵蛋白。

通過對活骨方用于SONFH治療的靶點(diǎn)實(shí)施GO功能富集分析可知,上皮細(xì)胞增殖、類固醇激素反應(yīng)、肽-酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、激酶活性正調(diào)控、MAPK級聯(lián)正調(diào)控、上皮細(xì)胞增殖調(diào)控以及蛋白激酶活性正調(diào)控等有關(guān)。由KEGG通路富集分析可知,活骨方治療SONFH的潛在靶點(diǎn)與MAPK、PI3K-Akt和TNF信號通路最為緊密。糖皮質(zhì)激素作用于多種信號通路,使得成骨細(xì)胞以及骨細(xì)胞的凋亡加劇,促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生脂肪化,同時導(dǎo)致破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞間的動態(tài)平衡受損,誘發(fā)SONFH[19]。Ma等[20]的研究結(jié)果顯示,藥物經(jīng)PI3K-Akt信號通路對骨細(xì)胞分化、增殖、侵襲與凋亡施以影響。在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)下,PI3K-Akt信號通路參與了原代成骨細(xì)胞和成骨前細(xì)胞的增殖和凋亡過程而使股骨頭塌陷[21]。由此可見,活骨方可通過PI3K-Akt通路以及與骨細(xì)胞凋亡的IL-17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號通路和TNF信號通路發(fā)揮對SONFH的治療作用。分子對接及分子動力學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,核心蛋白HSP90AA1、SRC和CTNNB1分別與活性成分黃酮類化合物、新隱丹參酮C和米替隆相結(jié)合,形成穩(wěn)定對接,結(jié)合能均低于-20.92 kJ/mol。且分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示均能穩(wěn)定結(jié)合。

綜上所述,本研究通過分子對接和分子動力學(xué)模擬的方法論證了活骨方治療SONFH的可能性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示,活骨方可能是通過二氫卡拉酮、米替隆、新隱丹參酮Ⅱ、棕櫚酸和新隱丹參酮C等活性成分調(diào)控HSP90AA1、SRC和CTNNB1等核心基因,通過釋放抗炎因子、抑制細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)等作用治療SONFH。分子對接及分子動力學(xué)模擬驗(yàn)證了上述結(jié)果的可信性,SRC-MiltiononeⅠ和HSP90AA1-Neotanshinone C蛋白配體結(jié)合穩(wěn)定。本研究為活骨方治療SONFH的分子機(jī)制研究提供了新的線索,也為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。