葛根素通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善化療誘導(dǎo)的雌性生殖干細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和凋亡Δ

迪麗努爾·安外爾,熱孜宛古麗·約麥爾,陸 萍

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科,烏魯木齊 830001;2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院科研教育中心,烏魯木齊 830001)

葛根素(PUE)是葛根素異黃酮的主要活性成分,其化學(xué)結(jié)構(gòu)與植物雌激素相似,已被廣泛用于臨床多種疾病的治療。PUE具有多種藥理作用,如保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和雌激素活性等[1]。既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PUE可通過Wnt/β-catenin途徑改善多種器官或組織的分化、動(dòng)態(tài)平衡和衰老等生物學(xué)進(jìn)程[1-2]。而Wnt/β-Catenin途徑對(duì)女性生殖系統(tǒng)的生長(zhǎng)和發(fā)育同樣是必不可少的。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺乏Wnt4的小鼠卵巢發(fā)育較差,健康卵泡較少,且Wnt/β-catenin途徑在調(diào)節(jié)卵巢類固醇激素的產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要作用[3-4]。此外,PUE還能通過調(diào)控多種干細(xì)胞的自我更新、增殖、分化和凋亡等行為,在衰老相關(guān)疾病中發(fā)揮顯著的療效[5]。一項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在動(dòng)物體內(nèi),PUE可能通過Wnt/β-Catenin信號(hào)通路提高小鼠卵巢雌性生殖干細(xì)胞(FGSCs)的存活率,從而對(duì)卵巢早衰(POF)發(fā)揮保護(hù)作用[6]。但該研究未在細(xì)胞水平上進(jìn)一步探究PUE對(duì)FGSCs的具體作用及相關(guān)機(jī)制。為深入闡明PUE在POF中的作用和臨床應(yīng)用價(jià)值,本實(shí)驗(yàn)通過分離乳鼠FGSCs以補(bǔ)充PUE對(duì)POF發(fā)揮保護(hù)作用的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性ICR乳鼠16只,日齡為3～5 d,購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2018-0002]。

1.2 儀器

BK-EL10A型多功能酶標(biāo)分析儀(山東博科生物技術(shù)有限公司);1708280型ChemiDoc成像系統(tǒng)、IQ5型Real-Time PCR儀(美國Bio-Rad公司);FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司);CKX53型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 藥品與試劑

細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8,北京全式金生物技術(shù)股份有限公司);PUE(德國Merck KGaA公司);Tri-Reagent試劑、5′-溴脫氧尿苷(BrdU)增殖試劑盒(美國Life Technologies公司);PrimeScrip RT試劑盒(日本Takara公司);逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(美國Bio-Rad公司);細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC/PI,美國BD Pharmingen公司);白消安(BU,美國Sigama公司);2,7-二氯熒光素(DCFH-DA)試劑(江蘇碧云天生物科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)分析試劑盒(上海貝博生物科技有限公司);電化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國BioWord公司);兔抗小鼠Vasa同源體(Mvh)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(Oct4)、β-catenin和B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)單抗(美國CST公司);兔抗生殖細(xì)胞特異性蛋白4(Ddx4)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)、Fragilis、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗(美國Abcam公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G二抗(武漢亞科因生物技術(shù)有限公司)。丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶2(SOD2)活性檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

1.4 FGSCs的原代分離、純化和培養(yǎng)

取出生3～5 d的雌性ICR乳鼠16只,置于75%乙醇溶液中快速消毒、處死后,參考文獻(xiàn)[7]的方法,采用改良的兩步酶消化法分離FGSCs后,將其接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中,于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,待成纖維狀體細(xì)胞貼壁后,收集細(xì)胞,按操作說明書的方法,使用Fragilis抗體包被的MACS磁珠在預(yù)先安裝好的磁力架上進(jìn)行純化分離FGSCs。每2 d更換1次FGSCs完全培養(yǎng)基,每4 d傳代1次。

1.5 FGSCs的處理和分組

將上述分離純化后的FGSCs接種于96孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí),使用不同濃度的PUE(0、0.1、0.5、1、5、10、50和100 ng/mL)處理FGSCs 24 h后,每孔加入CCK-8試劑10 μL,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞吸光度值,以篩選合適的PUE作用濃度。按實(shí)驗(yàn)?zāi)康?將FGSCs分為四組：(1)正常培養(yǎng)的對(duì)照組(Control);(2)參考文獻(xiàn)[8]的方法,采用40 ng/mL的BU處理FGSCs 48 h以誘導(dǎo)化療所致生殖毒性損傷的BU組;(3)使用最佳作用濃度的PUE進(jìn)行處理治療的BU+PUE組;(4)使用100 ng/mL的Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻滯劑DKK-1進(jìn)行聯(lián)合處理的BU+PUE+DKK-1組。將FGSCs接種至96孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)按不同分組方法進(jìn)行處理細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,按上述CCK-8法檢測(cè)各組FGSCs的每孔吸光度值。

1.6 FGSCs的免疫熒光檢測(cè)

取生長(zhǎng)良好的FGSCs,于4%多聚甲醛溶液中固定過夜后,以0.5% Triton X-100溶液處理細(xì)胞15 min,10%的山羊血清在37 ℃下封閉抗體1 h,隨后加入稀釋后一抗：Ddx4(1∶300)、Oct4(1∶200)和Fragilis(1∶200),4 ℃下孵育過夜,PBST溶液充分洗滌后,加入FITC標(biāo)記的Ddx4(1∶250)、Alexa Fluor 647標(biāo)記的Oct4(1∶250)和Alexa Fluor 488標(biāo)記的Fragilis(1∶250),室溫(25 ℃)下避光孵育2 h,并使用Hoechst 33342試劑進(jìn)行染核,PBST溶液充分洗滌并封片后,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)Blimp-1、Fragilis、Ddx4、Dazl、Mvh和Figla mRNA表達(dá)水平

采用Tri-Reagen試劑盒提取樣品的總RNA,然后使用PrimeScrip RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。iTaq Universal SYBR Green SuperMix試劑盒進(jìn)行RT-PCR,并在StepOnePlus Real-Time PCR系統(tǒng)上以95 ℃(15 s)、60 ℃(1 min)的40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參,按2-ΔΔCt相對(duì)定量方法分析目的基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。RT-PCR的引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of RT-PCR

1.8 BrdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取生長(zhǎng)良好的FGSCs,加入終濃度為50 μg/mL的BrdU試劑,37 ℃下孵育1 h,棄除培養(yǎng)液,甲醇/醋酸溶液室溫下固定10 min,自然風(fēng)干后,加入0.3%過氧化氫-甲醇溶液以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,5%的山羊血清進(jìn)行抗體封閉1 h,甲酰胺溶液中煮沸5 min,預(yù)冷用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)充分洗滌細(xì)胞后加入兔抗BrdU(1∶50)和Mvh(1∶50)抗體,4 ℃下孵育過夜,次日分別加入PE與FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶200),室溫下孵育1 h,最后使用含Hoechst 33342試劑的抗熒光猝滅劑進(jìn)行染核,熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野中BrdU和Mvh雙陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行技術(shù)分析。

1.9 DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)細(xì)胞中活性氧(ROS)含量

收集各組FGSCs,加入500 μL按1∶1 000比例稀釋的DCFH-DA試劑,37 ℃下避光孵育20 min,PBS溶液充分洗滌細(xì)胞并重懸后,在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光度值。

1.10 細(xì)胞中MDA含量和GPx、SOD2活性的檢測(cè)

取各組FGSCs,按MDA含量檢測(cè)試劑盒、GPx和SOD2活性檢測(cè)試劑盒的操作說明書方法檢測(cè)各組細(xì)胞中MDA含量和GPx、SOD2的活性。

1.11 JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位變化

將1 mL的10 μg/mL JC-1試劑加入六孔板中培養(yǎng)的各組FGSCs中,細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20 min后,按照J(rèn)C-1染色試劑盒說明書方法進(jìn)行操作。當(dāng)線粒體膜電位處于正常較高電位時(shí),JC-1形成聚合物(即呈紅色熒光),而當(dāng)膜電位受損降低時(shí),JC-1為單體形式存在(即呈綠色熒光)。以紅色與綠色熒光度值的相對(duì)比值作為膜電位變化的指標(biāo)。

1.12 Annexin V/FITC-PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組FGSCs,4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL,并將其重懸于100 μL的結(jié)合緩沖液中,隨后加入各5 μL Annexin-V和PI試劑,充分混勻細(xì)胞后,室溫下避光孵育15 min,最后向每個(gè)樣品管中加入200 μL結(jié)合緩沖液,在流式細(xì)胞儀上分析各組細(xì)胞的凋亡率。

1.13 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Mvh、Oct4、β-catenin、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平

各組FGSCs中總蛋白用RIPA裂解緩沖液提取,BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠進(jìn)行電泳分離。然后用濕轉(zhuǎn)法將所選擇的目的凝膠條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下將膜在5%脫脂奶粉中封閉1 h,隨后在4 ℃下與一抗進(jìn)行孵育過夜：Mvh(1∶1 000)、Oct4(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和cleaved caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)。TBST溶液充分洗膜后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000),室溫下孵育2 h。最后,按照制造商的說明進(jìn)行ChemiDoc成像系統(tǒng)進(jìn)行成像,用電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶,并用Image Quant LAS 4000圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。以GAPDH為內(nèi)參,半定量分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 FGSCs的鑒定

采用免疫磁珠法分選FGSCs,傳代生長(zhǎng)后光鏡下可觀察到體外培養(yǎng)的FGSCs為核質(zhì)率較高的串珠樣細(xì)胞形態(tài),見圖1(A);免疫熒光檢測(cè)表明,生殖干細(xì)胞標(biāo)記物Ddx4、Oct4和Fragilis在FGSCs均有表達(dá),見圖1(B);RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,FGSCs表達(dá)雌性生殖干細(xì)胞基因Blimp-1、Fragilis、Ddx4、Dazl和Mvh,而卵母細(xì)胞特異性基因Figla在FGSCs中不表達(dá),見圖1(C);BrdU與Mvh雙染法檢測(cè)FGSCs增殖活性的結(jié)果顯示,FGSCs具有明顯的增殖活性,見圖1(D)。上述結(jié)果提示,本實(shí)驗(yàn)分離的FGSCs具有增殖活性且表達(dá)生殖干細(xì)胞標(biāo)記分子。

A.光鏡觀察FGSCs的形態(tài)學(xué)(Bar=50 μm);B.免疫熒光檢測(cè)Ddx4、Oct4和Fragilis在FGSCs中的表達(dá)(Bar=10 μm);C.RT-PCR檢測(cè)雌性生殖干細(xì)胞基因Blimp-1、Fragilis、Ddx4、Dazl和Mvh在FGSCs中的表達(dá)水平;D.BrdU與Mvh雙染法檢測(cè)FGSCs的增殖活性(Bar=20 μm)A.morphology of FGSCs observed by light microscopy (Bar=50 μm);B.immunofluorescence detection of Ddx4,Oct4 and Fragilis expression in FGSCs (Bar=10 μm);C.RT-PCR detection of female germline stem cell genes Blimp-1,Fragilis,Ddx4,Dazl and Mvh expression in FGSCs levels;D.BrdU and Mvh double-staining assay to detect the proliferative activity of FGSCs (Bar=20 μm) 圖1 FGSCs的鑒定Fig 1 Identification of FGSCs

2.2 PUE對(duì)FGSCs增殖活性的影響

采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10、50和100 ng/mL)PUE對(duì)FGSCs增殖活性的影響,結(jié)果顯示,與0 ng/mL相比,0.5、1、5和10 ng/mL的PUE能明顯促進(jìn)細(xì)胞的活性(P<0.05或P<0.01),其中以5 ng/mL的PUE對(duì)細(xì)胞活性的促進(jìn)能力最為顯著(P<0.01),而高濃度(100 ng/mL)PUE則能抑制細(xì)胞的活性(P<0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;因此,選擇5 ng/mL的PUE進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見圖2。

與0 ng/mL的PUE相比,*P<0.05,**P<0.01vs. 0 ng/mL PUE,*P<0.05,**P<0.01圖2 CCK-8法檢測(cè)PUE對(duì)FGSCs增殖活性的影響Fig 2 Effect of PUE on proliferative activity of FGSCs detected by CCK-8 method

2.3 各組FGSCs的增殖活性

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相比,BU組、BU+PUE組和BU+PUE+DKK-1組的FGSCs增殖活性均明顯降低(P<0.05);與BU組相比,BU+PUE組細(xì)胞的增殖活性明顯升高(P<0.05);與BU+PUE組相比,BU+PUE+DKK-1組的FGSCs增殖活性明顯降低(P<0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BU+PUE+DKK-1組與BU組上述指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖3。

與Control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與BU組相比,#P<0.05;與BU+PUE組相比,&P<0.05vs. the Control group, *P<0.05,**P<0.01;vs. BU group,#P<0.05;vs. BU+PUE group,&P<0.05圖3 CCK-8法檢測(cè)各組FGSCs的增殖活性Fig 3 Proliferative activity in each group of FGSCs detected by CCK-8 method

2.4 各組FGSCs的氧化應(yīng)激水平

DCFH-DA熒光探針法與試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相比,BU組、BU+PUE組和BU+PUE+DKK-1組的FGSCs中ROS和MDA含量均明顯升高(P<0.01或P<0.05),GPx與SOD2活性卻明顯降低(P<0.01);與BU組相比,BU+PUE組細(xì)胞中ROS和MDA含量均明顯降低(P<0.05),GPx與SOD2活性明顯升高(P<0.05);與BU+PUE組相比,BU+PUE+DKK-1組FGSCs中ROS和MDA含量均明顯升高(P<0.05),GPx與SOD2活性卻明顯降低(P<0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BU+PUE+DKK-1組與BU組上述指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖4—5。

與Control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與BU組相比,#P<0.05;與BU+PUE組相比,&P<0.05vs. the Control group, *P<0.05,**P<0.01;vs. BU group,#P<0.05;vs. BU+PUE group,&P<0.05圖4 DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)各組FGSCs中ROS含量Fig 4 ROS content in each group of FGSCs detected by DCFH-DA fluorescent probe method

與Control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與BU組相比,#P<0.05;與BU+PUE組相比,&P<0.05vs. the Control group, *P<0.05,**P<0.01;vs. BU group,#P<0.05;vs. BU+PUE group,&P<0.05圖5 各組FGSCs中GPx、SOD2活性和MDA含量檢測(cè)Fig 5 Detection of activities of GPx and SOD2 and content of MDA in each group of FGSCs

2.5 各組FGSCs中線粒體膜電位的變化

JC-1法染色檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相比,BU組、BU+PUE組和BU+PUE+DKK-1組FGSCs中線粒體膜電位均明顯降低(P<0.01);與BU組相比,BU+PUE組FGSCs中線粒體膜電位明顯升高(P<0.01);與BU+PUE組相比,BU+PUE+DKK-1組FGSCs中線粒體膜電位明顯降低(P<0.01),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BU+PUE+DKK-1組與BU組FGSCs中線粒體膜電位的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖6。

與Control組相比,**P<0.01;與BU組相比,##P<0.01;與BU+PUE組相比,&&P<0.01vs. the Control group, **P<0.01;vs. BU group,##P<0.01;vs. BU+PUE group,&&P<0.01圖6 JC-1法檢測(cè)各組FGSCs中線粒體膜電位變化(Bar=50 μm)Fig 6 Changes of mitochondrial membrane potential in each group of FGSCs detected by JC-1 method (Bar=50 μm)

2.6 各組FGSCs的凋亡率

Anenxin V-FITC/PI檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相比,BU組、BU+PUE組和BU+PUE+DKK-1組FGSCs的凋亡率均明顯升高(P<0.01);與BU組相比,BU+PUE組FGSCs的凋亡率明顯降低(P<0.05);與BU+PUE組相比,BU+PUE+DKK-1組FGSCs的凋亡率明顯升高(P<0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BU+PUE+DKK-1組與BU組FGSCs的凋亡率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖7。

與Control組相比,**P<0.05;與BU組相比,#P<0.05;與BU+PUE組相比,&P<0.05vs. the Control group, **P<0.05;vs. BU group,#P<0.05;vs. BU+PUE group,&P<0.05圖7 Anenxin V-FITC/PI檢測(cè)各組FGSCs的凋亡率Fig 7 Apoptosis rate in each group of FGSCs detected by Anenxin V-FITC/PI

2.7 各組FGSCs中細(xì)胞生殖干性相關(guān)蛋白Mvh和Oct4及Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白β-catenin和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)水平

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相比,BU組、BU+PUE組和BU+PUE+DKK-1組FGSCs中Mvh、Oct4、β-catenin和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01或P<0.05),而Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01);與BU組相比,BU+PUE組FGSCs中Mvh、Oct4、β-catenin和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05),Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平卻明顯降低(P<0.05);與BU+PUE組相比,BU+PUE+DKK-1組FGSCs中Mvh、Oct4、β-catenin和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05),Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BU+PUE+DKK-1組與BU組FGSCs中上述蛋白表達(dá)水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖8。

3 討論

POF通常是指40歲以下的女性出現(xiàn)包括閉經(jīng)、促性腺激素水平升高、性腺功能低下和不孕不育等臨床癥狀[9]。由于臨床上治療惡性腫瘤的經(jīng)典化療藥BU具有嚴(yán)重的生殖毒性,故BU常被用來誘導(dǎo)POF的動(dòng)物或細(xì)胞模型[10]。本研究通過分離乳鼠的FGSCs,并利用BU建立POF的細(xì)胞損傷為研究模型,探究PUE對(duì)POF的具體保護(hù)作用與機(jī)制。

PUE的主要活性成分為黃酮苷[1]。研究結(jié)果表明,PUE可通過下調(diào)核因子κB的活化和促炎因子的分泌,調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系-2p45相關(guān)因子-2通路和抗氧化物酶的表達(dá),對(duì)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激發(fā)揮明顯的改善作用[11]。本研究中,課題組通過分離乳鼠卵巢表層上皮的原代FGSCs,并以Ddx4、Oct4和Fragilis為生殖干細(xì)胞蛋白標(biāo)記物,同時(shí)輔以BrdU和Mvh的雙陽性對(duì)FGSCs的干細(xì)胞增殖活性檢測(cè)及Bimp-1、Fragilis、Dazl和Mvh等標(biāo)記基因來對(duì)FGSCs進(jìn)行鑒定后,通過CCK-8法篩選合適的PUE作用濃度來探究其對(duì)BU引起的FGSCs損傷的作用機(jī)制,結(jié)果表明,PUE可通過減輕BU誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所致線粒體損傷和細(xì)胞凋亡來恢復(fù)FGSCs的增殖和干性,而Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻滯劑DKK-1可顯著抵消PUE的上述保護(hù)作用。提示PUE可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善BU誘導(dǎo)的FGSCs的氧化應(yīng)激損傷和凋亡。

作為烷化劑的代表性藥物,BU可能通過多種機(jī)制導(dǎo)致卵巢功能的衰老,如急性卵巢血管毒性、ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙和原始卵泡池的枯竭等[10]。其中,細(xì)胞內(nèi)ROS的積累對(duì)卵巢衰老的進(jìn)展具有明顯的促進(jìn)作用,與ROS的過度積聚可通過損傷線粒體DNA正常結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)線粒體DNA發(fā)生突變或缺失,而線粒體DNA缺失的異常積累能直接影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量、發(fā)育和成熟相關(guān)[12]。同時(shí),越來越多的證據(jù)表明,ROS的異常累積不僅會(huì)促進(jìn)干細(xì)胞的過早衰老,從而阻礙正常組織的動(dòng)態(tài)平衡,還能激活線粒體依賴途徑誘導(dǎo)的干細(xì)胞凋亡[13]。因此,作為細(xì)胞中ROS管理的核心細(xì)胞器,線粒體可通過調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生,直接影響干細(xì)胞的功能和命運(yùn)。既往的研究結(jié)果表明,黃酮類化合物柚皮素可以減少ROS的產(chǎn)生,改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài),減少細(xì)胞凋亡,從而提高卵泡的存活率[14]。最近的研究結(jié)果表明,PUE還能通過多種干細(xì)胞的自我更新、增殖、分化和凋亡等行為,在衰老相關(guān)疾病中發(fā)揮顯著的療效[5]。SOD2是超氧化物歧化酶家族的成員之一,其將有毒的超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫和雙原子氧[15]。GPx能通過催化過氧化氫的還原來保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[16]。MDA是典型的脂質(zhì)過氧化物質(zhì),當(dāng)氧自由基水平增加時(shí),細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生大量的MDA[17]。本實(shí)驗(yàn)通過SOD2和GPx的活性以及MDA的濃度來衡量FGSCs中的氧化應(yīng)激水平,結(jié)果表明,PUE可通過Wnt/β-catenin途徑明顯改善BU誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。同時(shí),線粒體膜電位和凋亡的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往的研究一致,均表明PUE還能進(jìn)一步通過抑制ROS激活引起的細(xì)胞中線粒體損傷和細(xì)胞凋亡[18]。Bcl-2是線粒體膜蛋白,可以阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax蛋白與Bcl-2形成異源二聚體,作為細(xì)胞凋亡激活劑發(fā)揮作用[19]。因此,課題組選擇了抗凋亡分子Bcl-2、促凋亡因子Bax和凋亡標(biāo)志物分子caspase-3來評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡發(fā)生的分子機(jī)制,結(jié)果顯示,PUE不僅能明顯抑制BU誘導(dǎo)的FGSCs中干細(xì)胞標(biāo)志物Mvh和Oct4表達(dá)的降低,還能下調(diào)凋亡相關(guān)分子的表達(dá),而DKK-1可明顯逆轉(zhuǎn)PUE的上述作用。

綜上所述,PUE可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路和抗氧化應(yīng)激,來維持BU損傷下FGSCs的存活和干性,從而發(fā)揮保護(hù)卵巢的功能。本研究的結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充了PUE對(duì)POF治療作用的相關(guān)機(jī)制。然而,本研究也存在一些不容忽視的局限性。例如,PUE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響并不是一個(gè)普遍的結(jié)論,不同的劑量和不同的生物系統(tǒng)可能會(huì)影響PUE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的作用,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。此外,本實(shí)驗(yàn)獲得的FGSCs為小鼠源性,該細(xì)胞模型獲得的結(jié)果可能不適用于人類。因此,需要更多的研究來闡明PUE對(duì)人類生殖系統(tǒng)的影響。