瘤內(nèi)微生物與胰腺癌的治療

歐蘇文 孫備 李樂

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胰膽外科 肝脾外科教育部重點實驗室,哈爾濱 150001

【提要】 微生物作為腫瘤內(nèi)重要的生物學組分,在腫瘤發(fā)生、進展及藥物治療反應等多個方面發(fā)揮重要功能。瘤內(nèi)微生物群在胰腺癌病因?qū)W研究領域取得一定進展。本文系統(tǒng)解析胰腺腫瘤內(nèi)微生物特征及其對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和免疫微環(huán)境的影響,闡述基于瘤內(nèi)微生物的胰腺癌潛在治療策略,以期為相關領域研究提供更多的思路與見解。

胰腺癌惡性程度極高,80%～85%的患者在確診時即為不可切除或出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移,其5年生存率不足10%[1-2]。作為重要的消化性器官,胰腺曾被認為處于“無菌狀態(tài)”,然而,越來越多的研究證實,正常胰腺組織或胰腺腫瘤組織內(nèi)均存在特定的微生物。瘤內(nèi)微生物雖被證實能夠參與胰腺腫瘤的發(fā)生與進展,但其對胰腺癌生長、轉(zhuǎn)移及藥物治療方面的調(diào)控機制仍不明確。本文系統(tǒng)解析胰腺良、惡性腫瘤瘤內(nèi)微生物多樣性,探討瘤內(nèi)微生物在胰腺癌治療領域的應用價值,并結(jié)合筆者團隊工作,淺談目前瘤內(nèi)微生物在胰腺癌研究領域的諸多問題及爭議,為該領域相關研究拓展新的思路。

一、胰腺腫瘤內(nèi)微生物的來源

生理狀態(tài)下,胰腺組織內(nèi)存在少量微生物,當腫瘤發(fā)生時,腫瘤內(nèi)部的微生物豐度可升高至正常組織的1 000倍[3]。這些微生物源自何處是一個值得探討的問題。一方面,從解剖學角度,胰腺病變導致胰液的成分或pH改變,使微生物易于通過胰管逆行進入胰腺[4-5]。另一方面,腸道細菌可能自主進入腸系膜淋巴結(jié),進而通過免疫細胞運輸至胰腺[6-8]。筆者研究發(fā)現(xiàn),在急、慢性胰腺炎及胰腺腫瘤小鼠模型中,腸道菌群失衡可導致腸道局部炎癥反應,主要表現(xiàn)為炎癥因子如IL-17等大量釋放,進而破壞腸道屏障功能,導致腸道內(nèi)細菌極易透過腸道屏障,進入血液或者腸系膜淋巴組織,最終遷移至胰腺。此外,正常胰腺與胰腺腫瘤中均可檢出常見口腔細菌,如牙齦卟啉單胞菌等,并且,其菌群組成與口腔菌群極為相似,提示細菌還能夠借助“口腔-血液途徑”實現(xiàn)口腔菌群的重定位[5,9-10]。

二、胰腺腫瘤內(nèi)微生物的特征

因特殊的組織學特性,胰腺囊性腫瘤內(nèi)微生物菌落極為獨特。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn),胰腺囊性占位的囊液中主要以擬桿菌屬、埃希菌屬或志賀菌屬和氨基酸球菌屬為主;并且不同類型囊性占位囊液中的微生物組成并無差異。作為最常見的胰腺囊性腫瘤,胰腺導管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)囊液中細菌豐度顯著高于其他類型囊性腫瘤[12],而且高度不典型增生IPMN囊液的細菌DNA拷貝數(shù)顯著高于低度不典型增生IPMN。高度不典型增生IPMN囊液內(nèi)主要以顆粒菌屬、沙雷菌屬和梭桿菌屬為主,而低度不典型增生的IPMN囊液則以甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和丙酸桿菌屬為主。Hozaka等[13]對IPMN和正常胰腺組織的石蠟樣本進行16s rDNA 測序,發(fā)現(xiàn)二者在物種豐度與多樣性方面并無差異,但浸潤型IPMN中梭桿菌的相對豐度顯著高于非浸潤型IPMN,提示瘤內(nèi)微生物可能參與IPMN的進展[14]。目前,多數(shù)研究通過對比胰腺良性或低度惡性腫瘤與惡性腫瘤瘤內(nèi)微生物的差異,探究其在腫瘤診斷以及良、惡性鑒別中的應用價值。然而,因不同類型胰腺囊性腫瘤的組織結(jié)構(gòu)、起源均不盡相同,瘤內(nèi)微生物多樣性及成分復雜,同時,部分囊液的獲取依賴于超聲內(nèi)鏡等手段,獲得的瘤內(nèi)微生物易受到醫(yī)源性操作的影響,如胃內(nèi)容物及口腔細菌污染等,因此,筆者建議應慎重看待瘤內(nèi)微生物在評估胰腺腫瘤良惡性方面的作用。

對于胰腺癌與正常胰腺組織內(nèi)的菌群是否存在差異這一問題,目前仍存爭議[9,15-16]。研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌組織中主要以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為主;卟啉單胞菌屬、梭桿菌屬、普雷沃菌屬、二氧化碳嗜纖維菌屬、嗜血桿菌屬及月形單胞菌屬豐度也較正常組織更高[5,9,15-17]。另外,不同預后的胰腺癌患者的腫瘤組織內(nèi)的菌群組成也存在明顯差異,長期生存的患者比短期生存患者的腫瘤組織內(nèi)菌群多樣性更高[18]?；诨蚪M和轉(zhuǎn)錄組特征,胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)可分為基底樣、經(jīng)典和混合亞型[19]?；讟幽[瘤更具侵襲性且預后更差,微生物組分析提示,腫瘤內(nèi)主要以不動桿菌屬、假單胞菌屬和Sphingopyxis屬為主,且其豐度與腫瘤預后呈負相關[20]。此外,真菌作為另一類常見微生物,也被證實與胰腺癌的進展相關[21-22]。Aykut等[3]研究發(fā)現(xiàn),PDAC組織中子囊菌門和擔子菌門顯著升高;進一步研究提示,腫瘤組織中馬拉色菌屬主要參與PDAC進展。

筆者認為,目前關于胰腺癌菌群鑒定與分析中存在以下幾點問題:(1)由于樣本取材、處理及保存方式的不同,易導致外源性細菌的污染,影響結(jié)果的可靠性。大多數(shù)研究采取石蠟切片進行菌群分析,切勿忽略石蠟包埋過程中造成的微生物污染,因此,采取適當?shù)膶φ諛颖?有助于合理排除“潛在”污染的微生物,也是獲得準確結(jié)果的關鍵。(2)不同的測序手段、分析方法導致結(jié)果的不一致或不可重復。目前常規(guī)應用的測序方法包括細菌16s rDNA、真菌ITS測序以及宏基因組測序等,然而,各種方法孰優(yōu)孰劣?16s rDNA與ITS測序獲取的微生物的類別較少,并且需要合理排除測序過程中導致的其他外源性微生物干擾。對于宏基因組測序,因尚缺乏適用于瘤內(nèi)微生物注釋的數(shù)據(jù)庫及金標準,導致不同注釋策略獲得的結(jié)果存在一定的差異,因此需要慎重選擇[3,23-24]。

三、瘤內(nèi)微生物促進胰腺癌生長和轉(zhuǎn)移

胰腺癌因其生長迅速且易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移,進而失去手術時機,導致預后較差。瘤內(nèi)微生物被證實通過一系列機制參與胰腺癌進展,如牙齦卟啉單胞菌激活腫瘤細胞內(nèi)AKT信號通路,進而促進腫瘤細胞增殖[9,25];在小鼠模型中,胰腺癌內(nèi)真菌,如球形馬拉色菌能通過激活甘露糖結(jié)合凝集素或補體3促進胰腺癌生長[3]。然而,在體外實驗中,不同細菌感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)對腫瘤細胞的增殖能力影響差異巨大,較低的MOI(如1∶1或50∶1)能夠促進腫瘤細胞生長,而較高的MOI(500∶1)則抑制腫瘤生長[9]。筆者認為,需合理應用體外模型研究微生物對腫瘤細胞增殖能力的影響。就研究方法而言,采用與瘤內(nèi)細菌相同或近似的微生物豐度干預腫瘤細胞,才能準確地反映其對腫瘤生物學特性的改變。此外,瘤內(nèi)微生物還能夠影響腫瘤細胞轉(zhuǎn)移,如具核梭桿菌通過誘導胰腺癌細胞與癌旁正常細胞以自分泌和旁分泌的方式釋放炎癥因子(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、C-X-C基序趨化因子配體1、IL-8及巨噬細胞炎性蛋白3α等),促進腫瘤細胞的侵襲與遷移[26-27]。胰腺癌腫瘤微環(huán)境中不僅包括大量腫瘤上皮細胞與腫瘤相關成纖維細胞(cancer associated fibroblasts,CAFs),還包括各種免疫細胞以及內(nèi)分泌細胞等,那么何種細胞主要參與瘤內(nèi)微生物介導的腫瘤轉(zhuǎn)移?筆者研究發(fā)現(xiàn),瘤內(nèi)微生物廣泛存在于腫瘤上皮細胞與CAFs中,隨著單細胞研究技術的廣泛應用,能夠更清晰地描繪瘤內(nèi)微生物在不同腫瘤成分中的分布,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序技術,可以進一步理解瘤內(nèi)微生物在不同細胞亞群中的功能及其在腫瘤進展中的作用與動態(tài)變化。

四、瘤內(nèi)微生物重塑腫瘤免疫微環(huán)境

胰腺癌瘤內(nèi)菌群能夠重塑腫瘤免疫微環(huán)境,影響腫瘤生長及對藥物治療的反應。在KrasG12D/Pdx1-Cre小鼠模型中,抗生素能夠有效清除胰腺內(nèi)微生物,抑制組織內(nèi)骨髓源性免疫抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)富集,促進M1型巨噬細胞、CD4+T細胞Th1分化及CD8+T細胞激活[15]。同時,組織內(nèi)微生物選擇性激活Toll樣受體,驅(qū)動單核細胞向腫瘤抑制性表型分化,介導T細胞的免疫耐受,最終加速腫瘤進展。Riquelme等[18]通過構(gòu)建人源化糞菌移植小鼠模型,證實了來自長期生存的胰腺癌患者的腸道菌群通過改變胰腺腫瘤內(nèi)菌群組成,增強腫瘤CD8+T細胞活化并抑制MDSC和調(diào)節(jié)性T細胞富集,從而遏制腫瘤生長。此外,腫瘤內(nèi)某些特定微生物也被證實通過調(diào)控免疫影響腫瘤進展。具核梭桿菌通過CXCL1-CXCR2軸誘導的MDSC向瘤內(nèi)遷移,抑制CD8+T細胞浸潤,加速腫瘤生長[26];牙齦卟啉單胞菌通過刺激中性粒細胞趨化因子的產(chǎn)生,進而招募中性粒細胞浸潤及誘導彈性蛋白酶分泌,促進腫瘤進展[9]。那么是否可以通過重塑腸道菌群進而影響胰腺及腫瘤免疫微環(huán)境?筆者研究發(fā)現(xiàn),對抗生素處理后的小鼠進行糞菌移植能夠顯著上調(diào)胰腺組織中菌群相對豐度,同時可影響組織內(nèi)巨噬細胞及中性粒細胞及CD8+T細胞的分布,提示可以通過糞菌移植實現(xiàn)對胰腺癌內(nèi)腫瘤菌群豐度的調(diào)控,進而實現(xiàn)對胰腺癌組織內(nèi)免疫微環(huán)境重塑[28-29]。

五、瘤內(nèi)微生物對胰腺癌治療的影響

Geller等[30]研究發(fā)現(xiàn),攜帶長型胞苷脫氨酶(long isoform of the enzyme cytidine deaminase,CDDL)基因的一大類細菌能夠誘導腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥。CDDL通過代謝吉西他濱使其失活,降低腫瘤內(nèi)藥物濃度,使腫瘤細胞得以逃避化療藥物的殺傷。含有CDDL的細菌主要屬于γ變形菌門,且其已被證實在胰腺癌組織中具有較高的豐度。上述結(jié)果提示,通過改變腫瘤內(nèi)特定菌群豐度能夠逆轉(zhuǎn)以吉西他濱為核心的化療耐藥?？股刈鳛橄到y(tǒng)性清除細菌最簡單易行的手段,已被證實能夠顯著延長轉(zhuǎn)移性或不可切除胰腺癌患者預后,而其對可切除腫瘤患者預后無明顯影響;并且抗生素能夠有效增強以吉西他濱和5-氟尿嘧啶為基礎的化療效果,這也提示通過特定抗生素靶向干預腫瘤組織內(nèi)菌群將有助于提高腫瘤對化療的反應[31]。免疫治療適用于高微衛(wèi)星不穩(wěn)定或錯配修復基因缺陷的亞型腫瘤,由于胰腺癌組織內(nèi)缺乏免疫細胞浸潤且僅有2%腫瘤存在上述突變,免疫治療的效果差強人意[32]。雖然有研究提示,口服抗生素聯(lián)合抗PD-1能夠延緩胰腺癌進展,但其對腫瘤內(nèi)菌群改變的作用以及腫瘤免疫狀態(tài)的影響仍需進一步探究[15]。

六、針對瘤內(nèi)微生物的治療策略

瘤內(nèi)微生物廣泛存在且具組織特異性,針對瘤內(nèi)菌開發(fā)靶向治療手段將為胰腺癌治療提供全新的方向。筆者認為,抗生素雖然能夠降低腫瘤內(nèi)微生物豐度,但長期應用極易導致細菌耐藥、腸道菌群紊亂及繼發(fā)真菌感染等,其安全性與可靠性備受爭議。雖然目前眾多研究試圖探究如何通過精準給藥改變腫瘤內(nèi)菌群豐度,實現(xiàn)對化療藥物的增敏作用,然而,目前研究的局限性在于(1)缺乏合理的動物模型。大多研究采用小鼠皮下瘤模型予以瘤內(nèi)注射或者瘤旁注射的方式,最大程度改變腫瘤內(nèi)微生物豐度,然而,因皮下瘤通過皮膚直接與外界接觸,其微生物豐度難以控制。(2)靶向特定器官抗生素的篩選。目前尚無靶向抗生素能夠特定到達胰腺或者胰腺癌內(nèi),實現(xiàn)對靶器官微生物的定點清除。研究顯示噬菌體可以感染和裂解細菌,且對細菌物種具有高度的特異性,在治療細菌感染方面具有一定的優(yōu)勢,因此,噬菌體療法已被考慮作為清除瘤內(nèi)細菌的一種手段[33-34]。通過構(gòu)建以噬菌體引導的“生物-非生物混合納米系統(tǒng)”,不僅能夠清除瘤內(nèi)具核梭桿菌,還能夠增強化療反應、降低藥物用量及其毒性[35]。此外,通過腸道菌群移植、瘤內(nèi)菌群干預等方式改變瘤內(nèi)微生物,也可作為一種潛在治療策略。

七、未來展望

瘤內(nèi)微生物作為一個全新領域,在腫瘤治療方面存在巨大潛力,但目前尚缺乏基于臨床樣本的大規(guī)模測序分析,需要通過解析、識別及驗證特定微生物在腫瘤中的豐度,并可視化其在腫瘤微環(huán)境中的定位,進一步采用多組學研究策略,系統(tǒng)揭示瘤內(nèi)微生物與轉(zhuǎn)錄組、代謝組之間的內(nèi)在聯(lián)系。此外,微生物與腫瘤微環(huán)境的交互機制仍有待于進一步探索,需要通過微生物與腫瘤細胞、CAFs、免疫細胞等共培養(yǎng)等技術手段,深入探究瘤內(nèi)微生物對不同細胞亞型的調(diào)控作用及其在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及藥物治療等方面的分子機制。上述研究不僅有助于推動微生物移植或益生菌治療在臨床中的探索,同時也為進一步開發(fā)靶向相關通路、關鍵蛋白和代謝物的小分子抑制劑,提高腫瘤對化療甚至免疫治療的反應提供更多的轉(zhuǎn)化基礎。

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