基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性的作用機(jī)制

侯宇芯，任晉宏，姚紅，馬慧萊，薛慧清

（山西中醫(yī)藥大學(xué) 基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點實驗室，山西 晉中 030619）

0 引言

阿霉素（Doxorubicin，DOX）屬于蒽醌類抗生素，臨床上多用于治療惡性腫瘤，然而高心臟毒性嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用［1］。臨床預(yù)防控制心臟毒性的途徑主要是通過使用心臟保護(hù)劑、控制化療藥物劑量等方式，存在效果差、影響化療療效等不足，在治療時采用中醫(yī)的整體辯證觀念對患者進(jìn)行診治能夠取得較好的療效，有效降低心臟毒性［2］。經(jīng)過幾十年的研究，阿霉素導(dǎo)致不可逆心臟毒性的主要因素被認(rèn)為是造成心肌細(xì)胞凋亡和壞死［3-5］。

中醫(yī)證候研究表明腫瘤化療藥物在祛除病邪的同時導(dǎo)致氣血虛弱，機(jī)體狀況進(jìn)入惡性循環(huán)［6］。黃芪（AstragaliRadix）為補(bǔ)藥之長，是血中之氣藥，補(bǔ)氣生血，補(bǔ)氣行血，療諸臟之虛［7］。研究表明，黃芪水煎劑可以抑制神經(jīng)內(nèi)分泌激素CGRP、ANP、CNP、NPY 的分泌，改善心功能容量指標(biāo)，增加心臟射血能力［8］。賀智慧等研究表明黃芪注射液可以減少大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic dimension，LVESD），增加左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白Grp78、ATF-4 及CHOP 表達(dá)，增多縫隙連接蛋白Cx43 表達(dá)，減少p-Cx43 表達(dá)，改善心肌病理及超微結(jié)構(gòu)，減少心肌細(xì)胞凋亡［9］。但目前尚不明確黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性的有效成分和分子機(jī)制。

本研究利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，以“doxorubicin cardiotoxicity”為關(guān)鍵詞，獲取GSE79413 與GSE157282 基因芯片數(shù)據(jù)，應(yīng)用R 4.1.0 篩選差異表達(dá)基因（DEGs）；借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）篩選黃芪活性化合物，運用chemmapper、SwissTarget、pubchem、SEA 數(shù)據(jù)庫預(yù)測有效成分靶點；取DEGs 與藥物預(yù)測靶點的交集，整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建 “藥物-成分-靶點-疾病” 網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性的分子機(jī)制，并建立阿霉素心肌細(xì)胞毒性細(xì)胞模型，對可能的分子機(jī)制進(jìn)行驗證，從而為黃芪的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

TCMSP，PubChem，SwissTargetprediction，PharmMapper，ChemMapper，SEA，GEO 數(shù)據(jù)庫，VENNY 2.1.0，STRING，Uniprot，PDB，Graphpad prism 8.0.2，Cytoscape 3.7.2，PyMOL 1.8，R 4.1.0，AutoDockTools 1.5.6 及Vina 1.1.2。

1.2 細(xì)胞株、試驗藥物

大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2 為山西中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心細(xì)胞室保存；黃芪注射液（黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，批號：A03201104 295，規(guī)格為每支裝10 mL，相當(dāng)于原藥材20 g）；阿霉素（美國MCE 生物科技公司，批號：97451，規(guī)格為每瓶50 mg）。

1.3 試劑

胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購自博士德生物工程有限公司；青-鏈霉素、0.25%（體積分?jǐn)?shù)）胰蛋白酶消化液（不含EDTA，不含酚紅）、0.25%（體積分?jǐn)?shù)）胰蛋白酶消化液（含EDTA，不含酚紅）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；1×PBS、MTT、DMSO 購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol、擴(kuò)增試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京賽文創(chuàng)新生物科技有限公司；細(xì)胞周期試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；水為超純水；甲醇、磷酸為色譜純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.4 儀器

Waters 高效液相色譜儀；生物安全柜購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CO2培養(yǎng)箱購自英國New BRUNSWICK；離心機(jī)購自德國Eppendorf；熒光定量PCR 儀購自美國Thermo公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher 公司。

1.5 黃芪有效成分及其潛在靶點預(yù)測

以huangqi（黃芪）為關(guān)鍵詞，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索其活性成分，篩選條件為藥物相似性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%；利用Pubchem 數(shù)據(jù)庫獲取SMILES 號、3D 結(jié)構(gòu)文件用于化合物的靶點預(yù)測和后續(xù)的分子對接。根據(jù)靶點活性成分，檢索chemmapper、SwissTarget、Pubchem、SEA 數(shù)據(jù)庫預(yù)測其靶點。

1.6 獲取阿霉素心肌細(xì)胞毒性相關(guān)靶點

以“doxorubicin cardiotoxicity”為關(guān)鍵詞，在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）篩選并下載兩套符合條 件 的 基 因 芯 片 數(shù) 據(jù)（GSE79413 和GSE157282），獲取阿霉素處理組與正常對照組的基因表達(dá)譜［10］。使用R 4.1.0 中l(wèi)imma 包進(jìn)行處理，篩選出正?？瞻捉M與阿霉素模型組之間的DEGs，篩選條件：（1）采用t檢驗，定義校正后P＜0.05；（2）|logFC| ≥1，F(xiàn)C表示差異倍數(shù)（Fold change），繪制火山圖。

1.7 構(gòu)建 “藥物-成分-靶點-疾病” 網(wǎng)絡(luò)及篩選核心靶點

采用VENNY 在線程序，將化合物靶點與疾病靶點取交集獲得潛在治療靶點，繪制韋恩圖。運用Cytoscape 軟件將活性成分與潛在治療靶點進(jìn)行可視化，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。將潛在治療靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），挖掘蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.8 GO分析和KEGG分析

通過R 4.1.0 軟件，安裝Bioconductor 中DOSE、pathview 和limma 等程序包，對核心網(wǎng)絡(luò)基因進(jìn)行GO 富集分析與KEGG 通路分析。

1.9 主要活性成分與核心靶點的分子對接

利用PubChem 數(shù)據(jù)庫下載小分子配體3D結(jié)構(gòu)，借助Chem3D 17.1 能量最小化，作為分子對接的配體分子。通過PDB 數(shù)據(jù)庫獲取對接靶點的3D 結(jié)構(gòu)文件，借助PyMOL 軟件去除配體、去水、加氫等，作為受體分子。運用AutoDockTools 1.5.6 轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)文件格式為pdbqt，通過vina 進(jìn)行分子對接。配體分子與靶點之間存在結(jié)合活性時對接分?jǐn)?shù)＞4.25，結(jié)合活性較高時對接分?jǐn)?shù)＞5.0，存在強(qiáng)烈的結(jié)合活性時對接分?jǐn)?shù)＞7.0［11］。采用PyMOL 軟件對選定結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.10 黃芪注射液的HPLC分析［12］

對照品溶液的制備：制備濃度均為50 μg/mL 的槲皮素、異鼠李素及刺芒柄花素的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：將黃芪注射液30 倍濃縮，取2 mL 濃縮后黃芪注射液，用甲醇定容至10 mL，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，超聲30 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長為254 nm。流動相為A：甲醇，B：體積分?jǐn)?shù)0.4% 磷酸水；線性洗脫條件為：0 min～5 min：10% ～15% A；5 min～10 min：15% ～20% A；10 min～15 min：20% ～25% A；15 min～20 min：25% ～35% A；20 min～30 min：35% ～37% A；30 min～35 min：37% ～40% A。

1.11 細(xì)胞實驗驗證

在DMEM 高糖培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素溶液）中培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9C2。以0.7×104個/孔接種處于對數(shù)生長期的H9C2 細(xì)胞至96 孔板，培養(yǎng)12 h，用梯度濃度DOX（0、0.1、0.25、0.5、1 μg/mL）處理12 h［13］。MTT 法檢測細(xì)胞活力，以半數(shù)抑制濃度（IC50）作為模型濃度。按前述方法接種細(xì)胞，給藥組用不同濃度的黃芪注射液（25、50、75、100、150、200、400 mg/mL）處理細(xì)胞［14］，培養(yǎng)12 h，MTT 法檢測黃芪注射液對細(xì)胞活力。研究黃芪注射液對阿霉素心肌細(xì)胞毒性的影響時實驗分組設(shè)置為正常對照組、模型組及給藥組，各設(shè)6 個復(fù)孔。接種細(xì)胞，給藥組用不同濃度的黃芪注射液（25、50、75、100、150、200 mg/mL）處理細(xì)胞，培養(yǎng)箱孵育12 h后，模型組和給藥組加入阿霉素，使阿霉素濃度為0.5 μg/mL，12 h 后用MTT 法測定各組細(xì)胞活力。

1.12 流式細(xì)胞術(shù)檢測H9C2細(xì)胞凋亡率

用不含EDTA 的胰蛋白酶消化液離心收集細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞兩次，再用Annexin Buffer使細(xì)胞懸浮，加入Annexin V-FITC 和PI，在避光條件下4 ℃，細(xì)胞孵育5 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.13 流式細(xì)胞術(shù)檢測H9C2周期分布

用PBS 洗滌細(xì)胞（2000 r/min，離心5 min）收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1，取1 mL 單細(xì)胞懸液，離心后去除上清，向細(xì)胞中加入500 μL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，于4 ℃固定12 h，使用PBS 洗滌細(xì)胞，加入提前配置好的500 μL PI/RNase A 染色工作液，室溫避光30 min～60 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。

1.14 RT-qPCR法檢測基因相對表達(dá)差異

根據(jù)以上1.7 方法得到關(guān)鍵蛋白，通過生工生物有限公司官網(wǎng)上設(shè)計基因的引物序列，將引物加無酶水配成終濃度為10 μmol/L 用于后續(xù)實驗。按照1.10 方法培養(yǎng)細(xì)胞，然后使用總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA；去除基因組DNA 后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；根據(jù)擴(kuò)增試劑盒說明書，以三磷酸-甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，采用實時熒光定量PCR 方法檢測基因相對表達(dá)量，結(jié)果使用相對定量法進(jìn)行分析。

1.15 數(shù)據(jù)處理

借助Graphpad 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，在方差齊性條件下采用單因素方差分析One-way ANOVA，##與空白組比較，P＜0.01；*與模型組比較，P＜0.05；**與模型組比較，P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 黃芪化學(xué)活性成分與靶點預(yù)測

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫及查閱文獻(xiàn)，獲得黃芪有效成分21 個，如表1 所示；收集SwissTarget、chemmapper、SEA 數(shù)據(jù)庫中藥物靶標(biāo)，篩選后得到活性成分靶點996 個。

2.2 差異基因的篩選

依據(jù)差異基因篩選條件，將阿霉素處理組與正常對照組比較，基因芯片GSE79413 共有185 個基因發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)基因34 個，下調(diào)基因151 個；基因芯片GSE157282 共獲得2566 個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1537 個，下調(diào)基因1029 個。合并兩個芯片差異基因，去重包括2705 個差異基因，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖（a）基因芯片GSE79413； （b）基因芯片GSE157282，紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|≥1Fig.1 Volcanic map of differential genes(a) Gene chip GSE79413; (b) Gene chip GSE157282, red represents up-regulated genes, blue represents down-regulated genes,and the screening criteria is |logFC| ≥1

2.3 黃芪化合物靶點和疾病靶點交集結(jié)果

將黃芪有效成分預(yù)測靶點、差異基因兩者的潛在靶點經(jīng)過韋恩分析后，共有792 個交集靶點。

2.4 黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析

運用Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2 所示。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)，選取degree 值較高藥物活性成分排名靠前的前五個化合物，分別是7-O-甲基異丁香酚、山柰酚、槲皮素、刺芒柄花素、異鼠李素，這五個成分很可能是黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Myocardial cytotoxicity network diagram of Astragalus injection gainst adriamycin

2.5 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過STRING 數(shù)據(jù)庫，將潛在靶點按照默認(rèn)參數(shù)生成PPI 網(wǎng)絡(luò)；導(dǎo)入Cytoscape 軟件獲得一個包含110 個節(jié)點的初級PPI 網(wǎng)絡(luò)；經(jīng)拓?fù)浞治黾癕CC 插件計算，依次得到含51 個節(jié)點的次級PPI 網(wǎng)絡(luò)與包括STAT3、AKT1、MAPK1、TP53等12 個基因的核心PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心網(wǎng)絡(luò)篩選（a）黃色為初步篩選的基因；（b）橘色為拓?fù)浞治龊蠛Y選的基因；（c）為篩選出的12個核心基因Fig.3 PPI network construction and core network screening of Astragalus anti-adriamycin cardiomyocyte toxicity target(a) Yellow indicates the preliminary gene being screened; (b) Orange indicates the screened gene after topological analysis; (c) 12 Screened core genes

2.6 GO富集分析

采用R 軟件及Bioconductor 程序包對上述藥物-疾病共同靶點進(jìn)行生物過程生物過程（biological processes，BP）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）3 部分篩選，每一分類校正count 值最大的前7 條目，結(jié)果如圖4 所示。BP 分類包括細(xì)胞對藥物反應(yīng)、對化學(xué)應(yīng)急反應(yīng)、調(diào)節(jié)膜電位、調(diào)節(jié)類固醇代謝、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程等3060 個條目；CC 分類包括突觸膜、跨膜轉(zhuǎn)運復(fù)合物、膜筏、膜質(zhì)微區(qū)、膜區(qū)等197 個條目；MF 分類主要包括蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、通道活動、被動跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、離子通道活動、內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程等375 個條目。

圖4 GO富集分析結(jié)果Fig.4 GO enrichment analysis results

2.7 KEGG通路分析

結(jié)果表明有114 條信號通路被顯著富集，依據(jù)P＜0.05 排序得到前20 條通路，包括PI3K-AKT 信號通路、MAPK 信號通路等，如圖5 所示。其中PI3K-AKT 信號通路排名靠前，且MAPK1、AKT1等基因均在該通路發(fā)揮重要作用。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.8 黃芪主要活性成分與核心靶點的分子對接

7-O-甲基異丁香酚、山柰酚、槲皮素、刺芒柄花素、異鼠李素經(jīng)Chem3D 17.1 軟件能量最小化參數(shù)分別為20.064 9、14.623 0、15.048 6、34.041 4、20.414 9 kcal/mol，TP53、STAT3、AKT1、MAPK1degree 值較高且經(jīng)查閱文獻(xiàn)與心肌細(xì)胞毒性疾病相關(guān)。將2.4 黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性網(wǎng)絡(luò)中具有最高連接度的前5 個化學(xué)成分分別與其分子對接，活性成分與關(guān)鍵靶點結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，有較好的結(jié)合能力，如表2 所示。槲皮素與AKT1、TP53、MAPK1、STAT3具有最強(qiáng)結(jié)合能力，槲皮素與AKT1在VAL-123、LYS-72 處形成氫鍵；與TP53在GLN-72 處形成氫鍵；與MAPK1在ARG- 處形成氫鍵；與STAT3在GLU-638、GLY-656 處形成氫鍵，如圖6 所示。綜合上述結(jié)果，黃芪中活性成分可能通過調(diào)控PI3K-Akt通路中MAPK1、AKT1、TP53、STAT3核心基因發(fā)揮對阿霉素心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。

圖6 槲皮素與關(guān)鍵靶點分子對接圖（a）AKT1與槲皮素分子對接復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；（b）AKT1蛋白與槲皮素的詳細(xì)結(jié)合位點呈現(xiàn)；（c）TP53與槲皮素分子對接復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；（d）TP53蛋白與槲皮素的詳細(xì)結(jié)合位點呈現(xiàn)；（e）MAPK1與槲皮素分子對接復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；（f）MAPK1蛋白與槲皮素的詳細(xì)結(jié)合位點呈現(xiàn)；（g）STAT3與槲皮素分子對接復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；（h）STAT3蛋白與槲皮素的詳細(xì)結(jié)合位點呈現(xiàn)Fig.6 Docking diagram of quercetin with key target molecules(a) Three-dimensional structure of AKT1-quercetin complex; (b) Detailed binding sites of quercetin in AKT1 protein;(c) Three-dimensional structure of TP53-quercetin complex; (d) Detailed binding site of quercetin in TP53 protein;(e) Three-dimensional structure of MAPK1-quercetin complex; (f) Detailed binding sites of quercetin in MAPK1 protein;(g) Three-dimensional structure of STAT3-quercetin complex; (d) Detailed binding site of quercetin in STAT3 protein

表2 黃芪有效成分與核心基因的分子對接Table2 Molecular docking between the effective components of Astragalus and core genes

2.9 黃芪注射液的HPLC分析

本研究采用HPLC 檢測黃芪注射液中槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素的含量。依照方法學(xué)考察要求，分別進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率考察，結(jié)果分別為精密度：槲皮素峰面積RSD 為1.1%，異鼠李素峰面積RSD為1.6%，刺芒柄花素峰面積RSD 為1.5%；穩(wěn)定性實驗分別于0、2、4、6、8、12 h 測定黃芪注射液供試品溶液中槲皮素峰面積RSD 為1.1%，異鼠李素峰面積RSD 為1.2%，刺芒柄花素峰面積RSD 為1.2%；考察重復(fù)性時取黃芪注射供試品溶液，依法平行測定5 份，槲皮素峰面積RSD 為1.1%，異鼠李素峰面積RSD 為1.5%，刺芒柄花素峰面積RSD 為1.1%；對槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素做加樣回收率的考察，得槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素平均回收率分別為97.04%、98.75%、99.59%，RSD 分別為0.3%、0.5%、1.2%。

標(biāo)準(zhǔn)化合物的校準(zhǔn)曲線方程槲皮素：Y=3E+06X+120 975，R2=0.999 8；異鼠李素：Y=4E+06X+142 692，R2=0.996 9；芒柄花素：Y=7E+06X-19 336，R2=0.999 2。記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品含量，每樣品平行測定3 次，取平均值，計算得黃芪注射液中槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素含量分別為0.447 7、0.240 7、0.281 2 μg/mL，見圖7。

圖7 對照品及黃芪注射液在254 nm處的HPLC色譜圖（a）對照品；（b）黃芪注射液；1-刺芒柄花素；2-槲皮素；3-異鼠李素Fig.7 HPLC chromatograms of reference substance and Astragalus injection at 254 nm(a) mixed reference substance; (b) Astragalus injection; 1-formononetin; 2-quercetin; 3-isorhamnetin

2.10 不同濃度阿霉素對心肌細(xì)胞的毒性

隨著阿霉素濃度（0、0.1、0.25、0.5、1.0 μ g/mL）的增加，細(xì)胞存活率顯著下降，除0.1 μ g/mL 組外，與正常對照組相比，其余各劑量組細(xì)胞存活率均具有極顯著性差異（P＜0.01），如圖8 所示。計算阿霉素的IC50 值為0.519 0 μg/mL，選取阿霉素0.5 μg/mL 作為模型濃度。

圖8 阿霉素濃度對細(xì)胞存活的影響Fig.8 Effect of adriamycin concentration on cell survival

2.11 不同濃度黃芪注射液對心肌細(xì)胞的保護(hù)

隨著黃芪注射液濃度（0、25、50、75、100、150、200、400 mg/mL）的增加，細(xì)胞存活率逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)到400 mg/mL 組時，與正常對照組相比細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01），如圖9 所示。

圖9 黃芪注射液對細(xì)胞存活的影響Fig.9 Effect of Astragalus injection on cell survival

2.12 黃芪注射液抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性

黃芪注射液可以促進(jìn)阿霉素毒性心肌細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴性，在200 mg/mL 處發(fā)揮最佳的保護(hù)效果（P＜0.01），如圖10 所示。

圖10 黃芪注射液對阿霉素毒性細(xì)胞存活的影響Fig.10 Effect of Astragalus injection on the survival of adriamycin toxic cells

2.13 黃芪注射液減少阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

如圖11 所示，圖11（a）中左上象限Q1 代表壞死細(xì)胞，右上象限Q2 代表晚期凋亡細(xì)胞，右下象限Q3 代表早期凋亡細(xì)胞，左下象限Q4 代表活細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率為Q2 與Q3 象限百分率之和。與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，黃芪注射液在75、100 mg/mL 可以顯著減少 H9C2 細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。

圖11 黃芪注射液對阿霉素毒性的 H9C2 細(xì)胞凋亡的影響Fig.11 Effect of Astragalus injection on apoptosis of adriamycin toxic H9C2 cells

2.14 黃芪注射液調(diào)節(jié)細(xì)胞周期減輕阿霉素心肌細(xì)胞毒性

結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞G1 期顯著減少，G2 期顯著升高（P＜0.01），表明細(xì)胞在G1 期被促進(jìn)，G2 期被阻滯；與模型組比較，給藥組黃芪注射液在 75、100 mg/mL 時G1 期細(xì)胞顯著升高，G2 期細(xì)胞顯著減少（P＜0.01），如圖12 所示。

圖12 黃芪注射液對阿霉素毒性的 H9C2 細(xì)胞周期的影響（a）對照組；（b）DOX 組；（c）黃芪注射液 75 mg/mL；（d）黃芪注射液 100 mg/mL；（e）各組H9C2細(xì)胞中G1、G2細(xì)胞周期的變化。（a）、（b）、（c）、（d）圖中草綠色為G1期，亮藍(lán)色代表G2期Fig.12 Effect of Astragalus injection on H9C2 cell cycle induced by adriamycin toxicity(a) Control group; (b) DOX group; (c) Astragalus injection 75 mg/mL ; (d) Astragalus injection 100 mg/mL ; (e) Changes in the G1 and G2 cell cycles of each group of H9C2 cells.Grass green represents G1 phase , and light biue represents G2 phase in(a), (b), (c), and (d)

2.15 黃芪注射液抗阿霉素對核心基因mRNA 表達(dá)的調(diào)節(jié)

通過熒光定量PCR 檢測核心基因mRNA 相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：阿霉素造模后，MAPK1、TP53、STAT3基因mRNA 相對表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)趨勢，AKT1基因mRNA 相對表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)趨勢，隨著黃芪注射液給藥濃度的增加，MAPK1、TP53、STAT3基因mRNA 相對表達(dá)量減少，AKT1基因mRNA 相對表達(dá)量上升，如圖13 所示。

圖13 黃芪注射液對AKT1、TP53、MAPK1、STAT3 mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.13 Effects of Astragalus injection on mRNA expression levels of AKT1, TP53, MAPK1 and STAT3

3 討論

化療藥物阿霉素臨床應(yīng)用呈現(xiàn)出廣泛嚴(yán)重的心臟毒性，發(fā)現(xiàn)時通常已心力衰竭［15］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)黃芪注射液可以改善患者心臟功能，治療慢性頑固性心衰［16］。黃芪注射液聯(lián)合右丙亞胺可以改善心功能，減少心電圖發(fā)生異常的情況，使心臟各項生化指標(biāo)趨于正常，從而達(dá)到防治阿霉素所致化療后心臟毒性的功效［17］。但是其發(fā)揮作用的有效成分和分子機(jī)制尚不清晰，故本研究采用DOX 誘導(dǎo)H9C2 建立心肌細(xì)胞毒性模型，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證初步探析黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性的有效成分和作用機(jī)制，為黃芪注射液臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

多項研究表明黃芪參與調(diào)控多種生物過程，包括細(xì)胞程序性死亡、抗氧化等，其成分發(fā)揮補(bǔ)氣、強(qiáng)心、等功效主要是通過皂苷類、槲皮素、毛蕊異黃酮等關(guān)鍵成分發(fā)揮作用［18-20］。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 通路與心血管疾病預(yù)防和治療密切相關(guān)，該通路通過調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡不同階段的相關(guān)凋亡因子、心肌細(xì)胞的增值、自噬與壞死等過程控制心肌細(xì)胞存活和功能［21］。研究還發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)中槲皮素能夠通過調(diào)節(jié)P53、AKT、MAPK 等信號分子，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、線粒體穩(wěn)態(tài)達(dá)到防治阿霉素心肌病的目的［22］。本研究網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明黃芪可能通過調(diào)控PI3K-Akt、P53、MAPK 等信號通路中核心基因MAPK1、AKT1、TP53、STAT3對阿霉素所致心肌細(xì)胞毒性發(fā)揮保護(hù)作用。分子對接結(jié)果提示，活性成分槲皮素與AKT1、TP53、MAPK1、STAT3關(guān)鍵靶點結(jié)合打分均較高，為中藥單體對阿霉素減毒作用研究提供參考［23］。

研究發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對心肌細(xì)胞保護(hù)作用主要通過減輕小鼠心臟肥大，提高心肌內(nèi)GSH含量，穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制心肌細(xì)胞發(fā)生異常凋亡來實現(xiàn)［24］。研究發(fā)現(xiàn)黃芪注射液能顯著減輕阿霉素所致小鼠心肌組織病理及超微結(jié)構(gòu)損傷，并有效維護(hù)其心肌纖維及膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性［25］。研究表明STAT3參與細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等反應(yīng)［26］。研究還發(fā)現(xiàn)硫化氫可能通過下調(diào)STAT3改善MMPs/TIMPs 失調(diào)，從而改善高甲狀腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化［27］。腫瘤蛋白P53（TP53）為PI3K/PTEN/AKT 信號通路關(guān)聯(lián)基因之一，為常見促癌基因，且參與眾多腫瘤發(fā)?。?8］。TP53通過調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，合成細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，并且在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療和預(yù)后方面扮演重要角色［29］。AKT 參與癌癥、心血管等疾病的發(fā)生發(fā)展，通過調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞存活等多種生物過程發(fā)揮作用。苗艷菊等從正反兩方面研究證實AKT1可以促進(jìn)心肌纖維化，主要是通過促進(jìn)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化實現(xiàn)的［30］。研究表明MAPK 在心肌纖維化的信號調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用［31］。本研究網(wǎng)絡(luò)分析中，7-O-甲基異丁香酚、山柰酚、槲皮素、刺芒柄花素、異鼠李素顯示了較高的度值，分子對接打分提示槲皮素與AKT1、TP53、MAPK1、STAT3具有最強(qiáng)結(jié)合能力；體外細(xì)胞實驗證實，黃芪注射液可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，減少阿霉素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制為調(diào)控核心基因STAT3、TP53、AKT1、MAPK1的表達(dá)來發(fā)揮作用。該研究結(jié)果為黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性的有效成分和作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究闡述了黃芪抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性的有效活性成分、關(guān)鍵靶點及重要通路，并在理論上預(yù)測中藥單體槲皮素有保護(hù)阿霉素心肌細(xì)胞毒性的潛力，下一步應(yīng)更深入研究中藥單體槲皮素抑制阿霉素心肌細(xì)胞毒性的具體機(jī)制，并進(jìn)一步通過體內(nèi)實驗驗證黃芪注射液抗阿霉素心肌細(xì)胞毒性的作用機(jī)制，為臨床減輕阿霉素引起的心臟毒性提供參考。