低共熔溶劑提取連翹不同部位總黃酮及抗炎抗氧化活性研究

趙慧，杜會(huì)枝

（山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所，山西 太原 030006）

0 引言

低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DESs）是一種快速興起的替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑和離子液體（Ionic liquids，ILs）的新型綠色溶劑，具有生物兼容性、可回收性、可生物降解性、低毒或無毒的特點(diǎn)，因此是當(dāng)今公認(rèn)的五類綠色溶劑（水、超臨界液體、ILs、DESs 和生物質(zhì)溶劑）之一［1-2］。DESs 的概念由Abbott 等［3］于2003 年首次提出，是由多種組分間多種分子間相互作用形成的，主要是分子間的氫鍵相互作用。DESs由氫鍵供體和氫鍵受體［4］組成。氫鍵供體主要是酰胺、羧酸、多元醇等物質(zhì)，氫鍵受體有含鹵離子的季胺、季鏻鹽等，氯化膽堿（ChCl）是最常用的氫鍵受體。DESs 在氣體吸收［5］、酶催化［6］、有機(jī)合成［7］等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。近年來，DESs 已被廣泛用于黃酮、皂苷、多糖、生物堿、酚酸、醌類及揮發(fā)油等中藥活性成分的提?。?］。

連翹（Forsythiasuspensa（Thunb.） Vahl）為木犀科連翹屬植物，傳統(tǒng)的應(yīng)用集中在解熱、抗炎等方面［9］。連翹是大宗中藥材之一，也是山西省道地藥材之一。連翹葉為連翹的葉片，《中華本草》記載“連翹莖葉，性寒，主治心肺積熱”［10］。連翹每年的花期為3-4 月份，花期長、花量大，花色鮮黃且長時(shí)間不褪色，是一類極其豐富的資源?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)連翹不同部位具有抗菌［11］、抗病毒［12］、抗炎［13］、抗氧化［14］等多種藥理作用。連翹不同部位，包括連翹果實(shí)、花、葉、莖等的化學(xué)成分相似，含量略有不同，主要包括苯乙醇苷類、木脂素類、酚酸類、黃酮類、萜類及揮發(fā)油、C6-C2 天然醇及其苷類等［15］。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一大類化合物，其基本母核為2-苯基原色酮。中藥材中存在較多黃酮類化合物，目前已知的黃酮種類近萬種［16］，具有抗氧化和抗炎等生物活性［17］。黃酮類化合物也是連翹中主要成分之一［18］，從連翹中分離的黃酮類化合物主要有蘆丁、山柰酚、紫云英苷、橙皮苷、槲皮素、異槲皮素、異鼠李素、黃芩苷、金絲桃苷、木犀草素、木犀草苷、橙皮苷等［19］。黃酮類物質(zhì)的提取有許多方法，如超聲波提取法［20］、纖維素酶解法［21］、有機(jī)溶劑回流提取法、索氏提取法［22］等。超聲波輔助低共熔溶劑提取具有安全環(huán)保且不受熱破壞等優(yōu)點(diǎn)。本研究篩選出對(duì)連翹總黃酮提取率高的低共熔溶劑，并對(duì)連翹不同部位總黃酮進(jìn)行抗炎和抗氧化活性研究，為研究和開發(fā)綠色的總黃酮提取技術(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

連翹葉、花和果均于山西省陵川縣古郊鄉(xiāng)采集，張立偉教授鑒定為連翹植物的葉、花和果。氯化膽堿（ChCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）購于上海源葉生物科技有限公司；乙醇、乙二醇、丙三醇、1，2-丙二醇均為分析純（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%）購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于成都曼思特生物科技有限公司（MUST-21011510，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Sigma-Aldrich）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；FeCl3購于天津市北辰方正試劑廠；2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）購于北京索萊寶科技有限公司；醋酸鈉購于天津光復(fù)化學(xué)試劑廠；FeSO4·7H2O 購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH 均購于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購于博士德生物工程有限公司；青霉素和鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購于杭州四季青生物材料公司；脂多糖（LPS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%）購于北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫（H2O2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%）購于博士德生物工程有限公司；CCK-8 試劑盒購于MedChemExpress；一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購于博士德生物工程有限公司。

超聲波清洗器：SK2200HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；集熱式恒溫磁力攪拌器：DF101-S，河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；酶標(biāo)儀：MD Spectra Max 190，美國Molecular devices 公司；紫外可見分光光度計(jì)：珀金埃爾默儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡：上海尼康公司；掃描電子顯微鏡：JEOL-JSM-6701F，日本電子公司。

1.2 DESs的制備

按一定摩爾比將ChCl 和氫鍵供體（乙二醇，1，2-丙二醇，丙三醇）置于燒杯中，90 ℃水浴加熱攪拌6 h～12 h，直至形成透明無色的液體，室溫放置一段時(shí)間后性狀不會(huì)改變。見表1。

表1 DESs，其中ChCl是氫鍵受體Table 1 DESs, where ChCl is a hydrogen bond receptor

1.3 不同溶劑對(duì)連翹葉、花、果中總黃酮的提取

把連翹葉、花、果研磨粉碎，過40 目篩后低溫密封避光保存。按照液固比15 mL/g 的比例將DESs 和連翹粉末混勻，超聲波輔助提?。禾崛」β?00 W，提取時(shí)間1 h，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)重，搖勻，離心后得到連翹不同部位的DESs 提取液。同時(shí)用水和體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇進(jìn)行提取，方法同上。

做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前連翹不同部位提取液需用無菌0.22 μm 微孔濾膜過濾。

1.4 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

用體積分?jǐn)?shù)95% 乙醇溶解蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品得0.2 mg/mL 蘆丁溶液，分別吸取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 蘆丁溶液于25 mL 容量瓶中，分別加入1.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液，靜置6 min 后加入1.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al（NO3）3溶液，再靜置6 min；最后加10.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH 溶液，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇（下同）定容，搖勻，室溫靜置15 min，最后用紫外分光光度計(jì)測定510 nm 處各組溶液的吸光度值［23］。橫坐標(biāo)（X）為溶液質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)（Y）為吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁濃度在0～0.08 mg/mL 范圍有較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，Y=12.802X+ 0.042，R2=0.999 8。

1.5 連翹總黃酮提取率計(jì)算

取適量提取液，稀釋后按照1.4 的方法測定其吸光度，重復(fù)3 次，吸光度值代入回歸方程，求出提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度C，然后根據(jù)公式計(jì)算總黃酮提取率：Y=（C×V0×V1）/（m×V2），其中Y為總黃酮提取率，V0為定容后體積，V1為提取液總體積，V2為測定用的體積，m為藥材的質(zhì)量。

1.6 DPPH·法測定連翹提取液的抗氧化活性

配制100 μmol/L 的DPPH 乙醇溶液。將連翹提取液以每孔100 μL 加入96 孔板中（空白對(duì)照組中加入100 μL DES-3），再加入100 μL DPPH 乙醇溶液，于25 ℃避光孵育30 min，520 nm 處檢測吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算清除率：清除率（%）=（1-A1/A2）×100%，其中A1為樣品吸光度，A2為空白對(duì)照吸光度。

1.7 FRAP法檢測連翹提取液的總抗氧化能力

采用改良的Benzie 等的方法檢測連翹不同部位提取液的總抗氧化能力［24-25］。配制pH 為3.6 的300 mmol/L 醋酸鈉緩沖液、10 mmol/L 的TPTZ 溶液、20 mmol/L FeCl3溶液，按照10∶1∶1的體積比將上述溶液混合得到FRAP 工作液。13.9 mg FeSO4·7H2O 溶于50 mL 去離子水中，再將其稀釋為不同濃度的FeSO4溶液。取20 μL FeSO4溶液，加入180 μL FRAP 工作液，混勻后37 ℃孵育10 min，用酶標(biāo)儀在593 nm 處測吸光度值，F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，建立FeSO4當(dāng)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=1.164X+0.110，R2=0.998 9，如圖2所示。

圖2 硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of FeSO4

樣品總抗氧化能力測定：取20 μL 樣品溶液，加入180 μL FRAP 工作液，混勻后在37 ℃孵育10 min，593 nm 處測吸光度值，根據(jù)吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4的濃度，定義為FRAP 值，F(xiàn)RAP 值越大，抗氧化能力越強(qiáng)。

1.8 細(xì)胞活力、炎癥因子、氧化因子的測定

RAW264.7 細(xì)胞在DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞長到對(duì)數(shù)期進(jìn)行傳代或用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、給藥組。對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞；模型組用LPS（2 μg/mL）或H2O2（800 μmol/L）誘導(dǎo)24 h；給藥組用相應(yīng)提取液預(yù)處理2 h 后，再用LPS 或H2O2誘導(dǎo)24 h。

CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率：避光條件下每孔加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)箱中放置1 h 后450 nm 處測吸光度值。NO 和TNF-α 含量測定：收集細(xì)胞上清液，根據(jù)相應(yīng)說明書進(jìn)行操作，分別在540 nm 和450 nm 測定吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算出NO 和TNF-α 的含量。MDA 和SOD 試劑盒：收集各組細(xì)胞，裂解，利用BCA 試劑盒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞蛋白濃度，參照MDA 試劑盒和SOD 試劑盒的說明書分別檢測樣品中MDA 含量和SOD 酶活力。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，文中的數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n= 3，用Origin 2018 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選DESs

本文使用三種多元醇與ChCl 以不同比例成功制備了7 種DESs，列于表1。用DESs、水和60%乙醇在相同條件下超聲波輔助提取連翹不同部位總黃酮。不同溶劑對(duì)連翹不同部位總黃酮的提取率如圖3 所示。不同溶劑對(duì)連翹葉總黃酮提取率順序?yàn)椋篋ES-3 ＞ DES-4 ＞＞ DES-1 ＞ DES-7 ＞ DES-6 ＞＞ 60%乙醇 ＞ DES-2 ＞ DES-5 ＞ 水。在DES-3 條件下，超聲波輔助提取連翹葉總黃酮提取率達(dá)到最大，為481.33 mg/g。不同溶劑中連翹花總黃酮提取率順序?yàn)椋篋ES-3 ＞＞ DES-5 ＞DES-7 ＞ DES-6 ＞ DES-1 ＞ DES-2 ＞ 60%

圖3 不同溶劑中連翹不同部位的總黃酮提取率Fig.3 Extraction rate of total flavonoids from different parts of Forsythia suspensa in different solvents

乙醇 ＞ DES-4 ＞＞ 水。在DES-3 條件下，超聲波輔助提取連翹花總黃酮提取效果最佳，提取率達(dá)到361.35 mg/g。不同溶劑中連翹果實(shí)總黃酮提取率順序?yàn)椋篋ES-5 ＞ DES-4 ＞DES-3 ＞＞ DES-1 ＞ DES-6 ＞ DES-2 ＞60% 乙醇 ＞ 水 ＞ DES-7，連翹果總黃酮在DES-5 的提取率最高，為467.84 mg/g。60%乙醇、DES-1、DES-2、DES-3、DES-4 及DES-6中連翹不同部位總黃酮提取率順序?yàn)椋喝~ ＞果 ＞ 花；水作為溶劑時(shí)，連翹不同部位總黃酮提取率順序?yàn)椋喝~ ≈ 果 ＞ 花；DES-5 中連翹不同部位總黃酮提取率順序?yàn)椋汗?＞＞ 花 ≈葉；DES-7 中連翹不同部位總黃酮提取率順序?yàn)椋喝~ ＞ 花 ＞ 果；總體來說DESs 的提取效果好于乙醇和水，本文所用的溶劑中，大部分溶劑對(duì)連翹不同部位總黃酮的提取率順序?yàn)椋喝~ ＞ 果 ＞ 花。在保證提取率高且使用同一溶劑的情況下，選取DES-3 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的提取溶劑。

2.2 連翹不同部位提取前后的掃描電鏡觀察

掃描電鏡是一種觀察樣品表面形態(tài)的重要檢測技術(shù)手段，有較高的分辨率和放大倍數(shù)，能使物質(zhì)的圖像呈現(xiàn)立體感，而且樣品制備簡單［26］，甚至還可直接觀察一些新鮮藥材和粉末［27］。本文中，我們利用掃描電子顯微鏡觀察DES-3 超聲波輔助提取前后連翹不同部位微觀結(jié)構(gòu)的變化（圖4，×3000），以此來探索植物細(xì)胞破碎程度與植物細(xì)胞中化合物釋放率之間的關(guān)系。從圖中我們不難發(fā)現(xiàn)，提取前后連翹細(xì)胞表面的完整性有較大的變化，提取后連翹不同部位細(xì)胞出現(xiàn)明顯的破裂和塌陷。其破碎程度與提取率表現(xiàn)出了明顯的正相關(guān)，連翹葉破損程度最大，其次是連翹果實(shí)，最后是連翹花。

圖4 DES-3提取連翹不同部位前后的掃描電子顯微鏡圖DES-3超聲波輔助提取前（a）和后（b）的連翹葉粉末，DES-3超聲波輔助提取前（c）和后（d）的連翹花粉末，DES-3超聲波輔助提取前（e）和后（f）的連翹果實(shí)粉末Fig.4 SEM images of different parts of Forsythia suspensa before and after extraction in DES-3Forsythia suspensa leaf powder before (a) and after (b) extraction in DES-3, Forsythia suspensa flower powder before (c) and after(d) extraction in DES-3, Forsythia suspensa fruit powder before (e) and after (f) extraction in DES-3

2.3 化學(xué)水平評(píng)估連翹不同部位提取液的抗氧化活性

DPPH·多用于測定化合物、提取物等的體外抗氧化能力。采用DES-3 對(duì)連翹不同部位提取，通過DPPH·自由基清除實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗氧化活性分析。如圖5（a）所示，連翹葉、花、果提取液均有一定的抗氧化作用，其中連翹葉提取液對(duì)DPPH·自由基清除率為72.81%，連翹花提取液對(duì)DPPH·自由基清除率為63.64%，連翹果提取液對(duì)DPPH·自由基清除率為67.86%。連翹葉提取液的抗氧化活性大于連翹果提取液的抗氧化活性，連翹花提取液的抗氧化活性較弱。連翹不同部位提取液的自由基清除率與其總黃酮含量呈正相關(guān)，即總黃酮含量越高，對(duì)DPPH·自由基的清除率越高?？寡趸镌谒嵝詶l件下，可將Fe3+-TPTZ（橘黃色）還原成Fe2+-TPTZ（藍(lán)紫色），根據(jù)FRAP 值大小可以衡量樣品的總抗氧化能力［27］。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算連翹不同部位提取液的FRAP 值，如圖5（b）所示，連翹葉組的FRAP 值為1.13 mmol/L，連翹花組的FRAP 值為0.89 mmol/L，連翹果組的FRAP 值為1.11 mmol/L，與DPPH·結(jié)果一致，連翹葉組的FRAP 值略大于連翹果組，連翹花組的FRAP值最小。連翹不同部位提取液的FRAP 值與總黃酮含量呈正相關(guān)，即總黃酮含量越高，F(xiàn)RAP值越大。結(jié)合DPPH·自由基清除率和FRAP值，說明連翹不同部位提取液的抗氧化活性與其總黃酮含量呈正相關(guān)，即總黃酮含量越高，抗氧化活性越強(qiáng)。

圖5 連翹不同部位提取液在化學(xué)水平的抗氧化活性評(píng)估（a）連翹不同部位提取液對(duì)DPPH·自由基清除率；（b）連翹不同部位提取液的總抗氧化能力測定Fig.5 Antioxidant activity of extracts of different parts of Forsythia suspensa at chemical level(a) Comparison of DPPH· free radical scavenging rate among extracts of different parts of Forsythia suspensa; (b) Determination of total antioxidant capacity of extracts of different parts of Forsythia suspensa

2.4 連翹不同部位提取液在細(xì)胞水平的抗氧化活性評(píng)價(jià)

H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷模型，常用于物質(zhì)的抗氧化活性研究。MDA 含量是反映機(jī)體抗氧化潛能的重要參數(shù)，間接反映細(xì)胞損傷的程度［28］。SOD 是一種抗氧化金屬酶，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用［29］。在H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷模型上，本文研究了DES-3 中連翹不同部位提取液的抗氧化能力。圖6（a）表明H2O2模型組的MDA 含量顯著高于空白對(duì)照組；與H2O2模型組相比，連翹不同部位提取液均降低了MDA 的含量，模型組MDA 含量為1.26 nmol/mg，連翹葉組的MDA 含量為0.65 nmol/mg，降低了48.41%；連翹花組的MDA 含量0.84 nmol/mg，降低了33.33%；連翹果組的MDA 含量為0.81 nmol/mg，降低了35.71%。連翹葉組MDA 值的降低幅度大于連翹果組，連翹花組的最小。從圖6（b）中得出H2O2模型組的SOD 活力（0.47 U）顯著低于空白對(duì)照組（1.11 U）；與H2O2模型組相比，連翹不同部位提取液不同程度地提高了SOD 的活力，連翹葉組的SOD 活力為0.75 U，提高了59.57%，連翹花組的SOD 活力為0.49 U，提高了4.26%；連翹果組的SOD活力為0.60 U，提高了27.66%；連翹葉組的SOD 活力大于連翹果組的，連翹花組的最弱。總之，連翹葉提取液的抗氧化活性大于連翹果提取液的，連翹花提取液的抗氧化活性最弱。連翹不同部位提取液的抗氧化活性與其總黃酮含量呈正相關(guān)，總黃酮含量越高，抗氧化活性越強(qiáng)。

圖6 連翹不同部位提取液對(duì)細(xì)胞水平的抗氧化活性評(píng)價(jià)（a）連翹不同部位提取液對(duì)MDA含量的影響；（b）連翹不同部位提取液對(duì)SOD活力的影響。相比于對(duì)照組，### P ＜0.001，## P ＜0.01；相比于H2O2組，*** P ＜ 0.001，** P ＜ 0.01，* P ＜ 0.05。NS為無差異Fig.6 Antioxidant activity of extract from different parts of Forsythia suspensa at cell level(a) Effects of extracts from different parts of Forsythia suspensa on MDA content; (b) Effects of extracts from different parts of Forsythia suspensa on SOD activity.### P < 0.001 and ## P <0.01 vs.the control group, *** P < 0.001 and **P < 0.01,* P < 0.05 vs.H2O2 group.NS means no significant difference

2.5 連翹不同部位提取液在細(xì)胞水平的抗炎活性評(píng)估

LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞體外炎癥模型常用于物質(zhì)的抗炎活性研究。NO 是炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的促炎因子，過量的NO 可導(dǎo)致DNA 損傷，誘導(dǎo)凋亡和氧化應(yīng)激，其分泌量可間接反映炎癥程度［30］。TNF-α 是一種多向性的促炎性細(xì)胞因子，也是一種單核因子（炎癥因子），具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，參與炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)休克、組織損傷的過程［31］。利用LPS誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥模型，本文評(píng)估了DES-3 中連翹不同部位提取液的抗炎活性。首先用CCK-8 檢測各組的細(xì)胞活力，如圖7a 如示，提取液具有減輕細(xì)胞損傷和增加細(xì)胞活力的作用。與對(duì)照比相比，LPS 模型組細(xì)胞存活率為58.98%，加入連翹葉提取液，細(xì)胞存活率恢復(fù)至79.50%，連翹花組的細(xì)胞存活率為64.27%，連翹果組的細(xì)胞存活率為72.00%。連翹葉對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞活力回調(diào)效果最好，連翹果組次之，連翹花組較弱。圖7（b）表明與LPS 組相比，連翹葉、花、果均降低了NO 的含量，模型組的NO 含量為36.53 μmol/L，連翹葉組的NO 含量為6.07 μmol/L，降低了83.38%；連翹果組的NO 含量為12.47 μmol/L，降低了65.86%；連翹花組的NO 含量為14.59 μmol/L，降低了60.06%。連翹葉組的NO 含量小于連翹果組，連翹花組的NO 含量最高。圖7（c）顯示，與LPS 模型組相比，連翹不同部位提取液降低了炎癥因子TNF-α 的含量；模型組TNF-α 含量為809.16 pg/mL，連翹葉組的TNF- α 含量為538.91 pg/mL，降低了33.40%；連翹果組的TNF-α 含量為671.83 pg/mL，降低了16.97%；連翹花組的TNF-α 含量含為805.93 pg/mL，降低了3.99%。連翹葉組的TNF-α 含量降低最多，連翹果組次之，連翹花組最弱?？傊?，連翹葉提取液的抗炎活性大于連翹果提取液，連翹花提取液的抗炎活性最弱。連翹不同部位提取液的抗炎活性與其總黃酮含量呈正相關(guān)，總黃酮含量越高，抗炎活性越高。

圖7 連翹不同部位提取液的抗炎活性評(píng)價(jià)（a）CCK-8法檢測細(xì)胞活力；（b）連翹不同部位提取液對(duì)NO含量的影響；（c）連翹不同部位提取液對(duì)TNF-α含量的影響。相比于對(duì)照組，### P ＜0.001，## P ＜0.01；相比于LPS組，*** P ＜ 0.001，** P ＜ 0.01。NS為無差異Fig.7 Anti-inflammatory activity evaluation of extracts from different parts of Forsythia suspensa(a) Cell viability was detected by CCK-8 method; (b) Effects of extracts from different parts of Forsythia suspensa on NO content; (c) Effects of extracts from different parts of Forsythia suspensa on TNF-α content in LPS-induced inflammatory model.### P < 0.001, ## P <0.01 vs.the control group, *** P < 0.001 and **P < 0.01 vs.LPS group.NS means no significant difference

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助低共熔溶劑提取連翹不同部位總黃酮，并研究了其抗炎抗氧化活性。提取條件為液固比15 mL/g，提取功率200 W，提取溫度60 ℃，時(shí)間1 h。通過含量測定得出，同種溶劑中總黃酮含量順序大致為：連翹葉 ＞ 連翹果 ＞ 連翹花；不同溶劑中連翹葉總黃酮提取率順序?yàn)椋篋ES-3 ＞ DES-4 ＞＞DES-1 ＞ DES-7 ＞ DES-6 ＞＞ 60% 乙醇 ＞DES-2 ＞ DES-5 ＞ 水。篩選出最優(yōu)提取溶劑為DES-3，即氯化膽堿（Cholinechloride，ChCl）∶丙三醇＝1∶1。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)超聲波輔助DES-3 提取對(duì)連翹不同部位均有較好的破壁效果，其中，對(duì)連翹葉的破損程度最大，連翹果次之，連翹花的破損程度較差。化學(xué)水平上分別用DPPH·法和FRAP 法測定連翹不同部位DES-3 提取液的抗氧化活性，結(jié)果顯示，連翹葉的抗氧化活性大于連翹果，連翹花的抗氧化活性最弱。用LPS 和H2O2分別建立RAW264.7 細(xì)胞炎癥和氧化損傷模型，CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示連翹不同部位DES-3 提取液具有增強(qiáng)細(xì)胞活力的作用。用NO 和TNF-α 試劑盒分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中NO 和TNF-α 含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連翹不同部位DES-3 提取液均降低了NO 和TNF-α 含量，且提取液中的總黃酮含量越高，抗炎活性越強(qiáng)，即連翹葉的抗炎活性大于連翹果，連翹花的抗炎活性較低。用MDA 和SOD 試劑盒檢測細(xì)胞中MDA 含量和SOD 活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連翹不同部位提取液降低了MDA 含量，提高了SOD 的活力，且提取液中總黃酮含量越高，抗氧化活性越強(qiáng)，即連翹葉的抗氧化活性大于連翹果，連翹花的抗氧化活性較弱。綜上所述，基于超聲波輔助低共熔溶劑提取的連翹不同部位總黃酮具有一定的抗炎和抗氧化活性，且總黃酮含量越高，抗炎和抗氧化活性越強(qiáng)。