微波法合成的ZnS/RGO納米材料對核黃素的電化學(xué)檢測

馬榕，張文坤，喬雅雪，范琪，李寧波，2*，喬潔，2*

（1.山西醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室，山西 太原 030001；3.山西醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)系，山西 太原 030001）

0 引言

核黃素（Riboflavin，RF）是人體正常代謝活動所必需的水溶性維生素之一，俗稱維生素B2，在人體正常的生命活動中起著至關(guān)重要的作用。它不僅能夠調(diào)節(jié)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，如：碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為生化反應(yīng)所需的直接能源ATP（腺嘌呤核苷三磷酸），還可以促進(jìn)黃素單核苷酸 （Flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）這兩種黃素輔酶的形成，并且這兩種輔酶是組織呼吸所必需的［1-3］。當(dāng)人體內(nèi)缺乏核黃素時會導(dǎo)致皮膚瘙癢、眼睛灼燒、口腔和舌頭疼痛，嚴(yán)重的會誘發(fā)癌癥和腫瘤［4］。因此，研制快速、準(zhǔn)確、方便、靈敏的檢測核黃素的方法尤為重要。目前，檢測核黃素方法有液相色譜法［5］、分光光度計(jì)法［6］、毛細(xì)管電泳法［7］和熒光法［8］等。然而，這些方法存在耗時長、測試過程復(fù)雜、儀器昂貴等不足。相比以上方法，電化學(xué)方法具有簡單、低成本、快速響應(yīng)和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，是可依賴且具有發(fā)展前景的檢測技術(shù)。

為了提高核黃素檢測的靈敏度，研究者合成了多種電極修飾材料，有聚合物、貴金屬和金屬氧化物等。Derakhshan 等［9］合成氧化石墨烯、金納米粒子、乙烯基磺酸鈉鹽和甲基咪唑離子液體聚合物的納米復(fù)合材料（GO/Au/poly-EAmVS）用于核黃素的檢測；Sumathi 等［10］合成α-Fe2O3、多壁碳納米管和金納米粒子復(fù)合材料（α-Fe2O3/MWCNT/AuNPs）修飾玻碳電極，實(shí)現(xiàn)核黃素的檢測。但是上述材料大多需要使用改性劑，合成過程繁瑣，合成成本比較高。ZnS作為一種重要的半導(dǎo)體材料，廉價易得，而且具有良好的生物相容性，化學(xué)穩(wěn)定性和光電化學(xué)性質(zhì)［11］。Vinoth 等［12］以超聲法合成了包覆在還原氧化石墨烯上的硫化鋅微球 （Zn-SNPs@RGO）并成功應(yīng)用于咖啡酸的電化學(xué)檢測，展現(xiàn)了ZnS 對酚類物質(zhì)的催化能力。另外，石墨烯材料具有優(yōu)良的導(dǎo)電性和高比表面積，其表面可以負(fù)載更多納米粒子，其組成和結(jié)構(gòu)具有促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移的作用，可以有效地提高電化學(xué)傳感器的導(dǎo)電性和靈敏度［13-14］，是一種理想的電化學(xué)敏感材料。因此，本研究結(jié)合石墨烯和ZnS 的優(yōu)良特性，通過簡單、綠色的微波法一步合成了ZnS/RGO 復(fù)合材料。該合成方法不僅避免了繁瑣的反應(yīng)過程、高溫及有毒還原劑的使用，而且ZnS 納米材料有效地改善了石墨烯在還原過程中的團(tuán)聚，提升了復(fù)合材料的導(dǎo)電性和催化性能，充分發(fā)揮出復(fù)合材料的協(xié)同作用。該復(fù)合材料構(gòu)建的電化學(xué)傳感器，對核黃素表現(xiàn)出較高的催化能力，實(shí)現(xiàn)了對核黃素的靈敏檢測，并成功應(yīng)用于牛奶和血清樣品中核黃素的檢測，如圖1 所示。

圖1 電化學(xué)傳感器構(gòu)建用于檢測核黃素的示意圖Fig.1 Schematic diagram of electrochemical sensor construction for detection of Riboflavin

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

JEM-2100 型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社），BRUKER INVENIOS 傅里葉變換紅外光譜儀（Bruker OPTIC China service team），UH-5300 紫外分光光度計(jì)（日本Hitachi 公司），D8-X射線衍射儀（Bruker OPTIC China service team），Renishaw inVia 激光拉曼光譜儀（Renishaw 公司），G70D20CN1P-D2 微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司），KQ-50DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SCIENTA-10N 鐘罩式冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），VCX150 細(xì)胞破碎儀（SONICS& MATERIALS INC），CHI660E 工作站（上海辰華），玻碳電極GCE（Φ=3 mm）作為工作電極，Ag/AgCl 為參比電極，鉑絲為對電極。

核黃素、乙酸鋅、葉酸、葡萄糖、抗壞血酸、L-賴氨酸（阿拉丁試劑有限公司）；無水氯化鈣、氯化鈉（南京化學(xué)試劑有限公司）；硫脲（薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；石墨薄片（Alfa Aesar）。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（電阻率達(dá)到18.2 MΩ·cm）。

1.2 ZnS/RGO的制備

首先，采用改進(jìn)的Hummers 方法［15］合成氧化石墨，再利用超聲剝離法制備氧化石墨烯（GO）。利用微波法制備ZnS/RGO 納米材料，具體步驟如下：分別稱取0.658 5 g Zn（Ac）·2H2O、0.266 4 g 硫脲與0.100 0 g 氧化石墨烯，加入50.0 mL 超純水，在室溫下磁力攪拌2 h，得到均一溶液。用量筒準(zhǔn)確量取5.0 mL 上述溶液并轉(zhuǎn)移至坩堝中，在700 W 的微波爐中加熱30 min。待產(chǎn)物冷卻到室溫后，以8000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心收集產(chǎn)物，用乙醇和超純水分別洗滌三次，冷凍干燥，得到黑色產(chǎn)品為ZnS/RGO，取一定量超聲分散在超純水中，得到濃度為1 mg/mL 的水溶液，貯存于4 °C 冰箱備用。在相同條件下分別合成ZnS 和RGO（注：合成ZnS 的時候不加入GO；合成RGO 不加入乙酸鋅和硫脲）。

1.3 ZnS/RGO/GCE傳感器的構(gòu)建

為使玻碳電極能夠達(dá)到最佳修飾效果，需打磨處理，在超純水中超聲清洗，自然晾干。用移液槍移取5 μL ZnS/RGO（1 mg/mL）滴涂在電極表面，室溫干燥后，再重復(fù)滴加5 μL 修飾材料，干燥備用。

1.4 核黃素的測定

制備好的修飾電極室溫下分別浸入含有不同濃度（從低到高）核黃素的磷酸緩沖溶液（PBS，0.1 mol·L-1，pH=6.0）中，用差分脈沖伏安法（DPV）記錄對應(yīng)峰電流的強(qiáng)弱，DPV 參數(shù)設(shè)置：振幅 50 mV，脈沖寬度 0.050 s，掃描電位窗口-0.6 ～ -0.1 V，掃描速度50 mV/ s。

1.5 實(shí)際樣品處理

選擇牛奶和血清為實(shí)際樣品，通過加標(biāo)回收法測定核黃素。牛奶購自伊利，血清來自實(shí)驗(yàn)室健康的志愿者。檢測前需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理：先用0.22 μm 的濾膜過濾除去雜質(zhì)，以轉(zhuǎn)速8000 r/min 離心（牛奶離心10 min，血清離心30 min），取上清液做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。用PBS（0.1 mol·L-1，pH=6.0）為稀釋劑，將上清液稀釋50 倍。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZnS/RGO的表征

如圖2（A）的紫外-可見吸收光譜所示，ZnS（a）在波長300 nm 左右表現(xiàn)出典型的吸收峰，GO （d）在230 nm 左右表現(xiàn)出最大吸收，在302 nm 處出的肩峰對應(yīng)于GO 中芳香族C=C鍵的π-π*躍遷和C=O 鍵的n-π*躍遷。通過微波法將GO 還原后，RGO（b）在230 nm 的吸收峰紅移至258 nm，肩峰消失不見，說明GO 被還原［16］。復(fù)合物 ZnS/RGO（c）除顯示出ZnS 的紫外特征峰，在200 nm ～ 400 nm 范圍內(nèi)的紫外吸收強(qiáng)度增強(qiáng)［17］。

圖2 （A） 紫外-可見吸收光譜；（B） 紅外光譜圖ZnS （a），RGO （b），ZnS/RGO （c），GO （d）Fig.2 UV-vis absorption (A) and IR spectrum (B) of ZnS (a), RGO (b), ZnS/RGO (c), GO (d)

如圖2（B）紅外譜圖所示，ZnS（a）在472 cm-1和668 cm-1處出現(xiàn)了特征峰，對應(yīng)Zn-S 鍵的振動峰［18］，3300 cm-1和1500 cm-1左右的峰為-OH 的伸縮振動峰。GO（d）出現(xiàn)在 1725、1624、1394、1044 cm-1處的吸收峰［19］，分別對應(yīng)羧基（-COOH）、羰基（C=O 鍵）、酚羥基（C-O-H）和環(huán)氧基團(tuán)（C-O-C）的振動峰，3406 cm-1處寬且深的峰為-OH 的振動峰。通過RGO（b）和ZnS/RGO（c）可以明顯看出，在經(jīng)過微波還原之后，GO 中所有含氧基團(tuán)的吸收峰均有不同程度的減小，說明GO 已被還原。圖3（A）為拉曼圖，其中，ZnS/RGO 復(fù)合物的ID/IG值高于GO、RGO，說明復(fù)合物比RGO 有更多的缺陷位點(diǎn)，也進(jìn)一步證實(shí)了RGO 的還原。

圖3 （A） 拉曼光譜GO （a），RGO （b），ZnS/RGO （c）；（B） XRD譜圖：ZnS/RGOFig.3 Raman spectrum (A) of GO (a), RGO (b), ZnS/RGO (c) and XRD spectrum (B) of ZnS/RGO

為研究復(fù)合材料晶體結(jié)構(gòu)，對ZnS/RGO 樣品進(jìn)行了XRD 分析。如圖3（B）所示，主要衍射峰28.71（111）、48.68（220）、57.12（311）與閃鋅礦結(jié)構(gòu)的ZnS 晶面特征峰吻合［20］，證實(shí)材料中含有ZnS。

進(jìn)一步通過透射電鏡圖（TEM）表征石墨烯復(fù)合物的形貌。如圖4 所示，均可以觀察到石墨烯常見的褶皺結(jié)構(gòu)，圖4（a）中不規(guī)則的ZnS 納米粒子附著在石墨烯上，相比RGO（c），ZnS 也可以降低石墨烯片層的團(tuán)聚。

圖4 透射電鏡圖ZnS/RGO （a），GO （b），RGO （c）Fig.4 TEM of ZnS/RGO (a), GO (b), RGO (c)

2.2 ZnS/RGO修飾電極對核黃素的電化學(xué)響應(yīng)

為探究ZnS/RGO 復(fù)合材料對核黃素的電催化增強(qiáng)效應(yīng)，分別考察了裸電極（GCE）、RGO修飾玻碳電極（RGO/GCE）、ZnS 修飾玻碳電極（ZnS/GCE）、ZnS/RGO 修飾玻碳電極（ZnS/RGO/GCE）在PBS（pH=6.0）和含RF 的PBS 溶液（1 mmol·L-1，pH=6.0）中的循環(huán)伏安（Cyclic voltammetry，CV）行為。圖5 可以看出，ZnS/RGO/GCE 對RF 的電流響應(yīng)最大，證實(shí)了ZnS/RGO/GCE 具有優(yōu)良的電催化性能和導(dǎo)電性能，同時表現(xiàn)出RGO 和ZnS 的協(xié)同作用。

圖5 不同修飾電極在（a）無核黃素（b）有核黃素存在下的CV圖Fig.5 CVs of different modified electrode in the absence (a) and presence of RF (b)

2.3 核黃素檢測條件的優(yōu)化

研究材料滴涂量、溶液pH 及掃描速度對RF 在ZnS/RGO/GCE 上響應(yīng)電流的影響。首先考察1 mg/mL ZnS/RGO 水溶液在玻碳電極上滴涂量的影響，圖6（a）中當(dāng)?shù)瓮苛坑? μL增加到10 μL 時，電極在核黃素溶液中的響應(yīng)電流逐漸增大，當(dāng)用量超過10 μL 時，電流反而下降?？赡芤?yàn)殡姌O表面的修飾膜太厚，阻礙了電極表面的電子轉(zhuǎn)移。因此，選擇10 μL 為最佳修飾量。接著對待測物的pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）進(jìn)行優(yōu)化。如圖6（b）所示，隨著pH 值的增加，RF 的峰電位值逐漸負(fù)移，此現(xiàn)象表明在RF 的催化氧化過程中有氫離子的參與。在內(nèi)插圖中可以看出當(dāng)pH=6.0 時，RF 響應(yīng)電流達(dá)到最高值，故pH=6.0 選為最優(yōu)值。最后，測定修飾電極在不同掃描速度下的CV曲線。圖6（c）所示，在10～100 mV·s-1內(nèi)，RF 的氧化還原峰電流峰隨著掃速的增加而漸漸增大，且氧化峰電位正向移動，還原峰電位負(fù)向移動。圖6d 為氧化峰（Ipa）、還原峰（Ipc）分別對掃描速度平方根（v1/2）擬合，得出Ipa=0.886 02v1/2+2.006 24、Ipc= -0.607 60v1/2-6.396 93?？膳袛喑鯮F 在ZnS/RGO/GCE 上的電化學(xué)行為是由擴(kuò)散過程控制的。

圖6 （a） 材料滴涂量； （b）溶液pH；（c）掃描速度對核黃素響應(yīng)電流的影響；（d） Ipa和Ipc與v1/2的線性擬合圖Fig.6 Effect of drop-coating volume (a); pH values of solution (b); scan rate (c) on the current of RF; the calibration plots of peak current vs square root of scan rates (d)

2.4 電化學(xué)傳感器對核黃素的線性檢測

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，采用DPV 法對不同濃度的核黃素進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，在0.3～1 μmol·L-1和1～80 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，核黃素的峰電流與濃度之間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，如圖7A，其相應(yīng)的回歸方程為：y=0.875 387C-0.215 19（R2=0.992 3，圖7（b））和y=0.111 601C+0.838 596（R2=0.996 9，圖7（c））。最低檢測限（LOD）為0.029 μmol·L-1（S/N=3）。與已報道的電化學(xué)傳感器相比，本傳感器對核黃素的檢測在線性范圍、靈敏度以及檢測限方面具有較大優(yōu)勢（見表1），其優(yōu)良的傳感性能來源于石墨烯良好的導(dǎo)電性和ZnS 的催化作用。兩種材料之間的協(xié)同作用使得電極表面的電子移動空間和活性位點(diǎn)增大增多。

表1 測定RF的電化學(xué)方法對比Table 1 Comparison of this method with the other electrochemical methods for determination of RF

圖7 （a） ZnS/RGO/GCE在不同濃度的核黃素溶液中DPV圖；（b） 0.3 μmol·L-1～1 μmol·L-1；（c） 1 μmol·L-1～80 μmol·L-1的核黃素與電流的線性擬合圖Fig.7 (a) DPV of ZnS/RGO/GCE in PBS solution containing different RF; Calibration curves of peak current vs RF concentration for (b) 0.3-1 μmol·L-1 and (c) 1-80 μmol·L-1

2.5 電化學(xué)傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性

為評估ZnS/RGO/GCE 的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，將修飾好的電極在1 mmol·L-1核黃素溶液中進(jìn)行CV 掃描，10 次循環(huán)測試之后，發(fā)現(xiàn)對于核黃素的響應(yīng)電流仍能保持首次測定時還原峰電流值的97.85% （圖8（a）），10 次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為5.77%。此外，平行修飾五支玻碳電極，對同一溶液進(jìn)行CV 測定。如圖8（b）所示，RSD 為1.83%。說明該材料具有優(yōu)異的重現(xiàn)性。在4 °C 下，將ZnS/RGO/GCE 存放10 d 后對核黃素進(jìn)行測定，其電流信號仍保持原始電流的96.05%，僅下降了3.95%，說明該材料具有良好的穩(wěn)定性 （圖8（c））。最后，考察在實(shí)際檢測中可能對核黃素測定存在影響的生物分子及無機(jī)離子，如：NaCl、GaCl2、Glu、FA、Lys、Vc 等。在含有1 mmol·L-1核黃素的溶液中分別添加同濃度的干擾物進(jìn)行DPV 測試，結(jié)果如圖 8（d），除GaCl2產(chǎn)生7.25%的信號變化，其余干擾物對于核黃素的信號改變值均小于4%，表明該傳感器具有優(yōu)良的選擇性。

圖8 ZnS/RGO/GCE的重現(xiàn)性（a）和（b）穩(wěn)定性（c）和選擇性（d）的研究Fig.8 Reproducibility (a) and (b); Stability (c) and selectivity (d) of ZnS/RGO/GCE

2.6 實(shí)際樣品檢測

采用加標(biāo)回收法對牛奶和血清中樣本中的核黃素進(jìn)行測定。結(jié)果如表2 所示，選取一定濃度的加標(biāo)樣品，每組平行測定3 次，核黃素的回收率在95.40% ～105.73%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.06%～10.69%，此方法可用于牛奶和血清中RF 的檢測（表中測定結(jié)果均為平均值）。

表2 牛奶和血清中核黃素的測定結(jié)果Table 2 Determination results of RF in milk and serum

3 結(jié)論

通過簡單綠色的微波法合成ZnS/RGO 復(fù)合材料，該材料結(jié)合了ZnS 和RGO 的優(yōu)良特性，展現(xiàn)出協(xié)同作用，對核黃素有較高的催化能力。根據(jù)這一事實(shí)，成功構(gòu)建了綠色實(shí)用的用于檢測核黃素的電化學(xué)傳感器。最終選擇修飾量10 μL，1 mg/mL 的ZnS/RGO，待測物溶劑為pH=6.0 的0.1 mol·L-1的PBS 緩沖溶液為最優(yōu)檢測條件，傳感器在0.3 μmol·L-1～ 1 mol·L-1和1 μmol·L-1～80 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，分別呈現(xiàn)出良好線性關(guān)系，檢出限為0.029 μmol·L-1。并用于牛奶和血清樣品中核黃素的檢測，回收率在95.40%～105.73% 之間，表明ZnS/RGO/GCE 有望成為一種檢測核黃素的新方法。