基因2型鵝星狀病毒EvaGreen熒光定量一步法RT-PCR的建立與應(yīng)用

趙 磊, 劉廷惠, 楊貝奇, 張留君, 劉欣超, 張訓(xùn)海

(安徽科技學(xué)院 家禽疫病防控監(jiān)測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽(yáng) 233100)

鵝星狀病毒(Goose astrovirus,GoAstV)屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬,是一類無(wú)囊膜的單股正鏈RNA病毒,其基因組全長(zhǎng)7.1～7.4 kbp,包含3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF1a、ORF1b和ORF2),ORF2基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白以包裹核酸形成病毒衣殼,是GoAstV的基因分型依據(jù)[1-2]。GoAstV分為2種基因型(GoAstV-1和GoAstV-2),二者的衣殼蛋白氨基酸序列同源性僅為40.4%～41.7%。GoAstV-1型是以導(dǎo)致鵝腸炎的FLX株為代表株的經(jīng)典型鵝星狀病毒[3]。GoAstV-2型是近年來(lái)引發(fā)雛鵝以痛風(fēng)為主要病癥的新型鵝星狀病毒,其主要侵害4～20日齡的雛鵝,發(fā)病率可達(dá)80%,死亡率可達(dá)50%,病鵝因腎功能障礙導(dǎo)致內(nèi)臟、關(guān)節(jié)、肌肉等部位發(fā)生嚴(yán)重白色尿酸鹽沉積,耐過(guò)鵝易繼發(fā)細(xì)菌感染,后期生長(zhǎng)緩慢,料肉比升高,出欄合格率顯著降低[4-6]。另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)GoAstV-2感染番鴨、櫻桃谷鴨、雞并造成痛風(fēng)癥狀[7-9],表明它已具備跨越物種屏障的能力,成為我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)面臨的重要疫病之一。

傳統(tǒng)RT-PCR方法屬于終點(diǎn)法,只能對(duì)病毒感染定性,不能定量,靈敏度也較低,而具備簡(jiǎn)便、快速、高通量、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)的熒光定量RT-PCR方法被廣泛用于RNA病毒的定性與定量檢測(cè)。邱思語(yǔ)等[10]和白彩霞等[11]分別應(yīng)用SYBR Green I染料法建立了檢測(cè)GoAstV-2熒光定量RT-PCR方法,Wan等[12]、Yin等[13]和Yuan等[14]分別應(yīng)用TaqMan探針?lè)ń⒘藱z測(cè)GoAstV-2熒光定量RT-PCR方法。染料法相比探針?lè)ǔ杀镜?另外在探針?lè)ㄖ?由于RNA病毒易突變,當(dāng)突變位點(diǎn)位于探針區(qū)域時(shí),探針與模板結(jié)合能力下降而易導(dǎo)致假陰性結(jié)果影響其準(zhǔn)確性。EvaGreen、LC Green和Syto9是一類新型飽和熒光染料,對(duì)PCR的抑制性遠(yuǎn)小于不飽和熒光染料SYBR Green I,從而獲得更穩(wěn)定的擴(kuò)增信號(hào),可精確反映目的片段的熔解溫度TM值,適合高分辨率熔解曲線分析和區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物的特異性[15]。目前,未見(jiàn)采用飽和熒光染料法對(duì)GoAstV-2進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道,本研究以O(shè)RF2基因序列為靶標(biāo),建立以EvaGreen為染料的熒光定量一步法RT-PCR檢測(cè)GoAstV-2方法,為禽類GoAstV-2感染的快速鑒別診斷和凈化檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要材料

新城疫病毒活疫苗(NDV)購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司;H5型禽流感病毒血凝抗原(AIV-H5)購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司;雞呼腸孤病毒活疫苗(ARV)和番鴨細(xì)小病毒活疫苗(MDPV)購(gòu)自廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司;番鴨呼腸孤病毒活疫苗(MDRV)購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司;鵝坦布蘇病毒(TMUV)、鵝呼腸孤病毒(GRV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、鵝細(xì)小病毒(GPV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)和GoAstV-2 AHDY2020株均為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自賽默飛世爾科技公司;20×EvaGreen飽和熒光染料購(gòu)自BioTium公司;HiScript?III U+One Step qRT-PCR Probe Kit和Vazyme?Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、Taq DNA聚合酶、dNTP、10×Taq Buffer、DNA Marker、pMD18-T載體均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的禽星狀病毒全基因組序列,應(yīng)用MAGE6.0多序列比對(duì)軟件分析GoAstV-2型毒株ORF2特異性區(qū)域,用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)GoAstV-2引物,F：5’-TTTCAGACGCCCAGATAGACAGC-3’,R：5’-CCAAACACCAGGAATGAGCACG-3’,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為262 bp,引物由南京金斯瑞生物公司合成。

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

取含GoAstV-2 AHDY2020株的鵝胚尿囊液,按MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA,并按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)用Oligo(dT)引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用GoAstV-2引物F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系：1 μL 10×rTaq buffer、1 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.8 μL 5 U/μL rTaq DNA聚合酶、10 μmol/L上下游引物各1 μL、1 μL模板cDNA,用ddH2O補(bǔ)足10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性3 s、65 ℃退火兼延伸8 s,循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后,對(duì)目的片段進(jìn)行切膠和DNA膠回收,再連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)大腸桿菌,PCR鑒定陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行搖菌增殖,提取重組質(zhì)粒并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。用NanoDrop One超微量核酸測(cè)定儀測(cè)定重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為8.4 ng/μL,根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式換算成重組質(zhì)?？截悢?shù)為2.58×109copies/μL。

1.4 熒光定量一步法RT-PCR反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化

用GoAstV-2 AHDY2020株鵝胚尿囊液提取的RNA(10 ng/μL)為模板,應(yīng)用HiScript?III U+One Step qRT-PCR Probe Kit試劑盒進(jìn)行熒光定量一步法測(cè)定,在ABI QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上選擇“FAST”升降溫模式進(jìn)行,反應(yīng)體系為20 μL：4 μL 5×One Step U+Mix、1 μL One Step U+Enzyme Mix、1 μL 20× EvaGreen、1 μL RNA模板,F/R引物濃度篩選分別為0.3、0.5、0.7、0.9 μmol/L,用RNase-free ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃逆轉(zhuǎn)錄5 min,95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s、退火延伸溫度篩選分別以60、61、62、63、64、65 ℃維持20 s,循環(huán)40次,熔解曲線：從60 ℃以0.15 ℃/s上升至95 ℃。根據(jù)擴(kuò)增曲線最小CT值確定最佳反應(yīng)參數(shù)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線的建立

將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋(2.58×101～2.58×107copies/μL)作為模板,用優(yōu)化后的熒光定量一步法RT-PCR檢測(cè),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)樣品有典型的擴(kuò)增曲線、CT值<40、熔解曲線TM值在(85.5±0.5) ℃,3個(gè)條件同時(shí)滿足時(shí),判為陽(yáng)性,否則均判為陰性。

1.6 敏感性檢測(cè)

將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋成2.58×100～2.58×107copies/μL共8個(gè)稀釋度作為模板,用優(yōu)化建立的熒光定量一步法RT-PCR檢測(cè),確定該方法的拷貝數(shù)最低檢測(cè)限。

1.7 特異性檢測(cè)

用VNP-32P型全自動(dòng)核酸提取儀及Vazyme?Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0試劑盒提取實(shí)驗(yàn)室保存的GoAstV-2、NDV、AIV-H5、ARV、TMUV、GRV、MDRV、IBDV、GPV、MDPV和FAdV-4的DNA/RNA,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(H2O),用建立的熒光定量一步法RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)該方法的特異性。

1.8 重復(fù)性檢測(cè)

以10倍系列稀釋的2.58×103～2.58×106copies/μL共4個(gè)稀釋度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,分別進(jìn)行同一次模板設(shè)3個(gè)重復(fù)的批內(nèi)試驗(yàn)和同一試驗(yàn)條件下3個(gè)不同時(shí)間段的批間試驗(yàn),計(jì)算模板CT值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.9 臨床組織樣品檢測(cè)

采集臨床GoAstV-2感染病死鵝的腺胃、腦、腎臟、小腸、胰腺、脾臟、心臟、肺臟、肝臟和腿肌組織各3份,經(jīng)組織勻漿后,于10 000 r/min離心5 min,取200 μL上清液,用Vazyme?Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0試劑盒提取各組織病料中DNA/RNA,用建立的熒光定量一步法RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。收集臨床送檢病死鵝的組織樣品共32份,勻漿后用上述試劑盒提取病毒核酸,用建立的熒光定量一步法RT-PCR進(jìn)行檢測(cè),將檢測(cè)陽(yáng)性樣品按常規(guī)RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定

用GoAstV-2引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,顯示擴(kuò)增產(chǎn)物為262 bp條帶(圖1),與預(yù)期大小一致。

圖1 GoAstV-2 AHDY2020株二溫式PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of two-temperature PCR for detection of GoAstV-2 AHDY2020 strain注：M為DL2000;1為GoAstV-2 AHDY2020株擴(kuò)增結(jié)果;2為陰性對(duì)照。

2.2 熒光定量一步法RT-PCR方法反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)優(yōu)化確定的GoAstV-2 EvaGreen熒光定量一步法RT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：4 μL 5×One Step U+Mix、1 μL One Step U+Enzyme Mix、1 μL 20× EvaGreen、0.3 μmol/L F/R引物,1 μL RNA模板,用RNase-free ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃逆轉(zhuǎn)錄5 min,95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s、65 ℃退火延伸20 s,循環(huán)40次,最后進(jìn)行熔解曲線分析程序。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線的建立

以優(yōu)化建立的GoAstV-2 EvaGreen熒光定量一步法RT-PCR對(duì)2.58×101～2.58×107copies/μL重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè),繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線CT值與質(zhì)粒含量線性關(guān)系良好,其回歸方程為Y=-3.413X+40.462,相關(guān)系數(shù)R2=0.995,擴(kuò)增效率為96.3%(圖2)。熔解曲線分析顯示,其TM值在(85.5±0.5) ℃時(shí)出現(xiàn)特異性單峰(圖3)。

圖2 熒光定量一步法RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of the one-step qRT-PCR

圖3 熒光定量一步法RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線Fig.3 Melting curve of the one-step qRT-PCR

2.4 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用GoAstV-2 EvaGreen熒光定量一步法RT-PCR對(duì)2.58×100～2.58×107copies/μL重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果顯示,該方法的拷貝數(shù)最低檢測(cè)限為25.8 copies/μL(圖4)。

圖4 熒光定量一步法RT-PCR靈敏度試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of the one-step qRT-PCR注：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度(1～8分別為2.58×107～2.58×100 copies/μL)。

2.5 特異性檢測(cè)結(jié)果

以提取的GoAstV-2、NDV、AIV-H5、ARV、TMUV、GRV、MDRV、IBDV、GPV、MDPV和FAdV-4等11種病原核酸為模板,用所建立的方法對(duì)其檢測(cè)結(jié)果顯示,僅GoAstV-2被檢測(cè)為陽(yáng)性,其它病原均為陰性,其中NDV、AIV-H5、TMUV、MDRV、IBDV、GPV、MDPV和FAdV-4在35次循環(huán)后出現(xiàn)較低的非特異性擴(kuò)增熒光信號(hào),但熔解曲線TM值均不在(85.5±0.5) ℃,均判為陰性(圖5～6)。

圖5 熒光定量一步法RT-PCR特異性試驗(yàn)Fig.5 Specificity test of the one-step qRT-PCR注：1～12分別為GoAstV-2、NDV、AIV-H5、ARV、TMUV、GRV、MDRV、IBDV、GPV、MDPV、FAdV-4和水。下同。

圖6 熒光定量一步法RT-PCR特異性試驗(yàn)熔解曲線Fig.6 Melting curve of specificity test of the one-step qRT-PCR

2.6 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和組間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1),組內(nèi)變異系數(shù)為0.47%～1.04%,組間變異系數(shù)為0.71%～1.73%,二者變異系數(shù)均小于2%,表明所建立的方法具有良好的重復(fù)性。

表1 GoAstV-2熒光定量一步法RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Repeatability results of the one-step qRT-PCR for detection of GoAstV-2

2.7 臨床組織樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)感染GoAstV-2病死鵝的10種組織含毒量檢測(cè)顯示(圖7),10種組織均可檢測(cè)出GoAstV-2,其中腎臟含病量最高(2.48×1011copies/g),為脾臟含毒量(4.64×1010copies/g)的5.3倍,為肝臟含毒量(6.33×109copies/g)的39.2倍,腦組織和腿肌含毒量相對(duì)較低(9.87×107和6.32×107copies/g),結(jié)果表明,該方法具有良好的組織檢測(cè)適應(yīng)性,可用于樣品的定量檢測(cè)。對(duì)臨床送檢的32份病死鵝組織樣品檢測(cè)與熔解曲線分析顯示(圖8),9份為GoAstV-2陽(yáng)性,占比為28.1%,其中8份樣品(1～8號(hào))為強(qiáng)陽(yáng)性,1份樣品(9號(hào))為弱陽(yáng)性,陽(yáng)性樣品經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證均為GoAstV-2序列;其余樣品的熔解曲線TM值均不在(85.5±0.5) ℃范圍內(nèi),均為陰性。

圖7 熒光定量一步法RT-PCR檢測(cè)不同組織中病毒RNA拷貝數(shù)Fig.7 Viral RNA copies in different tissues detected by one-step qRT-PCR

圖8 熒光定量一步法RT-PCR檢測(cè)臨床組織樣品的熔解曲線Fig.8 Melting curve of clinical tissues detected by the one-step qRT-PCR注：32份(1～32)送檢的臨床病死鵝組織樣品。

3 結(jié)論與討論

禽星狀病毒感染禽類可引起腸炎、腎炎、肝炎等多種病癥,GoAstV-2為2017年新發(fā)現(xiàn)的引發(fā)雛鵝痛風(fēng)病癥的鵝星狀病毒,GoAstV-2感染給我國(guó)安徽、福建、山東、江蘇、廣東等養(yǎng)鵝主產(chǎn)區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),臨床無(wú)癥狀的種鵝群也存在GoAstV-2感染,并證實(shí)GoAstV-2型SDPY株可通過(guò)鵝胚垂直傳播[16]。GoAstV-2感染鵝胚除了一部分在孵化期間發(fā)生死胚而不能出殼外,還有相當(dāng)一部分是能夠孵化出殼的,進(jìn)而成為攜帶GoAstV-2的病弱雛,健康鵝在孵化出殼后接觸病弱雛的蛋殼、胎糞、鵝體等形成出雛器內(nèi)早期GoAstV-2交叉感染,雛鵝最早可見(jiàn)于4日齡開(kāi)始發(fā)病。當(dāng)感染雛鵝在臨床出現(xiàn)典型痛風(fēng)病癥后,業(yè)已錯(cuò)過(guò)該病的最佳防治期,對(duì)該病的早期鑒別診斷和種源凈化檢測(cè)尤為重要。

目前,針對(duì)GoAstV-2的檢測(cè)方法包括病毒分離、普通RT-PCR、熒光定量RT-PCR(染料法和探針?lè)?、環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等[17-18],其中熒光定量PCR檢測(cè)方法以其快速、高靈敏度、高通量、可定量等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于病原微生物的檢測(cè),配合全自動(dòng)核酸提取設(shè)備,可快速且高通量地處理大量臨床樣本。本研究針對(duì)GoAstV-1和GoAstV-2的ORF2基因差異位點(diǎn),設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增GoAstV-2的高退火溫度引物,以穩(wěn)定性更好的飽和熒光染料EvaGreen和HiScript?III U+One Step qRT-PCR Probe Kit試劑盒優(yōu)化建立檢測(cè)GoAstV-2的熒光定量一步法RT-PCR方法。用構(gòu)建的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)該方法進(jìn)行性能評(píng)估顯示,繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系,熔解曲線呈單一峰,TM值在(85.5±0.5) ℃。熔解曲線TM值是染料法中判定結(jié)果的關(guān)鍵所在,SYBR Green I不飽和染料存在染料重排而不能精確反映雙鏈DNA解鏈的情況,本研究方法應(yīng)用EvaGreen飽和熒光染料不存在染料重排,可有效區(qū)分非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒最低檢測(cè)限為25.8 copies/μL,與已建立的SYBR Green I染料法以及TaqMan探針?lè)`敏度相當(dāng)[10-14]。另外,為防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染水、引物、實(shí)驗(yàn)器材以及形成氣溶膠污染,本研究建立的體系應(yīng)用一步法使逆轉(zhuǎn)錄和qPCR反應(yīng)在一管內(nèi)完成,降低了污染的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)在該體系還引入dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)和熱啟動(dòng)Taq聚合酶,消除了由擴(kuò)增產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn),從而保證檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。

本研究建立的方法對(duì)GoAstV-2感染后病死雛鵝的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦等10種組織樣品均可檢測(cè)到GoAstV-2,其中腎臟的含毒量最高,為脾臟的5.3倍和肝臟的39.2倍,為腦組織的2 500倍和腿肌的3 900倍,提示腎臟為GoAstV-2主要靶器官且各組織器官含毒量有明顯差異。然而,張清水[6]用常規(guī)RT-PCR方法從GoAstV-2感染病死雛鵝8種組織中均檢測(cè)到病毒,由于該方法不能定量檢測(cè),其認(rèn)為病毒對(duì)雛鵝組織有廣泛的侵嗜性。邱思語(yǔ)等[10]應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)8種組織樣品顯示腎、脾和肝含毒量較高,心和大腦含毒量低,與本研究的組織含毒量趨勢(shì)一致。徐蓉等[19]在動(dòng)物回歸試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)未死亡或未出現(xiàn)痛風(fēng)的雛鵝腎臟都表現(xiàn)發(fā)白、腫脹和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),也指示了腎臟為GoAstV-2主要靶器官。本研究方法對(duì)臨床32份送檢的病死鵝組織樣品檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證顯示,9份為GoAstV-2陽(yáng)性,其中9號(hào)樣品為弱陽(yáng)性,而應(yīng)用常規(guī)RT-PCR方法對(duì)9號(hào)樣品直接擴(kuò)增結(jié)果卻為陰性,可見(jiàn)熒光定量RT-PCR方法更適于臨床樣品的準(zhǔn)確檢測(cè)。

綜上,本研究建立的EvaGreen飽和染料一步法qRT-PCR檢測(cè)GoAstV-2方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、防污染等特性,適用于禽類臨床樣品的GoAstV-2感染定量檢測(cè)。