兩種組胺受體拮抗劑對HP-PRRS豬肺臟IL-1、TNF-α的影響

劉芳 歐德淵 萬文華

摘要：高致病性豬藍(lán)耳病發(fā)病率高，傳播速度快，一旦發(fā)病會給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅。撲爾敏作為 H1受體拮抗劑，抗組胺作用持久，具有明顯的中樞抑制作用，西咪替丁是一種可選擇性 H2受體拮抗劑。為了研究這兩種組胺受體拮抗劑對高致病性藍(lán)耳病肺炎中 IL-1和 TNF-a 含量的影響，本研究建立了仔豬實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，測定了不同組別豬只 IL-1和 TNF-a 的含量，結(jié)果表明，陽性組、撲爾敏組和西咪替丁組 HP-PRRS 患豬主要炎性因子 IL-1、TNF-α極顯著高于陰性組，但陽性組、撲爾敏組、西咪替丁組差異不顯著，表明組胺 H1R拮抗劑撲爾敏和組胺 H2R拮抗劑西咪替丁對 HP-PRRS 患豬肺臟主要炎性因子 IL-1、TNF-α無影響，撲爾敏緩解 HP-PRRS 仔豬肺炎與肺臟中 IL-1、 TNF-α無明顯的關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞：高致病性藍(lán)耳病；撲爾敏；西咪替丁；IL-1；TNF-α

以藍(lán)耳病病毒基因組非結(jié)構(gòu)蛋白?Nsp2編碼區(qū)缺少30個氨基酸為特征的豬高致病性藍(lán)耳?。℉ighly pathogenic por? cine reproductive and respiratory syndrome ，HP －PRRS ），傳播速度快，死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

藍(lán)耳病病毒感染豬只后，能刺激產(chǎn)生輔助性、殺傷性 T 細(xì)胞，還可刺激釋放多種單核細(xì)胞因子，如 IL－1、IL －6、 IL －8、TNF －a、IFN－β、IFN－γ等等。其中， 白細(xì)胞介素－1（Interleukin－1， IL －1） 由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成、分泌產(chǎn)生，與相應(yīng)高親和力受體結(jié)合后，可直接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，使豬只發(fā)熱，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞的招募與活化，使血管擴(kuò)張，進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，當(dāng)肺臟損傷或受病原微生物侵襲后，肺泡巨噬細(xì)胞能通過分泌細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等作用，HP －PRRS 自然感染豬血清中的IL－1含量顯著高于正常對照組[1]。腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor ， TNF ）是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀況時(shí)均可刺激 TNF－a 表達(dá)增加。TNF－α是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在炎癥局部組織和血清中表達(dá)水平上升，具有刺激巨噬細(xì)胞，趨化嗜中性粒細(xì)胞等作用[2]。受藍(lán)耳病病毒感染的患豬外周血中的 TNF－a 表達(dá)水平顯著升高[3]，由此可見，HP －PRRS 肺臟 IL－1、TNF－a 的含量能作為判斷患豬肺炎發(fā)生的主要依據(jù)之一。

一、材料

（一） 主要試劑

高致病性藍(lán)耳病病毒為貴州分離株 GZKB 株，由貴州省動物疫病研究室惠贈。豬 IL－1和 TNF－α ELISA 檢測試劑盒，購至大連寶生物公司。

（二） 主要儀器

全自動酶標(biāo)儀（ ELX808）， BioTek Instruments ，Inc。

二、方法

（一） 模型建立

從貴州省貴陽市某養(yǎng)殖戶購買了沒有注射藍(lán)耳病疫苗的30日齡三元雜交公豬，共計(jì)20頭，篩選的體重范圍為8.9～11kg ，隨機(jī)平均分為四個組，每個組5頭，即陰性對照組、陽性對照組、撲爾敏組、西咪替丁組等4個組。其中陽性組、撲爾敏組、西咪替丁組仔豬同一時(shí)間肌肉注射 PRRSV （106TCID50）2mL／頭，撲爾敏組、西咪替丁組于注射病毒前1d 開始，每日相同時(shí)間段分別肌肉注射撲爾敏1.5mL／頭、西咪替丁1.5mL／頭，陰性組為每日同一時(shí)間段肌肉注射生理鹽水2mL／頭。

（二） 肺樣采集與處理

人工感染藍(lán)耳病病毒第10d ， 陰性組體況正常， 陽性組、撲爾敏組、西咪替丁組仔豬有明顯的臨床癥狀，采取頸靜脈放血的方法處死20頭實(shí)驗(yàn)仔豬，取新鮮肺樣立即放于液氮中冷凍固定。稱取固定重量的肺樣，用蒸餾水按相同稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，研磨后離心取上清液測定肺臟 IL－1和TNF－α。

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

按 ELISA 試劑盒說明書操作，建立肺臟 IL－1和 TNF－α標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體步驟如下。

第一， 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋。 IL －1的稀釋濃度依次為：25pg／mL、50 pg／mL、100 pg／mL、200 pg／mL、400 pg／mL； TNF－α稀釋濃度依次為：7.5ng／L 、15 ng／L 、30 ng／L、60 ng／L 、120 ng／L 。第二，加樣。首先設(shè)空白對照孔（空白孔中不加樣品、酶標(biāo)試劑，其他步驟相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔。加標(biāo)準(zhǔn)品樣50μL 于酶標(biāo)包被板上，加樣時(shí)需將樣品加于酶標(biāo)板孔的底部，且加樣時(shí)盡量不觸及孔壁，放于微量振蕩器上輕輕混勻。第三，溫育。采用封板膜封板，并置于37℃下溫育30min 。第四，配液。使用蒸餾水30倍稀釋試劑盒中的30倍濃縮洗滌液，備用。第五，洗滌。輕輕揭去封板膜棄液體，甩干，將洗滌液加滿每孔，靜置30s，棄液體、拍干，重復(fù)5次。第六，加酶。除空白孔外，其余每孔加入50μL 酶標(biāo)試劑。第七，溫育、洗滌。操作分別同第三、第五。第八，顯色。每孔先加50μL 顯色劑A，再加50μL 顯色劑 B，于微量振蕩器上輕輕震蕩混勻， 置于37℃下避光顯色15min。第九，終止。每孔加50μL終止液，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。第十，測定。使用酶標(biāo)儀將空白孔調(diào)零作對照，測量各孔450nm波長下的吸光度（ OD值）。需在加終止液終止反應(yīng)后的15min 內(nèi)測定 OD值。

（四）肺臟樣品檢測

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立成功后，按 ELISA 試劑盒說明書操作，檢測各組仔豬肺臟 IL －1和 TNF－α含量，具體步驟為：首先設(shè)空白對照孔（空白孔中不加樣品、酶標(biāo)試劑，其 他步驟相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。準(zhǔn)確加50μL 標(biāo)準(zhǔn)品樣于酶標(biāo)包被板上，先加40μL 樣品稀釋液于待測樣品孔中，然后加10μL 待測樣品（樣品的稀釋度是5倍）。加樣品于酶標(biāo)板孔底，注意盡量不碰觸孔壁，置于微量振蕩器上輕輕震蕩混勻。余下步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線建立步驟的第三至第十。

（五）結(jié)果判定與數(shù)據(jù)分析

計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與對應(yīng)OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程，將樣品的 OD值代入方程式中，可獲得被測樣品的濃度，乘以樣品的稀釋倍數(shù)后為被測樣品的實(shí)際濃度，最后統(tǒng)計(jì)各組仔豬肺臟IL－1和TNF－α的含量，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

三、結(jié)果

（一） IL－1和 TNF－α標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用酶聯(lián)免疫分析方法，按豬 IL－1和 TNF－αELISA試劑盒說明書操作要求，倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品，用 ELISA法測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品 A450后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1、圖2），得出 IL－1倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)濃度與 A450的關(guān)系公式為 y＝0.0085x－0.0771，相關(guān)系數(shù)為0.9921，TNF－α倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)濃度與 A450的關(guān)系公式為 y＝0.0043x－0.0645，相關(guān)系數(shù)為0.9949，相關(guān)系數(shù)均接近1，公式較可靠。

（二） 各組仔豬肺臟 IL－1含量

結(jié)果如表1所示，人工感染病毒組仔豬肺臟 IL－1極顯著高于陰性組（ P＜0.01），陽性組、撲爾敏組和西咪替丁組之間差異不顯著，三組中，撲爾敏組 IL－1含量最低。

（三）各組仔豬肺臟 TNF－α含量

結(jié)果如表2所示，人工感染病毒組仔豬肺臟 TNF－α極顯著高于陰性組（ P＜0.01），陽性組、撲爾敏組和西咪替丁組之間差異不顯著，這與仔豬肺臟 IL－1含量變化相似，三組中，撲爾敏組 TNF－α含量最高，西咪替丁組 TNF－α含量最低。

四、討論與小結(jié)

（一） 肺炎與 IL－1和 TNF－α表達(dá)的關(guān)系

在細(xì)胞因子研究中，致炎因子主要包括 IL－l及 TNF－α等，在疾病感染早期含量較高，對疾病的發(fā)展程度有指示作用。本研究中，使用組胺受體拮抗劑后測定 IL－1和 TNF－α含量，有助于探索組胺受體拮抗劑對 HP－ PRRS 患豬肺臟炎癥的影響，對防治藍(lán)耳病具有一定意義。

（二） 兩種組胺受體拮抗劑對 HP－PRRS患豬肺臟 IL－1的影響

IL－1是免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的基本要素和致熱原[4]，本實(shí)驗(yàn)中人工感染病毒組仔豬 IL－1異常升高，陽性組、撲爾敏組和西咪替丁組分別增高了2.1倍、1.8倍、2.0倍，極顯著高于陰性組，且陽性組、撲爾敏組、西咪替丁組仔豬均發(fā)生肺炎病變，說明在 HP－ PRRS早期，IL－1介導(dǎo)了肺部炎癥的病理過程，但撲爾敏組、西咪替丁組的 IL－1較陽性組差異不顯著，且實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合開展的仔豬肺臟病理學(xué)評分，撲爾敏組評分最低，說明撲爾敏緩解 HP－PRRS仔豬肺炎與肺臟中 IL－1的分泌和作用無明顯的關(guān)聯(lián)。

（三）兩種組胺受體拮抗劑對 HP－ PRRS 患豬肺臟 TNF－a 的影響

本實(shí)驗(yàn)中人工感染病毒組肺臟 TNF－α含量極顯著高于陰性組，與報(bào)道的肺氣虛性肺氣腫模型組肺組織 TNF－a較陰性組極顯著增高相似[5]，可能是藍(lán)耳病病毒通過刺激肺泡巨噬細(xì)胞釋放 TNF－ a，使肺組織中 TNF－a 的 mRNA表達(dá)水平升高，但正常情況下血液中含 TNF－a 的水平較低，說明 TNF－α介導(dǎo)了 HP－ PRRS仔豬肺炎的病變。但也有資料表明 PRRSV感染初期引起 TNF－a轉(zhuǎn)錄輕微上調(diào)，到感染后期轉(zhuǎn)錄又受到輕微抑制[6]； 體外單獨(dú)感染 PRRSV 后 PAM TNF－a轉(zhuǎn)錄下調(diào)，這些可能與病毒毒株或檢測組織的不同有關(guān)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，過量的炎性因子的表達(dá)與HP－PRRS患豬的肺炎有密切關(guān)系，但實(shí)驗(yàn)中撲爾敏組、西咪替丁組 TNF－α含量較陽性組差異不顯著，表明組胺 H1R拮抗劑撲爾敏和組胺 H2R拮抗劑西咪替丁對炎性因子 TNF－α的釋放無影響，且撲爾敏組仔豬肺臟病理學(xué)評分最低，說明撲爾敏緩解 HP－ PRRS仔豬肺炎與肺臟中 TNF－α無明顯的關(guān)聯(lián)。

（四）小結(jié)

陽性組、撲爾敏組、西敏替丁組 HP－PRRS患豬主要炎性因子 IL－1、TNF－α極顯著高于陰性組，但陽性組、撲爾敏組、西敏替丁組三組之間差異均不顯著，表明組胺 H1R拮抗劑撲爾敏和組胺 H2R拮抗劑西咪替丁對 HP－PRRS患豬肺臟主要炎性因子 IL －1、TNF－α無影響，撲爾敏緩解HP －PRRS 仔豬肺炎與肺臟中 IL －1、TNF－α無明顯的關(guān)聯(lián)。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡介：劉芳（1985-），女，貴州清鎮(zhèn)人，碩士，獸醫(yī)師，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。

（責(zé)任編輯馮會利）