中藥活性成分干預(yù)腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的研究進展

謝 娟，李玉玲，梁 慧，譚慶晶，吳 鵬*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是缺血性腦卒中血流供應(yīng)恢復(fù)后出現(xiàn)的神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)和功能進一步損傷的病理過程［1］。目前阻斷腦卒中向CIRI 進展的治療主要以對癥處理為主［2］，尋找阻斷或治療CIRI的有效藥物是臨床上亟待解決的問題［3］。中醫(yī)學(xué)無“腦缺血再灌注損傷”的病名，按照CIRI 臨床癥候表現(xiàn)，認(rèn)為其屬于缺血性中風(fēng)的范疇，證屬本虛標(biāo)實［4］。急性期以風(fēng)火、痰熱、血瘀等實證為主，多治以平肝潛陽、化痰息風(fēng)、清熱通腑和活血化瘀；恢復(fù)期、后遺癥期則以氣陰兩傷、脾腎虧虛等虛證為主，常治以益氣滋陰、補益脾腎之法［5］。目前，興奮性氨基酸毒性作用、自由基堆積、免疫功能失調(diào)、細胞內(nèi)鈣超載與細胞凋亡等被認(rèn)為是CIRI發(fā)生的重要機制［6］。研究發(fā)現(xiàn)眾多中藥活性成分能夠通過抑制神經(jīng)細胞凋亡拮抗CIRI，故本文就目前該領(lǐng)域的研究進行系統(tǒng)回顧及總結(jié)，以期為該領(lǐng)域的研究人員提供一定的研究思路和方向。

1 腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的發(fā)生機制

細胞凋亡是目前研究較深入的一種程序性細胞死亡方式，對保持正常機體功能具有重要作用［7］。若機體細胞凋亡機制長時間異常，將導(dǎo)致繼發(fā)性壞死和加重免疫應(yīng)激［8］。近期研究表明，腦缺血組織恢復(fù)再灌注期間的神經(jīng)細胞過度凋亡可進一步加劇CIRI 的程度。通過檢索相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，學(xué)者們普遍認(rèn)為細胞凋亡主要由線粒體損傷、外源性死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、興奮性氨基酸（EAA）/氧自由基、鈣超載、炎癥反應(yīng)等引起。

1.1 線粒體損傷 外源性刺激會導(dǎo)致線粒體外膜電位下降，促使細胞色素C（Cyto-C）從線粒體移位至細胞質(zhì)，隨后與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）作用，并促進其寡聚化，使天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-9被活化，隨即激活Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，共同促進細胞凋亡［9-10］。該過程的啟動受B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）家族蛋白調(diào)節(jié)［11］，可分為促凋亡蛋白［細胞內(nèi)Bcl-2 基因相關(guān)啟動子（Bad）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、Bcl-2 拮抗/殺傷因子（Bak）、人BH3 結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白（Bid）和細胞死亡的Bcl-2 相互作用介質(zhì)（Bim）］和抗凋亡蛋白［Bcl-2、額外B淋巴細胞瘤（Bcl-x）、大分子B淋巴細胞瘤（Bcl-xl）和Bcl-2相關(guān)的血管生成素（Bag）］［12-13］，二者共同調(diào)控細胞凋亡。

1.2 外源性死亡受體 該途徑主要通過調(diào)控死亡因子（FasL）與死亡受體（Fas）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤壞死因子受體（TNFR）、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體（TRAIL）、凋亡誘導(dǎo)受體（DR）4 和DR5 來介導(dǎo)細胞凋亡［14］。受體通過Fas 相關(guān)死亡域蛋白（FADD）或TNFR1 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD），與Caspase-8前體組成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），Caspase-8 前體在復(fù)合物中被激活，進而可促使Caspase-3 活化，導(dǎo)致細胞死亡［15］。

1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 當(dāng)機體由于各種因素發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，會通過未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)來應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［16］，該反應(yīng)主要由肌醇需求酶1（IRE1）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）和激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）三者激活。IRE1 與TNF 受體相關(guān)因子2（TRAF2）結(jié)合后，會導(dǎo)致氨基末端激酶（JNK）被激活，活化后的JNK會促進Bad 表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡［17］。PERK 則通過促進真核翻譯起始因子（eIF2α）和激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的轉(zhuǎn)錄翻譯而發(fā)揮作用。在持續(xù)性和高強度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，翻譯后的ATF4 會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白（CHOP）的生成［18］，隨后上調(diào)Bax 和Bak 蛋白的含量，誘導(dǎo)細胞凋亡。

1.4 興奮性氨基酸/氧自由基 EAA 是一種常見的神經(jīng)遞質(zhì)，主要在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中過度表達，包括谷氨酸、天冬氨酸等，可顯著影響神經(jīng)細胞的凋亡［19］。谷氨酸可以引發(fā)快速的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與機體學(xué)習(xí)、記憶以及突觸可塑性調(diào)節(jié)，當(dāng)其表達增加可導(dǎo)致神經(jīng)元鈣平衡的調(diào)節(jié)不良，進一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體損傷、蛋白質(zhì)紊亂和神經(jīng)炎癥反應(yīng)等病理變化。在局灶性腦缺血發(fā)展進程中，EAA 的神經(jīng)毒作用是腦缺血損傷發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)、自由基過度表達等惡性循環(huán)的主要誘發(fā)因素，最終可導(dǎo)致細胞凋亡。

1.5 鈣超載 目前缺血腦組織發(fā)生的鈣超載可導(dǎo)致細胞線粒體過度滲透，從而引起細胞凋亡，被廣泛認(rèn)為是在CIRI 過程中造成損傷的致病機制之一［20-21］。有研究顯示，當(dāng)腦細胞缺血缺氧時，物質(zhì)能量轉(zhuǎn)換下降可引起細胞內(nèi)Ca2+水平失衡、膜去極化，激活其中的Ca2+通道，使得大量細胞外的Ca2+進入細胞內(nèi)，導(dǎo)致細胞凋亡。該過程主要可通過激活胱天蛋白酶、鈣依賴性蛋白酶及核酸內(nèi)切酶而發(fā)生。此外，鈣超載會進一步增加氧自由基釋放并激活各種Ca2+依賴性酶，這些酶可破壞細胞質(zhì)膜并溶解各種蛋白質(zhì)中的肽鍵而使得細胞最終程序性死亡，細胞凋亡過多又進一步導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，造成惡性循環(huán)。

1.6 炎癥反應(yīng) 劇烈的炎癥反應(yīng)可造成炎性級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腦缺血面積擴大、神經(jīng)細胞凋亡發(fā)生及加重［22-23］。參與機體炎癥反應(yīng)的物質(zhì)包括炎癥細胞（如白細胞、小膠質(zhì)細胞等）、炎癥介質(zhì)、TNF-α 及白細胞介素（IL，如IL-1、IL-6 等）。腦缺血發(fā)生后，炎癥細胞大量聚集，釋放炎癥介質(zhì)，而IL-6 是在小膠質(zhì)細胞過度表達后生成的具有多種生物學(xué)活性的細胞因子，能激活更多種類炎癥介質(zhì)，造成腦缺血繼發(fā)性損害，誘導(dǎo)細胞凋亡。TNF-α 是多肽類細胞因子，亦可誘導(dǎo)多種炎癥細胞活化，引發(fā)腦缺血后一系列繼發(fā)性損害，誘導(dǎo)細胞凋亡。

2 中藥活性成分干預(yù)CIRI后細胞凋亡的作用機制

近年來研究發(fā)現(xiàn)［24］，中醫(yī)藥治療CIRI 療效確切，不良反應(yīng)小，對于遏制CIRI的進展具有重要作用。其中，多種中藥活性成分可介導(dǎo)CIRI后細胞凋亡相關(guān)因子的活性，下調(diào)神經(jīng)細胞凋亡率，挖掘中藥活性成分，研制新藥已成為治療CIRI的新策略［25］。

2.1 益氣健脾中藥活性成分 中醫(yī)認(rèn)為，脾主運化，為后天之本。脾虛不能化生水谷精微并布散精微于全身臟腑，可致腦脈運行不利，邪氣乘虛侵入，腦脈痹阻而發(fā)為中風(fēng)，故臨證治療中風(fēng)常運用益氣健脾類中藥。毛蕊異黃酮主要提取自中藥黃芪，具有調(diào)節(jié)免疫、抗癌等活性［26］。張彐寧等［27］通過在大鼠體內(nèi)模擬CIRI環(huán)境，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮可介導(dǎo)Cyt C/Apaf-1 凋亡信號通路，抑制Caspase-9 和Caspase-3 表達，降低神經(jīng)細胞凋亡率，從而改善CIRI。人參皂苷為人參的主要活性成分。劉楠［28］采用人參皂苷干預(yù)CIRI 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細胞內(nèi)Bcl-2 和癌基因（c-Abl）表達均升高，Bax 和Caspase-3 含量降低，證實人參皂苷可減輕CIRI 狀態(tài)下的神經(jīng)元凋亡，以此發(fā)揮治療作用。橄欖苦苷屬于環(huán)烯醚類葡萄糖苷，具有多種生物學(xué)活性［29］。徐祖清等［30］發(fā)現(xiàn)運用從油橄欖葉中提取的橄欖苦苷干預(yù)CIRI 大鼠，可抑制JNK/p38 MAPK 信號通路，降低Caspase-3、Bax mRNA 及蛋白表達，上調(diào)Bcl-2 表達，證實了橄欖苦苷可減輕神經(jīng)元細胞凋亡，對CIRI大鼠具有保護作用。金絲桃苷在金絲桃科、薔薇科、豆科等植物中廣泛存在。江飛飛等［31］研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷能夠抑制TLR4/COX-2信號通路，從而抑制Caspase-3、Caspase-9 以及Bax 蛋白的表達，提高Bcl-2 蛋白含量，下調(diào)神經(jīng)元細胞凋亡率，能起到防治CIRI 的療效。上述研究結(jié)果表明，毛蕊異黃酮、人參皂苷、橄欖苦苷和金絲桃苷等益氣健脾中藥活性成分可通過調(diào)控多種凋亡途徑，抑制神經(jīng)細胞凋亡，從而起到防治CIRI的作用。

2.2 補益肝腎中藥活性成分 肝體失養(yǎng)，腎精不足，水不涵木，肝腎陰虧則肝陽上亢化風(fēng)，發(fā)為中風(fēng)，臨床常應(yīng)用補益肝腎藥物，旨在滋陰潛陽，息風(fēng)通絡(luò)。白芍可養(yǎng)血柔肝，平抑肝陽，其有效成分白芍總苷具有良好的抗炎、抗凋亡等藥理作用。代小蘭等［32］研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可降低神經(jīng)元細胞Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3、TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平，可顯著抑制缺血區(qū)細胞凋亡反應(yīng)，結(jié)果提示白芍總苷可抑制大鼠神經(jīng)細胞凋亡，緩解局部炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮治療CIRI的作用。蒿本內(nèi)酯提取于中藥當(dāng)歸，前期研究已證實蒿本內(nèi)酯對CIRI能起到神經(jīng)保護作用，崔江波等［33］建立CIRI 大鼠模型，運用蒿本內(nèi)酯干預(yù)，結(jié)果證實其可促進PI3K/AKT/mTOR通路信號傳導(dǎo)，降低Bax、caspase3蛋白表達，顯著下調(diào)細胞凋亡率，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。仙茅苷是中藥仙茅的有效活性成分，實驗證實CIRI 大鼠經(jīng)仙茅苷干預(yù)后，腦組織中JAK/STAT1 通路信號傳導(dǎo)中斷，Caspase-3、Caspase-9及Bax 表達下降，Bcl-2 表達明顯增高，提示仙茅苷能抑制細胞凋亡反應(yīng)［34］。淫羊藿次苷Ⅱ是中藥淫羊藿的有效活性成分，具有多種活性效應(yīng)。實驗發(fā)現(xiàn)［35］，淫羊藿次苷Ⅱ可明顯抑制CIRI 大鼠神經(jīng)細胞Bax、Cleaved Caspase 9、IL-1及TNF-α 的表達，增強Bcl-2、p62 蛋白表達，表明淫羊藿次苷Ⅱ能有效下調(diào)神經(jīng)細胞凋亡率，遏制CIRI 進展。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可激活CIRI大鼠腦組織中PI3K/Akt信號通路，下調(diào)神經(jīng)細胞凋亡率，修復(fù)受損神經(jīng)［36］。馬錢苷是中藥山茱萸中的環(huán)烯醚萜苷類化合物。研究表明［37］，馬錢苷可減輕線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，下調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3 表達，減少神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮治療CIRI小鼠的作用。

上述研究結(jié)果表明，白芍總苷、蒿本內(nèi)酯、仙茅苷、淫羊藿次苷Ⅱ、淫羊藿苷和馬錢苷等補益肝腎中藥活性成分，可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達，下調(diào)神經(jīng)細胞凋亡率，改善神經(jīng)損傷，達到治療CIRI的目的。

2.3 息風(fēng)化痰中藥活性成分 中醫(yī)認(rèn)為CIRI 的發(fā)生與經(jīng)絡(luò)瘀阻、氣血逆亂、風(fēng)痰上擾具有密切關(guān)系，故息風(fēng)化痰通絡(luò)是本病的重要治法?！侗静菥V目》載：“天麻乃定風(fēng)草，故為治風(fēng)之神藥?！绷_苑等［38］研究證明天麻醇提物可抑制CIRI 神經(jīng)元細胞Bax 表達，上調(diào)Bcl-2 表達，從而修復(fù)神經(jīng)功能缺損，減輕神經(jīng)元細胞凋亡，最終起到保護神經(jīng)細胞的作用。天麻總酚是中藥天麻的主要有效活性成分，實驗證實［39］天麻總酚可抑制CIRI大鼠腦組織中的MyD88/NF-κB/TNF-α信號通路，降低P62、Bax、TNF-α、MCP-1、IL-1β mRNA 及蛋白表達，下調(diào)神經(jīng)元凋亡率，改善組織炎癥損傷?？梢?，天麻醇和天麻總酚等息風(fēng)通絡(luò)藥物活性成分可通過介導(dǎo)調(diào)亡通路活性、下調(diào)細胞凋亡率來改善腦組織損傷。

2.4 清熱解毒中藥活性成分 中風(fēng)的陽閉證可表現(xiàn)為熱象證候，臨床常治以清熱解毒法。尖葉假龍膽有效成分雛菊葉龍膽酮具有保肝、抗炎、抗氧化、抗腫瘤作用［40］。胡曉陽等［41］通過實驗，發(fā)現(xiàn)CIRI 模型大鼠經(jīng)尖葉假龍膽有效組分乙醇提取物干預(yù)后，Bcl-2 蛋白含量升高，Bax 和Caspase-3含量降低，IL-1、IL-6含量降低，表明其可通過減輕細胞凋亡及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)起到抗CIRI 的作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶兒茶素主要功能成分之一。實驗表明［42］，EGCG 可通過調(diào)控MALAT1/miR-2115-3p 通路，抑制Bax 蛋白水平表達，上調(diào)Bcl-2 蛋白表達，顯著降低神經(jīng)元細胞凋亡率，發(fā)揮治療CIRI的作用。大黃主要有效成分為大黃素，潘峰等［43］研究顯示，大黃素可降低ERK1/2信號通路活性，使Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達受到顯著抑制，Bcl-2 蛋白含量升高，表明大黃素可通過抑制神經(jīng)細胞凋亡發(fā)揮治療CIRI 的作用。以上研究表明，尖葉假龍膽、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和大黃素等清熱解毒中藥活性成分主要通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡，從而改善CIRI。

2.5 活血化瘀中藥活性成分 中醫(yī)認(rèn)為，瘀血日久不去則脈道不通，血不歸經(jīng)則出血不止，采用活血化瘀法治療中風(fēng)可通利血脈，促使氣血運行，腦髓得養(yǎng)。丹皮酚是中藥牡丹皮的主要活性成分。趙輝等［44］通過建立大鼠CIRI 模型，發(fā)現(xiàn)丹皮酚可顯著抑制Bax 蛋白表達，而促進Hsp-70 和Bcl-2 蛋白產(chǎn)生，遏制CIRI 后的神經(jīng)細胞凋亡，從而阻斷病情的進一步發(fā)展。川芎具有活血行氣功效，川芎嗪為無色針狀結(jié)晶，主要提取自川芎。研究證實［45］，川芎嗪可降低CIRI 大鼠NF-κB 信號通路活性，抑制凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3、TNF-α 表達，具有明顯的抗炎、抗凋亡作用。莪術(shù)醇是莪術(shù)的活性成分之一，具有抗炎和抑癌活性作用［46］。研究表明，莪術(shù)醇能夠調(diào)控SIRT1/FoxO1通路，使CIRI 大鼠腦組織Cas 3/Cas 3 蛋白、Cleav Cas 9/Cas 9、丙二醛（MDA）水平降低，而超氧化物岐化酶（SOD）水平顯著升高，從而治療大鼠CIRI［47］。李素萍等［48］研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇可調(diào)節(jié)JNK1通路，降低海馬神經(jīng)細胞凋亡，從而緩解大鼠CIRI損傷。以上研究證實丹皮酚、川芎嗪和莪術(shù)醇等活血化瘀類中藥活性成分可通過調(diào)控促凋亡因子與抗凋亡因子比例，遏制神經(jīng)細胞凋亡，從而阻斷CIRI的進展。

2.6 其他 除上述中藥活性成分之外，自然界還存在多種植物，雖不能歸屬于傳統(tǒng)中藥，但研究發(fā)現(xiàn)其活性成分能有效抑制CIRI 后細胞凋亡。比如木犀草素廣泛存在各種蔬菜中，具有保護心腦血管、免疫調(diào)節(jié)等活性作用。實驗證實，木犀草素可抑制CIRI 大鼠JAK2/STAT3 信號通路活化，降低TNF-α、IL-6、IL-1β、Bax、Caspase-3 含量，提高腦組織Bcl-2 含量，從而減弱組織炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細胞凋亡，起到減輕CIRI 的作用［49］。原花青素可提取自多種植物。研究顯示，CIRI大鼠經(jīng)原花青素處理后，TLR4/NF-κB信號通路受到抑制，SOD、GPX含量降低、Bcl-2蛋白含量升高，表明原花青素可抑制神經(jīng)細胞凋亡，具有緩解CIRI的作用［50］。

可見眾多中藥活性成分可抑制神經(jīng)細胞凋亡，對CIRI 大鼠的神經(jīng)保護具有積極作用，為中醫(yī)藥防治CIRI 提供了豐富的實驗證據(jù)與研究思路。

3 結(jié)論與展望

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展，人類飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生了改變，腦卒中發(fā)病率日益升高且發(fā)病年齡趨于年輕化，該病已成為當(dāng)前衛(wèi)生領(lǐng)域重點關(guān)注的研究方向之一。細胞凋亡是CIRI 疾病發(fā)生和發(fā)展的重要危險因素和CIRI 發(fā)生的主要機制之一，也是遏制CIRI 發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來，中藥活性成分干預(yù)治療CIRI的研究取得了較大進展，主要機制是通過調(diào)控促凋亡因子/抑凋亡因子比例，抑制神經(jīng)細胞凋亡，進而延緩CIRI進展，這在微觀層面上證實了中醫(yī)藥治療CIRI的有效性和科學(xué)性。但中藥活性成分治療CIRI 的相關(guān)研究仍存在一定局限性：一方面，研究通路和靶點的局限性，目前的研究多局限于線粒體凋亡途徑上，尤其集中于對Bcl-2 家族的調(diào)控，研究方向較單一。另一方面，目前該領(lǐng)域的研究主要集中于細胞及動物實驗層面，缺乏大樣本、多中心的臨床對照研究，缺乏更具有說服力的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)?？傊兴幓钚猿煞忠种艭IRI細胞凋亡的研究在近年取得了一定進展，但仍存在一定的局限性，在今后的研究應(yīng)著力于深入闡明相關(guān)中藥成分的作用機制，為中藥防治CIRI提供更為有力的依據(jù)。